Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы - 7 -
Глава 1.1. Зондовые методы исследования различных поверхностей - 7 -
1.1.1 Общий принцип работы зондовых микроскопов - 7 -
1.1.2 Сканирующая зондовая микроскопия как инструмент исследования взаимодействия водорода с поверхностью полупроводников - 8 -
1.1.3 Изучение адсорбции поверхностно-активных веществ с помощью флуоресцентного зонда - 9 -
Глава 1.2. Тритиевая планиграфия макромолекул - 10 -
1.2.1. Общие вопросы метода тритиевой планиграфии - 10 -
1.2.2. Диссоциация водорода на поверхности металла - 12 -
1.2.3. Взаимодействие атомарного водорода с мишенью - 15 -
1.2.4. Применение метода тритиевой планиграфии - 20 -
Выводы из Главы 1.2 - 26 -
Глава 1.3. Исследование молекулярной структуры и поведения молекул на границе жидкость/жидкость - 27 -
1.3.1. Толщина и шероховатость границы раздела жидкость/жидкость - 27 -
1.3.2. Распределение веществ в системе жидкость/жидкость - 30 -
1.3.4. Адсорбция ПАВ на границе раздела жидкость/жидкость - 32 -
1.3.5. Применение радиоактивных индикаторов для исследования поведения веществ на
границах раздела жидкость/газ и жидкость/жидкость - 41 -
Выводы из Главы 1.3 - 44 -
2. Экспериментальная часть - 45 -
2.1. Реактивы и оборудование - 45 -
2.2. Исследование структуры твердых мишеней с помощью атомарного трития - 48 -
2.2.1 Введение тритиевой метки - 48 -
2.2.2 Определение состава газовой фазы - 50 -
2.2.3 Приготовление безводных мишеней индивидуальных веществ - 50 -
2.2.4 Приготовление слоистых мишеней - 51 -
2.2.5 Анализ равномерности нанесения цетиламина на поверхность мишени аминокислоты - 51 -
2.2.6 Особенности работы с водными растворами - 52 -
2.2.7 Измерение радиоактивности - 53 -
2.2.8. Очистка и предварительный анализ меченых препаратов - 54 -
2.2.9 Анализ меченых аминокислот - 56 -
2.2.10. Получение, очистка и анализ меченных тритием гуминовых веществ - 58 -
2.3.1 Особенности получения меченных тритием поверхностно-активных веществ.. - 59 -
2.3.2 Изучение распределения и адсорбции ПАВ в системе жидкость/жидкость с помощью метода сцинтиллирующей фазы (МСФ) - 61 -
2.3.3 Определение эффективности регистрации р-излучения трития - 62 -
2.3.4 Определение поверхностного натяжения на границе раздела жидкость/жидкость с помощью метода висящей капли - 64 -
3. Результаты и их обсуждение - 65 -
Часть 3.1. Атомарный тритий как инструмент исследования поверхности твердых тел- 65 -
3.1.1. Факторы, влияющие на образование меченых веществ - 65 -
3.1.2 Влияние температуры атомизатора на образование меченых веществ - 69 -
3.1.3 Оценка глубины проникновения реакционных атомов трития в различные типы мишеней - 73 -
а) мишени индивидуальных веществ - 73 -
б) мишени индивидуальных веществ, покрытые слоем цетиламина - 77 -
в) адсорбционные слои ПАВ на границе раздела водный раствор-воздух - 84 -
Часть 3.2. Изучение поведения веществ в системе жидкость/жидкость с помощью метода
сцинтиллирующей фазы - 90 -
3.2.1 Принципиальные основы метода сцинтиллирующей фазы - 90 -
3.2.2. Определение коэффициентов распределения КПАВ в системе жидкость/жидкость - 93 -
3.2.3 Исследование аномального поведения неионогенного ПАВ Тритон Х-100 в системе вода/циклогексан - 96 -
3.2.4. Адсорбция ПАВ на границе раздела жидкость/жидкость 103
3.2.5. Влияние неионогенных поверхностно-активных веществ на адсорбцию бромида тетрадецилтриметиламмония в системе вода/п-ксилол - 106 -
Часть 3.3. «Тритиевый зонд» в исследовании структурной организации сложных систем -110-
Выводы - 122 -
Список сокращений - 130 -
Список литературы -131 -
- Сканирующая зондовая микроскопия как инструмент исследования взаимодействия водорода с поверхностью полупроводников
- Толщина и шероховатость границы раздела жидкость/жидкость
- Исследование структуры твердых мишеней с помощью атомарного трития
- Факторы, влияющие на образование меченых веществ
Введение к работе
Длительное время не снижается интерес к исследованию состояния вещества на межфазных границах. Особенно этот интерес возрос после широкого внедрения в практику наноразмерных систем. Особое место в ряду методов, используемых в таких исследованиях, занимают методы, в которых те или иные радионуклиды выступают как индикаторы количества вещества на межфазной границе и миграции вещества вдоль границы и в глубь фаз.
Среди радионуклидов, которые используют в таких работах, особое положение благодаря уникальным ядерно-химическим свойствам (очень низкая энергия испускаемых при распаде {3-частиц и отсутствие у-фона) занимает тритий. Газообразный тритий достаточно просто перевести в реакционную атомарную форму путем термической активации [1]. При воздействии атомарного трития на твердые тела, в состав которых входят органические молекулы, происходит неселективное замещение атомов протия и радиоактивную метку можно ввести практически в любое органическое соединение.
Большой практический интерес имеет то обстоятельство, что при обработке атомарным тритием белковых макромолекул метка включается только в аминокислотные остатки, расположенные на поверхности таких объектов. Из данных по распределению трития по аминокислотным остаткам белков удается реконструировать третичную структуру макромолекул. Данный метод (его часто называют методом тритиевой планиграфии) в последние годы получил широкое распространение при изучении различных биологических систем [2].
Распределение метки по компонентам облученных атомами трития объектов зависит как от свойств самих объектов, так и от условий реакции. Можно ожидать, что данные о взаимодействии атомарного трития с мишенями различных типов и о связи между строением поверхностного слоя и его способностью ослаблять поток атомов помогут получить новую ценную информацию о строении поверхностного слоя.
Нужно иметь в виду, что бомбардировка атомами трития технически неприменима к исследованию межфазных поверхностей в системах жидкость/жидкость. В этом случае выход можно найти, используя тот факт, что пробег |3-частиц трития в конденсированных средах не превышает несколько микрометров. Если в изучаемой системе одна из жидкостей способна эффективно преобразовывать энергию Р-частиц в кванты видимого света (вызывать
I u
w.
сцинтилляции), то оказывается возможным регистрировать излучение радиоактивных атомов, находящихся в объеме органической фазы и в тонком приповерхностном слое водного раствора. Такой подход ранее был с успехом использован при изучении адсорбции бычьего сывороточного альбумина на границе раздела фаз в системе водный раствор/толуол [3, 4]. Представляется оправданным ожидать, что подобный подход может быть распространен и на многие другие системы. Особенно важно, что в результате подобных исследований может быть получена информация о процессах, происходящих в системах водный раствор/ПАВ/органическая жидкость, включая сведения о взаимном влиянии ПАВ на их адсорбцию на межфазных границах.
Цель настоящей работы состояла в разработке комплексного метода изучения состава и строения поверхностных слоев, на межфазной границе различных гетерогенных систем (твердое тело/газ, жидкость/газ и жидкость/жидкость) с использованием реакций атомарного трития и анализа распределения по системе меченных тритием соединений.
В качестве объектов исследования при изучении структурной организации молекул на границе раздела твердое тело/газ и жидкость/газ использовали:
а-амино кис лоты с неразветвленным углеводородным радикалом: глицин (Gly), аланин (Ala), а-аминомасляная кислота (а-АМК), норвалин (Nva) и норлейцин (Nle), а также аспарагиновая кислота (Asp) и лизин (Lys), катионные поверхностно-активные вещества (КПАВ) бромиды алкилтриметиламмония с длиной углеводородного фрагмента Сі2Н25, Сі4Н29, С16Н3з (ДТАБ, ТТАБ и ЦТАБ соответственно);
слоистые мишени: адсорбционные слои ПАВ (додецилсульфат натрия (ДСН), ДТАБ, ТТАБ и ЦТАБ), образующиеся на границе раздела вода/воздух, а также безводные аминокислоты, покрытые слоями цетиламина.
Для исследования поведения веществ в системе двух несмешивающихся жидкостей были использованы меченные тритием поверхностно-активные вещества: бромиды алкилтриметиламмония (ДТАБ, ТТАБ, ЦТАБ), Тритон Х-100 (ТХ-100), препараты гуминовых веществ, выделенные из угля, торфа и почв. Все меченые вещества были получены с помощью метода термической активации трития (МТАТ).
Научная новизна работы сформулирована в виде следующих положений, которые выносятся на защиту:
Найдены основные параметры, характеризующие способность атомарного трития определять состав поверхностных слоев твердых органических веществ и их водных растворов. Проведена оценка глубины реакционной зоны, в которой происходит образование меченого вещества. Найдена корреляция между способностью мишени ослаблять поток атомов трития и структурной организацией молекул в приповерхностных слоях.
Методом сцинтиллирующей фазы проведено систематическое исследование поведения гомологического ряда бромидов алкилтриметиламмония (ДТАБ, ТТАБ и ЦТАБ) в системах водный раствор/толуол, водный раствор/п-ксилол и водный раствор/циклогексан. Для указанных веществ найдены изотермы адсорбции на межфазных границах и коэффициенты распределения между фазами. Обнаружена повышенная способность к адсорбции на межфазной границе вода/ароматический углеводород для этих веществ. Определено влияние неионогенных ПАВ на адсорбцию бромида тетрадецилтриметиламмония в системе вода/п-ксилол.
3. Усовершенствованный в данной работе метод сцинтиллирующей фазы позволяет
определять количественные характеристики поведения меченных тритием
органических веществ- различных системах из двух несмешивающихся между
собой жидкостей.
4. В результате проделанной работы развит новый метод изучения состава и
строения межфазных границ в различных системах за счет использования реакций
атомарного трития и меченных тритием органических соединений.
Практическая значимость работы.
Выработаны практические рекомендации по использованию атомарного трития при изучении сложных природных объектов и искусственных материалов (нанокомпозиций).
Разработан метод получения гуминовых веществ с равномерным распределением метки по компонентам этих веществ.
Комплексный подход в получении меченных тритием веществ и исследовании их свойств с помощью усовершенствованного метода сцинтиллирующей фазы позволяет определить количественные характеристики поведения этих веществ в системе двух несмешивающихся жидкостей, что может иметь большое практическое значение в различных технологических применениях.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Сканирующая зондовая микроскопия как инструмент исследования взаимодействия водорода с поверхностью полупроводников
Взаимодействие атомарного водорода с кремнием изучается уже белее сорока лет [8]. Интерес к процессу вызван тремя вопросами. Во-первых, водород в принципе является простейшим адсорбатом, поэтому систему водород-кремний можно рассматривать, как модель химической адсорбции на полупроводниках. До введения в практику СТМ казалось перспективным использовать водородный зонд для исследования поверхности полупроводников. Наконец, практический интерес к системе «водород-кремний» связан с образованием тонких пленок и роли в пассивации, как пленок аморфного кремния, так и субстратов кристаллического кремния.
Сканирующий туннельный микроскоп - это инструмент для введения в исследуемую поверхность острого кончика иглы на глубину порядка 5-10 А. На таком расстоянии перекрываются волновые функции иглы и поверхности, и между ним протекает туннельный ток. Сила туннельного тока зависит от топографии и плотности состояний образца.
СТМ успешно применяется для изучения взаимодействия атомарного водорода с кремнем. Ранее для изучения типов связывания и структуры образующихся гидридов применялись методы инфракрасной спектроскопии [9], дифракции медленных электронов (LEED) [10, 11], спектроскопии потерь энергии электронов (EELS) [11] и фотоэмиссионной спектроскопии [11]. Однако результаты, полученные данными методами, оказались противоречивы. Исследования с помощью СТМ показали распределение на поверхности кремния всех известных типов гидридов [9].
Изучение взаимодействия простого адсорбата, такого как водород, с поверхностью кремния позволяет более детально понять реакционную способность поверхности полупроводниковых материалов. СТМ эксперименты явно показали, что такие поверхности не могут рассматриваться, как простые субстраты, внутрь которых диффундирует адсорбат и образует продукты. Результаты СТМ экспериментов показывают, что взаимодействие поверхности полупроводника с адсорбатом приводит к значительным изменениям в структуре поверхности.
Для изучения процесса адсорбции ПАВ на границе раздела твердое тело/жидкость применяют флуоресцентный зонд. Использование флуоресцентной спектроскопии позволило авторам работы [12] изучить микроструктуру мицелл и адсорбционные слои алкилксиленсульфонатов на границе раздела вода/алюминий. На основании полученных данных, авторы объяснили стерическими факторами различие в поведении ПАВ, различающихся положением функциональных групп.
Другим примером применения флуоресцентного зонда является изучение распределения и ориентации 2-(ТЧ-гексадециламино)-нафталин-6-сульфоната и 2-(Ы-дециламино)-нафталин-б-сульфоната в мицеллах катионных ПАВ [13]. Показано, что на 90 % оба вещества локализованы в области заряженных групп (уровень Стерна), а не солюбилизированы алкильными цепями. Также было отмечено, что проницаемость в мицеллярные структуры определяется временем существования и скоростью релаксации.
При исследовании структурной организации биологических макромолекул, входящих в состав биологических объектов, удобным инструментом являются атомы трития, обладающие высокой энергией, а в качестве сканера выступает, появившееся после обработки атомарным тритием, Р-радиоактивность вещества и / или его фрагментов.
Метод тритиевой планиграфии (см. глава 1.2) можно отнести к зондовым методам. Далее будет показано, что распределение трития по фрагментам соединения четко коррелирует со структурой макромолекулы. Следует отметить и тот факт, что радиоактивные индикаторы позволяют наблюдать и за поведением веществ в различных системах, в том числе и в системе жидкость/жидкость (см. 2.3.5).
Тритиевая планиграфия - это метод исследования поверхности макромолекул с помощью бомбардировки атомами трития. В основе метода лежит реакция атомов трития, полученных при диссоциации молекул трития на поверхности металла, в частности на вольфрамовой проволоке при 1600 - 2000 К [1] (метод термической активации трития) с твердой мишенью. По результату взаимодействия атомов с поверхностью мишени можно определить стерическую доступность углеводородных групп (-СН, -СНг, -СН3). Замещение протия на тритий происходит во всех стерически-доступных фрагментах объекта с приблизительно равной вероятностью и не сказывается на его свойствах, то есть меченый продукт и немеченая исходная молекула химически тождественны.
Реакция с атомами трития проводится в стеклянном реакторе, в центре которого расположена вольфрамовая проволока. Наиболее распространенные типы реакторов показаны на рис. 1.2. Вещество мишени тонким слоем наносится на стенки реактора и в ходе реакции охлаждается жидким азотом. Подробное описание процесса введения тритиевой метки в органические молекулы приведены в работах [14, 15]. После введения метки и удаления трития из лабильных положений молекул (функциональные группы, способные к обмену протоном с растворителем) необходимо провести анализ распределения метки по фрагментам молекул. В случае белковых молекул для идентификации поверхностных участков необходимо определить распределение метки по полипептидной цепи белка. Для этого белок фрагментируют на пептиды, смесь пептидов разделяют, пептиды идентифицируют, гидролизуют и далее определяют включение метки в аминокислоты. Очевидно, что идеальная ситуация - это получение в результате фрагментации белка пептидов, в которых каждая аминокислота встречается однократно. На практике это удается довольно редко, однако необходимо стремиться к тому, чтобы число повторов было минимальным. И, наконец, в принципе возможно сиквенирование пептидов с анализом активности в каждой из отщепляемых аминокислот. Последний вариант, конечно, является наиболее эффективным, но и наиболее сложным.
Таким образом, правильно приготовив мишень, проведя мечение образца и выбрав соответствующую тактику анализа получаемых данных, можно использовать распределение метки для построения модели пространственной структуры.
В настоящей главе рассматриваются основные процессы, происходящие в системе при участии атомов водорода высокой энергии. Также приводятся данные, полученные с применением метода тритиевой планиграфии, по исследованию сложных биологических объектов.
Толщина и шероховатость границы раздела жидкость/жидкость
Когда речь идет о процессах, происходящих на границе двух жидкостей, возникает вопрос, связанный с толщиной межфазной области. Этот вопрос тесно связан с проблемой определения профиля плотности двух жидкостей и их взаимного смешивания. Термодинамическим свойством системы, которое может быть измерено физическими методами, является поверхностное натяжение систем жидкость/жидкость. Величина поверхностного натяжения может быть рассчитана из уравнения Гиббса: (- -), =-r-R (2.1) о тс где с молярная концентрация, Г - адсорбция, R - газовая постоянная, Т температура. В частности, (r-NA) l - площадь поверхности, приходящаяся на одну молекулу, адсорбированную на межфазной границе (NA - число Авагдро). Капиллярно-волновая теория дает прямую связь между шероховатостью поверхности раздела фаз и ее поверхностным натяжением [54]. Математическое моделирование геометрии поверхности жидкость/жидкость заключается, в представлении системы жидкостей с плотностями рх и р2 в виде соприкасающихся параллелепипедов [52, 55]. Площадь границы раздела S = L (рис. 1.8). Рис. 1.8. Схематическое изображение системы жидкость/жидкость (слева). Изменение плотности (справа) Если рассмотреть наложение флуктуации плотности на внутренний профиль плотности, то при самом простом приближении получим, что внутренний профиль плотности (pmt) есть функция со ступенькой (пунктирная линия на рис. 1.8): Pint =Pi»z (C (2.2) An. =P2 Z {C) Ось z выбрана перпендикулярно границе раздела и координата z = zcped соответствует () = 0. Зависимость плотности от положения s = (х, у), определяется аналогично z: p(r) = рх + (р2 - A )u[C(s) - z] (2.3) Здесь и - единичная функция [u(t 0) = 0, u(t 0) = 1], г = (х, у, z) = (s, z), (s) -поверхность, разделяющая жидкости. При (s) = (С) уравнение (2.3) совпадает с уравнением (2.2). Поверхность, разделяющая жидкости, может быть задана как сумма компонентов q ряда Фурье: С( ) = Л( )еч\Л(0) = 0 (2 4) ч и рассматриваться как мембрана, форма которой определяется наложением капиллярных волн с различной длиной волны. Значение квадрата амплитуды флуктуации поверхности при заданной температуре определяется уравнением: (С2) = (S-1 fe\s)ds) = ЖЛШІ-Я)) (2.5) 0
Таким образом, каждая мода q «воздействует» в виде (A(q)A(-q)) на явную шероховатость границы раздела. Сумма ряда q начинается с 2к/Ь и имеет верхний предел, который определяется наименьшим расстоянием, ниже которого непрерывная капиллярно-волновая картина бессмысленна. Это расстояние может быть принято равным корреляционной длине объема жидкости Сь- Эта величина порядка диаметра нескольких молекул, таким образом, сумма в уравнении (2.5), в области выше предела, составляет 2к/Сь В работе [56] приведены результаты модели для значения свободной энергии, необходимой для создания поверхности (s) и суммы в уравнении (2.5). Получено, что толщина границы раздела жидкость/жидкость определяется уравнением: 1- Гг M,VJS (2-6) где /с = [2//g)w,p, -т2р2\\ - капиллярная длина, величина порядка нескольких миллиметров, ті, і = 1,2- молекулярные массы жидкостей, g - гравитационная постоянная. Как видно из уравнения (2.6) в пределе (S — оо) отклонение толщины поверхности раздела (-Ing)m, при g — 0, (2) = In—. Таким образом, толщина межфазного слоя есть функция термодинамических параметров и остается открытым вопросом для расчетных задач [53-55].
Для экспериментального определения толщины межфазного слоя на границе вода/алканы, с различной длиной цепи, авторами работы [57] был применен метод рассеивания рентгеновских лучей. Было найдено, что толщина межфазного слоя составляет 3.5 ±0.2 А. Это значение хорошо согласуется с расчетами по описанным выше моделям. Мерой гидрофобности поверхностно-активных веществ (ПАВ) принято считать их коэффициенты распределения в системе водный раствор/октанол [58]. В состоянии равновесия химические потенциалы (//, =//, +R-Inr ) обеих фаз равны, то есть то о - Tw w (2-7) где т. о и т w - коэффициенты активностей, а Х 0 и X w - мольные доли ПАВ в октаноле и воде соответственно. Поскольку мольную долю можно определить как X = C-V (2.8) где С - молярная концентрация растворенного вещества, а. V — мольный объем растворителя, то из уравнения (3.7) для коэффициента распределения {K0w) можно получить следующее выражение С T V K0(V- — - r-r (2.9) где V w и V o - мольные объемы воды, насыщенной октанолом, и октанола, насыщенного водой, соответственно. Растворимость вещества в воде можно рассматривать как распределение его между чистым веществом и насыщенной водной фазой. Таким образом, уравнение (2.9) принимает вид: VWTW (2.10) Так как растворимость октанола в воде 0.0045 моль/л [58], то можно считать V w = Vw, таким образом 1 rw 1 K0№=—p-JL- (2.11) т 1 Множители — и — являются соответственно поправочными коэффициентами Tw т(} для активностей в воде (с учетом растворимости октанола в воде) и октанольной фазы (с учетом растворимости воды в октаноле). Поскольку T W»XW ТО поведение большинства гидрофобных соединений в системе вода/октанол можно рассматривать как поведение в идеальном растворе [59]. Таким образом, для расчета коэффициента распределения используется уравнение
При работе в области концентраций за критической концентрацией мицеллообразования (ККМ) следует учитывать возможность ПАВ перераспределяться не только между контактирующими жидкими фазами, но и между фазами вода/мицелла. С учетом уравнения (2.12) авторами работы [60] была найдена линейная корреляция между логарифмами коэффициентов распределения ПАВ в системах вода/неполярная жидкость и вода/мицелла. Для определения коэффициентов распределения авторами работы использовался метод «равновесного распределения в закрытой системе» (EPICs) [61]. Двухфазная система водный раствор ПАВ (70 мл)/неполярная жидкость (87 мл) инкубировалась в стеклянном сосуде при 25С. После достижения в системе равновесия, проводился анализ состава фаз с помощью газовой хроматографии.
Для определения концентрации неионогенпых ПАВ, таких, как Тритон X-100 (ТХ-100) в органической фазе при распределениив системах вода/циклогексан, вода/гептан и вода/гексадекан в работе [62] использовали метод УФ-спектрометрии. Отметим также, что данные по распределению Тритонов с различной длиной цепи этоксильных групп в системе в ода/из ооісган приведены в работе [63]. Авторы цитируемой работы проводили эксперимент в области концентраций порядка 10"7 моль/л и погрешность могла превышать 10 %.
Определение растворимости и распределения ПАВ различных классов в системе водный раствор/неполярная жидкость проводилось с помощью обращено-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии [64]. Было обнаружено, что на коэффициент распределения сильно влияют рН и ионная сила раствора, а также присутствие примесей (в частности метанола) в неполярной жидкости. Следует отметить, что по данным работы [64] все эти факторы влияют на распределение как ионных, так и неионогенных ПАВ.
Исследование структуры твердых мишеней с помощью атомарного трития
Реакцию с атомарным тритием проводили на вакуумной установке, схема которой показана на рисунке 3.1. После нанесения мишени на стенки реакционного сосуда (VII), воздух откачивали сначала с помощью форвакуумного насоса, а затем диффузионным насосом до остаточного давления 0.1 мТор. Напускали тритий в реакционный сосуд при помощи палладиевого натекателя (VI) до давления порядка 4 мТор (0.5 Па) и в течение 10 с нагревали вольфрамовую проволоку. Исходную концентрацию трития определяли по давлению с учетом поправки на распад и на разбавление водородом в процессе хранения и эксплуатации ампул. Для этого периодически проводили контрольный эксперимент по поглощению трития мишенью коричной кислоты. Контрольный эксперимент заключался в том, что в стандартный реакционный сосуд с 5 мг коричной кислоты на его стенках дозировали тритий до давления 0.5 Па и проводили нагревание вольфрамовой проволоки двумя импульсами по 10 с. В этом случае весь тритий связывался с мишенью. Процентное содержание трития в газовой фазе определяли по соотношению %(3 Я) = -х100%, так радиоактивность мишени коричной кислоты, полученной в эксперименте с новой фасовкой трития (содержание трития не менее 97 %) была равна 850+15 МБк.
Для приготовления мишени 0.5 мл водного (или спиртового) раствора (1 г/л)" изучаемого вещества равномерно распределяли по стенкам реакционного сосуда (объем реактора 400 см3). Если использовали водный раствор, то его замораживали жидким азотом и лиофилизовывали, подсоединив сосуд к устройству по лиофилизации. Окончание лиофилизации определяли по тому, как температура стенок реакционного сосуда достигнет комнатной. В том случае, когда проводили эксперимент со спиртовыми растворами (мишени катионных поверхностно-активных веществ), то их также равномерно распределяли по стенкам реакционного сосуда и высушивали потоком воздуха при непрерывном вращении реакционного сосуда.
После проведения реакции с атомарным тритием (см. 2.2.1) аминокислоты смывали 1 мл воды, а катионные поверхностно-активные вещества (ДТАБ, ТТАБ и ЦТАБ) - 1 мл этанола. Для удаления трития из лабильных положений молекул (функциональные группы) вещества выдерживали в растворе в течение 24 часов, а затем высушивали растворитель. 0.5 мл водного раствора (1 г/л) аминокислоты (глицин, аланин, аспарагиновая кислота или валин) равномерно распределяли по стенкам реакционного сосуда (объем 400 см3), замораживали жидким азотом и лиофилизовывали. После высушивания мишени поверх аминокислоты равномерно наносили необходимое количество ЦА раствора в гептане. Гептан высушивали током воздуха при непрерывном вращении реакционного сосуда. В независимых экспериментах с использованием [14С]-аминокислот было показано, что при использовании гептана в качестве растворителя мишень аминокислоты не смывается. С помощью авторадиографии и меченного тритием цетиламина была показана равномерность нанесения цетиламина на мишень аминокислоты (см. 2.2.5). После проведения реакции ЦА смывали 2 мл гептана. Для смывания аминокислот использовали: (1) для аланина - 1 мл водного раствора [14С]-А1а (удельная радиоактивность 30 кБк/мл); (2) для аспарагиновой кислоты и лизина - 1 мл раствора, содержащего потенциальные продукты декарбоксилирования (аланин и (3-аланин)- и дезаминирования (норлейцин), с концентрацией 0.5 г/л. Для удаления трития из лабильных положений, меченые аминокислоты выдерживали в растворе в течение суток, а затем лиофилизовывали. Раствор ЦА в гептане высушивали на воздухе.
На стеклянную пластинку 17.5x2.3 см наносили аланин (3.33 мкг/см ) из водного раствора. После высушивания раствора на осадок наносили [ Н]-цетиламин (0.3, 0.6 и 1.2 мкг/см2) из раствора в гептане. После высушивания проводили авторадиографию полученных образцов. Авторадиограммы были получены к.х.н. В.И. Коробковым, по методике описанной в работе [93].
Полученные изображения сканировали на сканере Epson Perfection V700 (разрешение 2400 dpi). Вместе с анализируемым изображением сканировали черно- белую калибровочную шкалу (SilverFast IT8-Calibration, Kodak). С помощью калибровочной шкалы и программы Adobe Photoshop 7.0 строили зависимость «отклик сканера - оптическая плотность», согласно методике, описанной в работе [94]. Изображения анализировали с помощью Mathcad 13 (Mathsoft): черно-белое изображение разбивали на зоны 10x10 пикселей, считали среднее значение отклика сканера в каждой зоне, затем рассчитывали значение оптической плотности по калибровочной кривой (рис. 2.3). По полученным данным находили распределение вещества по поверхности, поскольку интенсивность сигнала пропорциональна количеству вещества.
В экспериментах с водными растворами использовали стеклянный реакционный сосуд со шлифованными боковыми стенками для повышения их смачиваемости водными растворами ПАВ. В работе использовались водные растворы ДТАБ, ТТАБ и ЦТАБ с концентрацией 8.21, 2.53 и 0.66 ммоль/л соответственно ( 2/3 от величины критической концентрации мицелообразования (ККМ) для данных ПАВ [97]). Водные растворы ДСН исследовали в диапазоне концентраций от 0.76 до 7.6 ммоль/л. Для приготовления мишени 0.25 мл водного раствора аланина (0.1 моль/л) или смеси аланина той же концентрации с одним из исследуемых ПАВ равномерно распределяли по боковым стенкам реакционного сосуда, выдерживали 15 мин при комнатной температуре (295-296 К) для полного смачивания раствором поверхности стенок, а затем быстро замораживали жидким азотом. При работе с использованием метода термической активации необходимо вакуумирование мишени до остаточного давления в реакторе около 0.1 мТор (см. 3.2.4 данного раздела). Но, как известно, вода возгоняется при данных условиях. Поэтому вакуумирование системы проводили при охлаждении стенок реактора жидким азотом (77 К). После обработки атомарным тритием мишени размораживали и добавляли в качестве носителя 1 мл []4С]-аланина с удельной радиоактивностью 26.5 кБк/мл. Удаление трития из лабильных положений проводили по методике, описанной в 2.2.4 и 2.2.5.
Факторы, влияющие на образование меченых веществ
В данной работе рассматривается возможность исследования структурной организации приповерхностных слоев твердых веществ и водных растворов органических соединений с помощью атомарного трития. Удобным способом получения атомов трития является термическая диссоциация молекулярного трития на вольфраме. Вольфрамовая проволока в этом случае не только является источником энергии, необходимой для разрыва связи Н-Н, но и выступает в качестве катализатора, ускоряющего этот процесс. В результате диссоциация водорода на атомы наблюдается уже при температуре выше 1400 К. Обычно эксперименты проводят при температуре вольфрамовой проволоки 2000 К. Считается, что при этой температуре скорость диссоциации высока, а доля атомов с энергией, достаточной для протекания реакции с углеводородными фрагментами органических молекул, составляет не менее 25 % [2]. Для того чтобы атомы не теряли свою энергию при движении к мишени за счет столкновений с молекулами газа, давление в реакционном сосуде не должно превышать определенной величины. Для реакционных сосудов цилиндрической формы, у которых расстояние от вольфрамовой проволоки до стенок сосуда составляет 3.5 см, условие свободного пробега атомов от атомизатора до мишени выполняется при давлении газа 0.5 Па [102].
Структурные исследования биологических макромолекул с помощью воздействия на них атомарного трития (метод тритиевой планиграфии) получили распространение в работах [2-15]. В этих работах сопоставляется распределение трития по аминокислотным остаткам белков и на этом основании делается вывод о доступности данного остатка атомам трития. При интерпретации результатов в методе тритиевой планиграфии используют упрощенный подход, когда «вся включенная метка будет обусловлена первым и единственным столкновением горячего атома с мишенью» [2]. При исследовании глобулярных белков, имеющих плотную упаковку полипептидной цепи, такой подход оказался достаточно успешным [40-42]. Однако при исследовании более сложных образований (вирус табачной мозаики) было обнаружено, что радиоактивная метка включается не только в приповерхностные аминокислотные остатки пептидов, но и в пептидную цепь, находящуюся на расстоянии около 7 нм от поверхности вириона. Для объяснения такой картины распределения метки по аминокислотам полипептидной цепи вируса необходимо учитывать способность атомов трития проникать в области мишени, имеющие низкую плотность упаковки молекул, с сохранением реакционной способности (эффект «соскальзывания») [39]. Безусловно, систематическое исследование взаимодействия атомов трития с мишенями различного химического состава позволит определить связь между таким важным параметром взаимодействия, как глубина реакционной зоны (или способностью среды пропускать атомы вглубь мишени с сохранением- их реакционной способности) и структурной организацией молекул в мишени.
Для- приведения результатов различных экспериментов и неким «стандартным условиям» во многих исследованиях использовали прием нормирования радиоактивности компонента мишени на общую радиоактивность мишени, которая считалась количественной характеристикой общего потока атомов, попадающих на мишень. В случае если бы все попавшие на мишень атомы трития вступали в реакцию с молекулами мишени, а продукты реакции оставались в ней, то начальная радиоактивность мишени была бы характеристикой потока атомов на мишень. Однако меченые по С-Н связи молекулы образуются в результате двух последовательных реакций: отрыва водорода атомом трития с образованием молекулы Н Н и рекомбинации образующегося радикала с другим атомом трития. Следовательно, количество трития в меченом соединении в 2 раза меньше количества вступающих в реакцию атомов трития. При высоких интенсивностях потока атомов трития на мишень возможна рекомбинация атомов в мишени. Таким образом, начальная радиоактивность сухих мишеней отражает только сумму меченых нелетучих продуктов, поэтому для безводных мишеней начальная радиоактивность оказывается, как правило, меньше, чем для замороженных растворов [103], и не может являться точной характеристикой потока атомов: Наиболее близкой к потоку атомов на мишень является радиоактивность замороженных водных растворов. В этом случае большая часть трития стабилизируется в мишени в виде лабильной метки, и вклад реакции изотопного замещения протия на тритий по связи С-Н не превышает долей процента от начальной радиоактивности.
В данной работе исследовали взаимодействие атомов трития, как с замороженными водными растворами, так и с безводными мишенями. На рис. 3.1 приведены данные по изменению радиоактивности мишеней, представляющих собой замороженный водный раствор аланина концентрации 2 г/л, и средними значениями радиоактивности лиофилизованных мишеней ряда аминокислот при изменении температуры вольфрамовой проволоки от 1600 до 2000 К. Радиоактивность всех типов мишеней монотонно росла с увеличением температуры атомизатора, однако для замороженного водного раствора эта величина во всем диапазоне температур оказалась примерно в 2 раза выше, чем для лиофилизованных мишеней.
В координатах Аррениуса рассматриваемые зависимости были близки к линейным. Отсюда можно определить эффективную энергию активации процесса, приводящего к стабилизации трития в мишени. Эти величины оказались близкими и составили 132 ±15 кДж/моль для водных растворов и 112 ±20 кДж/моль для лиофилизованных мишеней. Энергия диссоциации водорода на вольфраме по данным многочисленных исследований лежит в диапазоне от 180 до 240 кДж/моль [21-25]. Меньшая величина энергии активации процесса введения трития в мишень, рассчитанная из данных данной работы, свидетельствует о том, что скорость диссоциации трития на вольфраме не является лимитирующей стадией этого процесса.
Двукратное превышение начальной радиоактивности мишени замороженного водного раствора над аналогичной мишенью лиофилизованного вещества свидетельствует о том, что водный раствор обладает гораздо более высокой способностью связывать атомы трития в мишени. В первом приближении можно представить ситуацию, что в случае лиофилизованой мишени практически весь тритий стабилизируется в мишени вследствие реакции изотопного замещения водорода по двухстадийному механизму: Y-H + Т - Y + НТ (А) и Y + Т —» YT (В), тогда как для водных растворов превалирует связывание всех атомов трития, попавших в мишень, в форме тритиевой воды.
