Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Гуминовые вещества 7
1.2. Гидрофобность гуминовых веществ и методы определения коэффициентов распределения 16
1.3. Поверхностно-активные свойства гуминовых веществ 20
1.4. Исследование адсорбционных явлений на границе раздела жидкость-жидкость 22
1.5. Введение радионуклидов в гуминовые вещества 27
1.6. Метод сцинтиллирующей фазы 28
1.7. Методы введения трития в органические молекулы 31
1.7.1. Химический синтез 33
1.7.2. Биосинтез меченых соединений 35
1.7.3. Изотопный обмен 37
1.7.4. Ядерно-химические и физико-химические методы 39
1.7.5. Метод термической активации трития 40
2. Экспериментальная часть 47
2.1. Реактивы и оборудование 47
2.2. Препараты гуминовых веществ и лигфола 48
2.3. Схема проведения эксперимента с гуминовыми веществами 51
2.4. Получение меченных тритием гуминовых веществ 52
2.4.1. Приготовление мишеней 52
2.4.2. Введение тритиевой метки 52
2.5. Методы исследования 54
2.5.1. Измерение радиоактивности 54
2.5.2. Определение содержания трития в газе 54
2.5.3. Удаление трития из лабильных положений молекул 55
2.5.4. Хроматографический анализ 55
2.5.5. Определение молекулярно-массового распределения гуминовых веществ 57
2.5.6. Исследование гидрофобных и поверхностно-активных свойств гуминовых веществ 58
2.5.7. Исследование взаимодействия гуминовых веществ с бактериями и растениями 59
3. Результаты и их обсуждение 62
3.1. Оптимизация условий введения тритиевой метки. Модельные эксперименты 62
3.2. Получение меченных тритием гуминовых веществ 68
3.3. Очистка меченных тритием гуминовых веществ от лабильной метки 71
3.4. Подтверждение равномерности введения метки в гуминовые вещества 72
3.5. Характеристика меченных тритием гуминовых веществ 74
3.6. Адаптация метода сцинтиллирующей фазы к исследованию свойств гуминовых веществ 76
3.7. Определение гидрофобности и поверхностной активности гуминовых веществ с помощью метода сцинтиллирующей фазы 87
3.7.1. Определение коэффициентов распределения гуминовых веществ в системах толуол-вода и октанол-вода 87
3.7.2. Определение изотерм адсорбции гуминовых веществ на границе раздела толуол-вода 89
3.7.3. Влияние фракционного состава на гидрофобность и поверхностную активность гуминовых веществ 91
3.8. Использование разработанных методов для исследования физико-химических свойств биологически активного препарата лигфола 93
3.9. Исследование связывания гуминовых веществ бактериями и высшими растениями 98
3.9.1. Взаимодействие гуминовых веществ с бактериями Escherichia col і 98
3.9.2. Взаимодействие гуминовых веществ с растениями Trilicum aestivum L. 100
Выводы 103
- Гидрофобность гуминовых веществ и методы определения коэффициентов распределения
- Биосинтез меченых соединений
- Удаление трития из лабильных положений молекул
- Характеристика меченных тритием гуминовых веществ
Введение к работе
В последние годы активно проводятся исследования сложных природных систем, содержащих в своем составе продукты жизнедеятельности и распада живых организмов. Важным представителем таких объектов являются гуминовые вещества (ГВ). Характеристика физико-химических свойств ГВ важна для понимания того, как эти вещества влияют на поведение и транспорт различных химических и радиоактивных загрязнений в окружающей среде [1, 2, 3, 4], при очистке воды [5, 6, 7], а также при исследовании их биологической активности и способности проникать через биологические мембраны [8]. В качестве важнейших характеристик ГВ, которые определяют их поведение в объектах окружающей среды и их биологическую активность, необходимо рассматривать гидрофобность и поверхностно-активные свойства. Несмотря на большое число методов, которые используются для изучения свойств ГВ (титриметрические и другие аналитические методы анализа, различные варианты хроматографии, методы спектроскопии,3С-ЯМР, ПМР) [9, 10, 11, 12], прямых методов определения поверхностно-активных свойств и гидрофобности ГВ не существует.
В последние годы на Химическом факультете МГУ был разработан метод исследования адсорбции белков на границе раздела водный раствор-толуол со сцинтиллирующими добавками (метод сцинтиллирующей фазы) [13]. Адаптация данного метода к исследованию поверхностно-активных свойств ГВ и оценке их гидрофобности может помочь в прогнозировании поведения ГВ в самых разных системах. Однако для реализации данного метода необходимо иметь меченные тритием соединения.
При изучении механизмов биологической активности ГВ следует ответить на вопрос: проницаемы ли биологические мембраны для ГВ? С этой целью необходимо получить прямые данные о проницаемости и сорбционной способности биомембран в отношении ГВ, что достоверно можно сделать только с помощью меченных радионуклидами препаратов. До сих пор наибольшее распространение получило использование меченых углеродом-14 ГВ, получаемых с помощью синтеза из веществ, считающихся предшественниками ГВ, либо после компостирования выращенных на меченом субстрате растений. Однако получаемые меченые препараты не обладали высокой удельной радиоактивностью и отличались по своим свойствам от природных ГВ, что затрудняло интерпретацию получаемых результатов.
Вследствие этого перспективным представляется использование в таких исследованиях в качестве радиоактивной метки трития, который можно ввести в компоненты природных препаратов гуминовых веществ изотопным замещением протия. Меченные тритием соединения нашли широкое применение в решении многих научных задач, так как тритий обладает уникальными ядерно-физическими свойствами (максимальная энергия бета-излучения 18.6 кэВ, период полураспада 12.3 года). Тритиевую метку можно ввести практически в любую органическую молекулу, работа с меченными тритием веществами не требует чрезвычайных мер радиационной защиты, а удельная радиоактивность соединения, содержащего один атом трития на молекулу, составляет 1.07 ТБк/ммоль. В настоящее время разработано большое число методов, позволяющих получить меченные тритием соединения самых разных классов с высокой удельной радиоактивностью [14,15].
Современные исследования сложных природных образований выдвигают особые требования к меченым веществам. Так как такие системы содержат сложные смеси макромолекул переменного состава и нерегулярного строения, а для их описания используют интегральные характеристики состава, строения и других показателей, то для изучения подобных объектов с помощью радиоактивной метки требуется неизбирательное введение трития и его равномерное распределение по компонентам объектов. Причем процедура введения метки должна быть универсальной, а меченый препарат должен полностью сохранять свойства исходного. Перспективным видится использование метода термической активации трития, с помощью которого возможно неселективное введение метки в самые разные химические соединения.
Цель настоящей работы - разработка способа получения меченных тритием ГВ с равномерным распределением метки по компонентам препаратов и изучение их гидрофобных и поверхностно-активных свойств методом сцинтиллирующей фазы (СФ).
Объекты исследования - гуминовые вещества (ГВ), представляющие собой сложные смеси устойчивых к биодеструкции высокомолекулярных темноокрашенных органических соединений природного происхождения, образующихся при разложении растительных и животных остатков под действием микроорганизмов и абиотических факторов среды. Гуминовые вещества являются макрокомпонентой органического вещества почвенных и водных экосистем, а также твердых горючих ископаемых. Характерной особенностью этих веществ являются: нестехиометричность состава, нерегулярность строения, гетерогенность структурных элементов, полидисперсность. Различают несколько групп ГВ: 1) фульвокислоты (ФК), растворимые в воде, щелочных и кислых растворах; 2) гуминовые кислоты (ГК), растворимые только в щелочных растворах; 3) гиматомелановые кислоты (ГМК), извлекаемые из сырого остатка (геля) гуминовых кислот этиловым спиртом; 4) гумин - практически нерастворимое и неизвлекаемое из природных тел и компостов органическое вещество.
Научная новизна работы сформулирована в виде следующих положений, которые выносятся на защиту:
Разработаны принципы введения тритиевой метки в природные и искусственные смеси биологически активных молекул посредством реакций атомарного трития, полученного при диссоциации трития на вольфрамовой проволоке при 1800-2000 К. Впервые получены меченные тритием ГВ с равномерным распределением метки по компонентам препаратов и удельной радиоактивностью, достаточной для их использования в химических и биохимических исследованиях. Разработана методика очистки меченых препаратов с помощью диализа через мембраны с различным размером пор. Идентичность исходных и меченых препаратов подтверждена с помощью эксклюзионной хроматографии.
Разработан новый вариант метода сцинтиллирующей фазы с целью его использования для определения гидрофобности и поверхностной активности ГВ и других сложных природных и искусственных смесей молекул. С помощью тритиевой метки впервые определены коэффициенты распределения ГВ в двухфазных системах толуол-вода и октанол-вода, а также получены изотермы адсорбции ГВ на границе раздела толуол-вода. Полученные результаты позволили построить шкалу гидрофобности и поверхностной активности ГВ.
Практическая значимость работы;
Разработанные методики были использованы для введения тритиевой метки в ГВ различной природы и происхождения, а также гуминоподобное вещество лигфол, обладающее биологической активностью и используемое в ветеринарии. С помощью меченных тритием гуминовых и гуминоподобных веществ получены их количественные характеристики гидрофобности и поверхностной активности. Такая информация очень важна для прогнозирования поведения этих веществ в различных условиях и предсказания их биологической активности.
Меченные тритием ГВ были использованы в экспериментах по исследованию их связывания с биологическими мембранами микроорганизмов и для определения их поступления в растения через корневую систему.
Гидрофобность гуминовых веществ и методы определения коэффициентов распределения
Характерной особенностью ГВ является наличие высокоокисленного ароматического ядра и периферической части, обогащенной полисахаридными и полипептидными фрагментами. Дуализм структуры ГВ обуславливает наличие у них таких свойств, как гидрофобность и биологическая активность, которые в свою очередь определяют поведение гумусовых кислот в природе. Для лучшего понимания механизмов взаимодействия ГВ с экотоксикантами (полиароматические углеводороды, пестициды, ионы тяжелых металлов) и предсказания поведения ГВ в различных средах необходима количественная характеристика гидрофобных и поверхностно-активных свойств ГВ. Гидрофобные свойства ГВ могут быть обусловлены содержащимися в их составе углеводородными фрагментами (алканами и алкенами, например, в виде жирных кислот) или бензолуглеводородными соединениями (аренами, например, фрагментами молекул лигнина, ароматическими аминокислотами). В свою очередь гидрофильные свойства ГВ определяются полярными функциональными группами (спиртовыми и фенольными гидроксилами, а также карбоксилами, карбонилами и др.). Гидрофильно-липофильный баланс ГК сдвинут в гидрофобную сторону, а ФК — в гидрофильную. Это связано с тем, что ГК по сравнению с ФК содержат меньше кислородсодержащих функциональных групп и больше ароматических [10]. Количественной мерой гидрофобности является коэффициент распределения вещества между органической жидкостью и водой, который отражает сродство вещества к органической или водной фазе. В общем виде коэффициент распределения Кр представляет собой отношение равновесных концентраций вещества между двумя несмешивающимися фазами, находящимися в контакте: Стандартным количественным параметром гидрофобности является октанольно-водный коэффициент распределения K ,w [58] (свойства 1-октанола имеют сходство со свойствами двуслойных липидньк мембран; распределение химических веществ в октаноле, в определенном смысле, моделирует их способность пассивно диффундировать через биологаческие мембраны). KoW представляет собой равновесное отношение концентраций вещества в октаноле и воде [59]: Чем больше значение logKow, тем более гидрофобно соединение. Равновесное распределение вещества D между двумя несмешивающимися жидкостями А и В характеризуется равенством химических потенциалов вещества D во взаимодействующих фазах: р.А = цВ, т. е. где А М в _ стандартные химические потенциалы вещества D в жидкостях А и В; активности вещества D в фазах А и В; Т - температура, К; R — газовая постоянная.
Из уравнения (1-6) следует, что в изотермических условиях отношение активностей распределяемого вещества в состоянии равновесия — постоянная величина: где /в, /А - коэффициенты активности вещества D в фазах А и В. В тех случаях, когда /В//А= 1» закон распределения принимает вид, описанный в уравнениях Существуют несколько методов определения Kow Классическим методом измерения Kow является метод медленного перемешивания или встряски ("shake flask" метод) [58]. Суть данного метода заключается в том, что небольшое количество исследуемого вещества растворяют либо в водной, либо органической фазах. Равновесное распределение достигается простым перемешиванием. Затем фазы разделяют и анализируют. В статье [60] с помощью данного метода были определены октанольно-водные коэффициенты распределения трех групп ГВ. После 24 ч перемешивания октанольно-водную смесь разделяли и каждую фазу анализировали на спектрофотометре при 280 и 430 нм, K ,w рассчитывали как отношение поглощения при 430 к 280 нм. Было найдено, что Kow увеличивался с понижением рН раствора. Значения KoW для ПС (коммерческого препарата Fluka) утраивались для каждого порядка величины понижения в рН. Однако для препарата ГВ, выделенного из природной воды, зависимость KoW от рН оказалась достаточно слабой: Kow менялся от 0.084 при рН 7 до 0.116 при рН 3.5. Другой метод измерения Kow основан на корреляции коэффициента распределения с временем удержания, которое определяют методом обратимо-фазной высоко эффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC). Еще в ранних работах Мартина [61, 62] было установлено, что хроматография дает количественную информацию о гидрофобности растворимых молекул. При этом процесс удержания . в хроматографической разделительной системе может быть описан как динамичный равновесный процесс с константой равновесия [63]: где [А]»и и [А]шоь - концентрация распределяемой молекулы А в стационарной и подвижной фазах. В RP-HPLC удерживание вещества А количественно определяется из экспериментальных данных с помощью объемного фактора к [64]: где t\ - время удержания исследуемого вещества A, a to - время удержания вещества, которое не проникает в стационарную фазу, проходя через хроматографическую колонку. где Vste и Vmob- объемы стационарной и подвижной фаз в колонке. Таким образом, логарифм константы равновесия линейно связан с логарифмом экспериментально измеренного объемного фактора: и если распределение, характеризуемое через Кг, аналогично октанольно-водному распределению, то log Кг будет линей но связан с log Kow [64]: Следовательно, возможность метода RP-HPLC определять гидрофобность вещества связана со схожестью механизмов удержания вещества на колонке с октанольно-водным распределением. С помощью данного метода были исследованы образцы природных органических веществ (NOM) [63].
Колонку с привитой Сі8-фазой калибровали с помощью веществ с природных органических веществ различного происхождения по их времени удержания. В работе [65] для определения гидрофобности ГВ использовали модифицированный RP-HPLC-метод, основанный на элюировании смесью уксусная кислота/ацетонитрил. Этот метод разделял образцы ГВ на две хорошо определяемые области согласно их удерживанию на колонке с привитой Сі8-фазой. Гидрофобность определяли как отношение площадей этих областей. Хотя различие в гидрофобности между несколькими образцами меньше, чем точность метода (5%), было отмечено влияние источника происхождения образца на его гидрофобные свойства. Определение гидрофобности слабо зависело от ионной силы раствора, но сильно зависело от рН. Авторы данной работы считали, что влияние рН может быть предсказано из свойств ГВ. Гидрофобность исследованных веществ определялась количеством кислотных групп и их природой (константами диссоциации карбоксильных и фенольных групп). RP-HPLC-метод приемлем для смесей высоколипофильных соединений неизвестного строения. Однако результаты, полученные в работе [66], показали что полных данных о гидрофобности веществ с помощью RP-HPLC получить нельзя. Разные корреляции Kow с Кг для разных типов соединений будут приводить к систематическим ошибкам в определении log K ,w. Различия также могут быть связаны с различными эффектами специфического взаимодействия веществ со стационарной фазой. Таким образом, на величину log KoW будет сильно влиять выбранный тип стандартных соединений. Kow определяют также с помощью метода QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationships), основанного на количественной взаимосвязи между структурой и свойством вещества [58, 67, 68]. Предполагается, что свойства химических веществ могут быть определены исходя из их химической структуры [69]. Модель QSAR— это математическое уравнение, с помощью которого можно описать любое свойство вещества. Это уравнение выражает количественную связь между структурой вещества и его свойствами. В QSAR используются так называемые дескрипторы химической структуры (число или математический параметр), которые характеризуют структуру органического соединения, причём так, что подмечаются какие-то важные черты этой структуры. В качестве дескриптора может выступать любое число, которое можно рассчитать из структурной формулы — молекулярный вес, число определённых атомов, связей или групп, молекулярный объём, частичные заряды на атомах и др.
Биосинтез меченых соединений
Получение меченых соединений, основанное на превращении низшими организмами и растениями простых по составу радиоактивных веществ в сложные природные соединения, привлекательно тем, что гарантирует получение физиологически активных соединений. Наибольшее распространение получил биосинтез соединений, меченных радионуклидом ,4С. Используя в качестве среды выращивания ИСС 2 и меченые бикарбонаты, удается получить большое число биологически активных соединений, меченных по углероду. Биосинтез меченных тритием соединений с использованием в качестве субстрата тритиевой воды гораздо сложнее из-за лабильности атомов водорода и высоких дозовых нагрузок на культуры микроорганизмов [123]. Чтобы молярная радиоактивность соединения оказалась 1 ТБк/моль (27 Ки/моль), необходима тритиевая вода с удельной радиоактивностью не менее 0,05 ТБк/мл (1,35 Ки/мл). В результате даже для столь малых удельных активностей предполагаемых продуктов успех синтеза ставится под сомнение ввиду сильного угнетения культуры радиацией трития. Значительно более полезными для биосинтеза меченых биологических молекул оказываются меченные тритием их компоненты: аминокислоты, углеводы, нуклеотиды и нуклеозиды, глицерин, жирные кислоты [124, 125]. В этом случае радиационные эффекты играют меньшую роль ввиду разбавления системы другими немечеными компонентами, а процент усвоения радиоактивных веществ оказывается выше. К данной группе методов необходимо отнести и использование ферментов для превращения меченых субстратов в конечные меченые продукты [126,127]. 1.73. Изотопный обмен Изотопный обмен является наиболее предпочтительным методом введения тритиевой метки, так как не требует синтеза специальных предшественников. Реакции изотопного обмена чаще всего используются для введения тритиевой метки в физиологически активные соединения. Это связанно с тем, что эти соединения имеют довольно сложное строение, доступны в малых (миллиграммы) количествах. К тому же для введения метки в такие соединения с помощью химических методов синтеза требуется предварительная модификация соединения, что бывает затруднительно по указанным выше причинам. Реакции изотопного обмена, которые наиболее часто используются для введения тритиевой метки, можно классифицировать следующим образом: гомогенный изотопный обмен, катализируемый кислотами, основаниями, растворимыми солями переходных металлов или их комплексами; гетерогенный жидкофазный изотопный обмен, катализируемый металлами VIII группы периодической системы (Pt, Pd, Со, Ni, Ru, Rh, Ir); твердофазный изотопный обмен, при котором смесь твердого органического соединения и катализатора обрабатывают газообразным тритием.
Изотопный обмен с тритиевой водой. Этот метод широко применяется для синтеза большого количества меченых дейтерием и тритием соединений. Реакция проводится в водном растворе в сильно щелочной или сильно кислой среде. Тритий содержащим растворителем обычно бывает тритиевая вода. Используется как кислотный, так и щелочной катализ, растворимые и гетерогенные катализаторы на основе переходных металлов, также изотопный обмен при повышенных температурах. Удельная радиоактивность соединений, получаемых этим методом, ограничена удельной радиоактивностью применяемой тритиевой воды. Обычно эта величина не превышает 3-6% от теоретического значения [128]. Тритиевая вода с более высокой удельной радиоактивностью не стабильна из-за саморадиолиза. Однако этого можно избежать, применяя в реакциях изотопного обмена раствор высоко радиоактивной тритиевой воды в инертном безводном органическом растворителе [129]. С помощью изотопного обмена с тритиевой водой были получены целый ряд стероидов (молярные радиоактивности от 0.2 до 0.4 ПБк/моль), Сахаров (0.24-0.26 ПБк/моль), гиббереллинов (0.18-0.20 ПБк/моль), фузикокцина Н (0.4 ПБк/моль) [130]. Таким образом, данный метод применим для введения метки практически в любое соединение, однако необходимо корректировать условия проведения реакции с учетом устойчивости препаратов. Жидкофазный изотопный обмен. Метод основан на реакции изотопного обмена газообразного трития с водородом соединения, растворенного в соответствующем растворителе, в присутствии гетерогенного платинового или палладиевого катализаторов [131]. Большое влияние на степень изотопного обмена оказывают растворители. Лучше всего проводить реакцию изотопного обмена в диоксановых растворах. Величины удельных активностей получаемых этим методом соединений лежат в широком диапазоне, вплоть до теоретических при замене одного атома водорода тритием. Метод не требует синтеза специальных предшественников, технически прост и позволяет синтезировать широкий класс физиологически активных соединений с удовлетворительными характеристиками. К недостаткам метода можно отнести то, что в данных условиях могут протекать нежелательные побочные процессы, такие как дегалогенирование, гидрирование и восстановление различных функциональных групп [129]. Твердофазный изотопный обмен. Сущность метода состоит в обработке газообразным тритием твердой смеси предшественника и катализатора. Для интенсификации процесса используют нагревание реакционной смеси. Твердофазный каталитический изотопный обмен является сложным процессом, на течение которого оказывают влияние многочисленные факторы, связанные как со свойствами органических соединений, так и с особенностями катализаторов [132]. Степень изотопного замещения зависит от: - природы металла катализатора (Pt, Pd, Rh, Rh) — природы носителя (BaS04, СаСОз, АЬОз, Si02, С) — соотношения катализатор — соединение - температуры реакции Найдено, что в интервале температур 150-170 С наблюдается резкое увеличение скорости изотопного обмена, что приводит практически к полному изотопному замещению водорода на тритий. Для соединений относительно простого строения может быть достигнуто практически полное изотопное замещение водорода тритием.
aВарьирование состава твердой фазы и температуры дает широкие возможности целенаправленного изменения выхода и молярной радиоактивности целевых соединений. Влияние различных условий проведения процесса на выход меченого продукта и его удельную радиоактивность подробно изучены [14, 129]. При этом был выведен целый ряд закономерностей. Во-первых, для всех исследованных соединений при увеличении температуры и соотношения вещество-катализатор наблюдается рост удельной радиоактивности меченого вещества при одновременном снижении его выхода. Во-вторых, существенную роль в процессах изотопного обмена играет природа носителя палладиевого катализатора. Например, было установлено, что эффективность носителей палладиевых катализаторов в реакции каталитического гидрирования адениновых нуклеозидов падает в следующем ряду: Pd/СаСОз Pd/BaS04 Pd/АЬОз Pd/C. Для пуриновых оснований наиболее эффективным носителем палладиевого катализатора является карбонат кальция. Для остальных исследованных соединений таким носителем является сульфат бария. Метод твердофазного изотопного обмена, также как и другие реакции изотопного обмена, не требует синтеза специальных предшественников, а возможности более полного изотопного замещения водорода тритием у него существенно выше. К недостаткам метода можно отнести деградацию термически лабильных соединений, протекание параллельных реакций гидрирования, дегалогенирования и восстановления различных функциональных групп. Однако в ряде случаев, эти недостатки не являются решающими [133]. Огромную роль при осуществлении твердофазного варианта изотопного обмена играет образующийся на активных центрах катализатора активированный тритий, который способен мигрировать по инертной подложке (спилловер водорода) и с нее в массу субстрата, обмениваясь на водороды органических молекул [134]. Явление спилловера водорода активно исследуется в настоящее время [135, 136, 137, 138], что может открыть новые перспективы в использовании метода твердофазного изотопного обмена для получения меченых тритием соединений. В отдельную группу методов получения меченных тритием соединений выделяют методы, использующие ядерно-химические процессы, протекающие при ядерных реакциях и распаде радиоактивных ядер [15]. Безусловно, эти методы сыграли свою роль при исследовании процессов с участием горячих атомов. Однако практическая значимость с точки зрения получения меченых соединений у них оказалась невысока.
Удаление трития из лабильных положений молекул
Для удаления трития из лабильных положений молекул ГВ проводили диализ в фосфатном буфере с концентрацией 0.028 М при рН 6.8 через мембраны соответствующего размера (номинальный предел отсечения мембраны по молекулярному весу (MWCO) от 2 до 12 кДа (Merk,Germany)) в течение не менее 30 суток при 4С до тех пор, пока радиоактивность буфера не стабилизировалась. Подбором размера пор мембраны минимизировали потери препарата во время диализа и регулировали его молекулярно-массовое распределение. Для удаления трития из лабильных положений низкомолекулярных модельных соединений дважды проводили лиофилизацию водных или водно-спиртовых растворов. 2.5.4. Хроматографический анализ Тонкослойная хроматография Тонкослойную хроматографию (ТСХ) использовали для анализа меченных тритием аминокислот и КПАВ, а также для предварительной очистки меченых аминокислот перед их анализом на аминокислотном анализаторе. Тонкослойную хроматографию меченых аминокислот и КПАВ проводили в системе бутанол - уксусная кислота — вода в объёмном соотношении 3:1:1 (БУВ) на пластинках Silufol. Одновременно с меченым образцом ставили ТСХ немеченого стандарта для нахождения положения нужного вещества на пластинке. Положение аминокислот на пластинке определяли с помощью нингидринового реагента, а КПАВ с помощью йодной камеры. Для измерения радиоактивности пластинок ТСХ после хроматографического разделения на высушенную пластинку равномерно наносили 0.1-0.15 мл сцинтилляциошюй жидкости Scintilene BD и заклеивали с двух сторон скотчем. Подготовленную таким образом хроматограмму помещали в сканер радиоактивности «Бетахром» и проводили сканирование. Аналоговый сигнал с прибора записывали с помощью АЦП, преобразовывали в цифровой сигнал и фиксировали в виде файла на компьютере с помощью специальной программы Power Graph. На рисунках 2.4 и 2.5 представлены результаты сканирования типичных хроматограмм аминокислот и КПАВ. Для выбранных условий ТСХ-анализа меченых соединений, полученных при реакции атомарного трития с мишенями индивидуальных веществ (кроме аспарагиновой кислоты и лизина), радиоактивные примеси и меченые побочные продукты имели Rf, существенно отличающиеся от Rf меченого материнского соединения.
Соответственно, из распределения радиоактивности по пластинке находили радиохимический выход меченых соединений, который был равен отношению площади пика меченого материнского соединения к общей радиоактивности пластинки. Меченые продукты, которые нельзя было разделить с помощью ТСХ, анализировали с помощью аминокислотного анализатора Amino Asid Analyzer 835. Такие же анализы бьши сделаны для всех изучаемых аминокислот для подтверждения данных анализа ТСХ. В этом случае проводили предварительную очистку препаратов с помощью ТСХ в системе БУВ. Соответствующую зону выделяли и меченые аминокислоты элюировали водой. Выделенные с помощью ТСХ меченные тритием аминокислоты и глюкозамин анализировали с помощью аминокислотного анализатора Amino Asid Analyzer 835 (Hitachi, Япония) по стандартной методике Спэкмэна, Штэйна и Мура [189]. Измерение радиоактивности проводили с помощью проточного счетчика Radiomatic 150TR Flow Scintillation Analyzer (Packard Instrument Co., США) согласно методике [190], а также собирали фракции и их радиоактивность считали на жидкостном сцинтилляционном спектрометре RackBeta (Финляндия). Данные, поступающие с аминокислотного анализатора и проточного счетчика (оптическое поглощение элюата при длинах волн 570 и 440 нм и радиоактивность элюата), обрабатывали с помощью программы "МультиХром для Windows" (ЗАО "Амперсенд", Россия). Конечным результатом эксперимента являлись величины молярной радиоактивности аминокислот, полученные путем деления их радиоактивности на количество по данным аминокислотного анализа. 2.5.5. Определение молекулярно-массового распределения ГВ После удаления трития из лабильных положений ГВ проводили анализ распределения метки по компонентам ГВ с помощью эксклюзионной хроматографии [191]. Гель-хроматографическое фракционирование препаратов проводили на хроматографической системе Abimed, включающей в себя: ВЭЖХ насос, автосамплер, стеклянную колонку (015 мм, L = 25CM), спектрофотометрический УФ-детектор, коллектор фракций, плату АЦП для регистрации аналитического сигнала и регистрирующий компьютер. Колонку заполняли гелем "Toyopearl" TSK HW-55S (Toso-Haas, Япония) С диапазоном фракционирования 1000-200 000 Да по полидекстранам. В качестве подвижной фазы использовали 0.028 М фосфатный буфер с рН 6.8. Проба объемом 1 мл автоматически отбиралась и поступала в систему, затем проходила через колонку и на выходе из нее детектировалась (рисунок 2.6). Аналитический сигнал регистрировали спектрофотометрически при длине волны 254 нм, чувствительность детектора составляла 0.01 у.е. от полной шкалы, скорость потока элюента -1 мл/мин. Для получения хроматографического профиля по радиоактивности меченого препарата собирали фракции объемом 1.5 мл. Радиоактивность фракций измеряли в сцинтилляционной жидкости OptiPhase HiSafe 3 (Perkin Elmer, Великобритания) на сцинтилляционном спектрометре RackBeta 1215 (LKB Wallac, Финляндия).
Контроль равномерности введения тритиевой метки осуществляли с помощью сравнения профилей выхода с колонки исходного и меченого препаратов по УФ-поглощению при 254 нм, а также по профилю радиоактивности меченого препарата. О наличии продуктов распада судили по характеру профиля радиоактивности, а именно, по присутствию дополнительных радиоактивных продуктов, не обладающих УФ-поглощением. 2.5.6. Исследование гидрофобных и поверхностно-активных свойств гуминовых веществ Исследование гидрофобных и поверхностно-активных свойств меченных тритием препаратов ГВ проводили с использованием метода сцинтиллирующей фазы, основы которого заложены в работах [13,109] Эксперимент проводили в стандартных сцинтилляционных полиэтиленовых флаконах диаметром 1.5 см. Во флакон сначала вносили 0.8 мл раствора меченого вещества, а затем сверху аккуратно добавляли 3 мл толуола, содержащего 2.5-дифенилоксазол в количестве 0.45 % по массе. После добавления органической фазы флакон помещали в жидкостной сцинтилляционный спектрометр RackBeta 1215 и измеряли его радиоактивность через определенные промежутки времени. После уравновешивания системы (на 5-6 сутки) отбирали 2 мл органической фазы в другой флакон и измеряли скорость счета отобранной органической фазы и остатка. Количество препарата, перешедшего в органическую фазу и сконцентрированного на границе раздела толуол - водный раствор, рассчитывали, исходя из эффективности регистрации трития в объёме органической фазы єу = 0.55±0.03 и на поверхности раздела фаз es = 0.5-су. Коэффициент распределения вещества между водной и органической фазой определяли по соотношению D = corg /cw. В независимых экспериментах исследовали распределение ГВ между водной фазой и октанолом. В этом случае для определения концентрации меченого препарата проводили отбор проб из водной и октанольной фаз и измеряли их радиоактивность в сцинтилляционной жидкости OptiPhase HiSafe 3. С помощью меченных тритием ГВ и метода сцинтиллирующей фазы были найдены величины адсорбции ГВ на границе раздела фаз двух жидкостей, а также построены изотермы адсорбции. 2.5.7. Исследование взаимодействия гуминовых веществ с бактериями и растениями Полученные в рамках данной работы меченные тритием препараты ГВ были использованы для исследования их поступления в клетки бактерий Escherichia coli и растения мягкой пшеницы Triticum aestivum L. Эксперименты с соответствующими биотестами проводились к.б.н. Куликовой Н.А. (каф. общего землеведения факультета почвоведения МГУ) на базе института биохимии им. Баха РАН и факультета почвоведения МГУ.
Характеристика меченных тритием гуминовых веществ
При выполнении работы было получено 28 меченных тритием препаратов ГВ из различных источников происхождения (10 групп). В таблицах 3.2 и 3.3 приведены данные по удельной радиоактивности и выходу некоторых меченых препаратов ГВ. При малых временах реакции (до 10 с), давлении трития 0.5 Па, температуре атомизатора от 1900 до 2000 К, массе мишени 0.25-0.35 мг и при использовании диализных мембран MWCO 2кДа достигались удельные радиоактивности 0.2-0.7 ТБк/г. Наибольшая удельная радиоактивность получена для ГК угля, в структуру молекул которого наибольший вклад вносит гидрофобно-ароматический каркас, а наименьшая для ФК почв и торфа с сильно-окисленным ядром и развитой углеводно-пептидной периферией. Полученные меченые препараты могут быть использованы для проведения химических и биохимических исследований с регистрацией их количества по радиоактивности. В работе для определения поверхностной активности и гидрофобности меченных тритием ГВ использовали метод сцинтилирующей фазы (СФ) [13]. Метод СФ основан на том, что за поведением меченного тритием вещества следят по его излучению, которое регистрируется в органической фазе (сцинтиллирующая жидкость на основе толуола) с помощью жидкостного сцинтилляционного спектрометра. Учитывая малый пробег бета-частиц трития, также происходит регистрация излучения из тонкого (около 1 мкм) слоя водной фазы, что позволяет непосредственно определять количество поверхностно-активных веществ на границе раздела двух жидкостей. Важным достоинством такого подхода является возможность непрерывного измерения скорости счета меченного тритием вещества без нарушения целостности системы. Так как ГВ представляют собой смесь веществ, то определяемые с помощью метода СФ параметры являются усреднением по всему ансамблю молекул. Однако такая усредненная характеристика, как это будет показано далее, адекватно отражает свойства исследованных препаратов. В данной работе был предложен ряд усовершенствований метода СФ, позволяющих использовать его как для исследования кинетики адсорбции, так и равновесной адсорбции веществ самой разной природы на границе раздела органическая «сцинтиллирующая фаза» - водный раствор, а также для определения коэффициента распределения веществ в этой системе.
Так как регистрация излучения трития в рассматриваемой системе возможна из органической фазы и из тонкого слоя водного раствора на границе раздела фаз, то скорость счета слагалась из двух составляющих: «объемной» составляющей (1у), обусловленной регистрацией излучения меченого соединения, растворенного в толуоле, и «поверхностной» составляющей (Is), относящейся к регистрации бета-излучения трития из тонкого (около 1 мкм) поверхностного слоя водной фазы на границе раздела с органической фазой где corg и cw - концентрации меченого соединения в органической и водной фазах, Г-величина удельной адсорбции ПАВ на границе раздела фаз, еу -эффективность регистрации излучения в органической фазе, V - объем органической фазы, S - площадь границы раздела, h - толщина зоны водной фазы, из которой возможна регистрация излучения трития, а - удельная радиоактивность меченого соединения. Эффективность регистрации трития в объеме органической фазы определяли с помощью методов внешнего и внутреннего стандартов. В соответствии с данными работы [193] эффективность регистрации с поверхности раздела фаз принимали равной 0.5ву для адсорбционных слоев ПАВ и 0.27єу для регистрации излучения из приповерхностного слоя водной фазы, ограниченного пробегом бета-частиц трития в воде, что и отражено в выражении 3.2. Вклад составляющей «объемной концентрации» вещества в водной фазе в скорость счета всей системы может быть существенным при исследовании концентрированных растворов веществ с неярко выраженными поверхностно-активными свойствами. Для препаратов ГВ этот член в выражении 3.2 был существенно меньше, чем вклад адсорбционных слоев. Однако при исследовании аминокислот была показана необходимость учета этой составляющей. Для разделения вклада «объемной» (3.1) и «поверхностной» (3.2) составляющих в скорость счета препарата использовали два способа. По первому способу готовили серию образцов с разным количеством органической фазы. Определяли зависимость равновесной скорости счета препарата от объема толуола, аппроксимировали экспериментальные значения прямой, по углу наклона определяли «объемную» составляющую скорости счета и концентрацию меченых молекул в толуоле, а «поверхностную» составляющую находили экстраполяцией скорости счета к нулевому объему толуола. По второму способу определения 1у и Is к водному раствору меченого вещества добавляли V мл органической фазы, после достижения равновесия в системе измеряли скорость счета флакона (I), отбирали в другой флакон Vi мл органической фазы и повторно измеряли скорость счета отобранного раствора (її) и остатка (Ь). «Объемную» и «поверхностную» составляющие рассчитывали по следующим выражениям: Расхождение между значениями «поверхностной» составляющей скорости счета, рассчитанной разными способами, не превышало 5 %. Обычно использовали 3 мл органической фазы, после уравновешивания системы отбирали 2 мл раствора. Начальную концентрацию меченого соединения в водной фазе определяли, отбирая аликвоту раствора и измеряя ее радиоактивность.
Равновесную концентрацию меченого соединения в водной фазе (cw) рассчитывали, учитывая переход вещества в органическую фазу и его концентрирование на межфазной границе, а также контролировали в отдельных экспериментах, отбирая аликвоты на счет. Коэффициент распределения вещества между водной и органической фазой определяли по соотношению D = corg /cw. В отличие от первоначального варианта метода [13] вместо стандартного стеклянного флакона объемом 20 мл, использовали полипропиленовый флакон объемом 7 мл, что принципиально изменило геометрию раздела границы фаз. Так как в случае стеклянного флакона в классическом варианте метода СФ водная фаза смачивала его поверхность и образовывался вогнутый мениск границы раздела фаз, то существенный вклад в скорость счета с границы раздела фаз вносила поверхность, непосредственно прилегающая к стенкам флакона, что затрудняло интерпретацию результатов. В частности, принимая площадь поверхности раздела равной 8.5 см2, были найдены значительно более высокие значения адсорбции бычьего сывороточного альбумина на границе раздела толуол-вода [109] по сравнению с данными других работ [194, 195]. В случае полипропиленового флакона водная фаза не смачивала его стенки и образовывался выпуклый мениск, а при объеме водной фазы меньше 0.7 мл водная фаза представляла собой каплю на дне флакона. В этом случае практически можно было пренебречь трехфазным контактом стенка флакона - водная фаза - органическая фаза [196]. Таким образом, стало возможным использовать два варианта проведения эксперимента в пластиковом флаконе малого размера: в виде двухслойной и капельной систем. Двухслойная система реализовывалась при объеме водной фазы более 0.7 мл, при этом объем органической фазы мог составлять от 2 до 5 мл. Капельная система реализовывалась при объемах водной фазы менее 0.6 мл. На рисунке 3.7 показана зависимость скорости счета флакона от объема водной фазы, представляющей собой 0.2 мкМ раствор Н-СТАВ, к которому добавляли 3 мл толуолыюй органической фазы. Видно, что для капельной системы скорость счета флакона росла с увеличением объема водной фазы, а при образовании двухслойной системы скорость счета не зависела от объема водной фазы. Аналогичные зависимости получены для двухфазных систем с исходной концентрацией СТАВ в водном растворе 0.03 и 0.43 мМ.
