Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 15
Состав выдыхаемого воздуха 15
О применении анализа выдыхаемого воздуха в медицинской диагностике 17
Окислительный (оксидативный) стресс 19
Используемые для анализа выдыхаемого воздуха методы 20
Подробности по проведению ГХ/МС анализа выдыхаемого воздуха 22
Перенос вещества в хроматограф 23
Концентрирование из выдыхаемого воздуха 23
Пробоотбор 26
Конденсат выдыхаемого воздуха 30
Методы ввода больших проб в капиллярный газовый хроматограф 40
Выводы из литературного обзора 44
ГЛАВА 2. Оборудование и материалы, методика эксперимента 46
Оборудование 46
Исходные вещества и материалы 47
Модельные смеси 47
Методика проведения эксперимента 49
Выбор условий хроматографического разделения и масс- спектрометрического детектирования 49
Эксперимент по изучению сорбции и термодесорбции модельных соединений 50
Эксперимент по вводу больших проб 51
ГЛАВА 3. Исследование условий ГХ/МС определения следовых количеств модельных соединений 52
Газохроматографическое разделение веществ, входящих в состав модельных смесей 52
Масс-спектры модельных соединений, полученные методом электронной ионизации 55
Определение пределов обнаружения веществ, входящих в состав модельных смесей 60
Отношение сигнал/шум 60
Вычисление пределов обнаружения 61
Экспериментальные значения пределов обнаружения 63
Масс-спектрометрическое определение альдегидов и кетонов в режиме химической ионизации 65
ГЛАВА 4. Исследование возможности снижения пределов обнаружения исследуемых модельных соединений за счёт ввода больших по объёму проб off-line с предварительным удалением растворителя в присутствии сорбента вне аналитической системы 74
Изучение влияния сорбента на процессы сорбции и термодесорбции модельных соединений 74
Изучение и оптимизация условий термодесорбции веществ из модельной смеси 79
Разработка способа определения ультраследовых количеств среднелетучих органических соединений различной полярности в органических растворах, основанного на вводе больших проб off line и ГХ/МС анализе всего концентрата аналитов 88
Экстракция веществ модельной смеси из водного раствора 90
Ввод больших проб экстрактов из водных растворов модельной смеси 93
Анализ 1 мкл экстракта конденсата выдыхаемого воздуха 94
Анализ 100 мкл экстракта из конденсата выдыхаемого воздуха с
использованием разработанного способа анализа водных растворов 96
4 ГХ/МС анализ образцов экстракта из конденсата выдыхаемого воздуха с детектированием в режиме химической ионизации 102
ГЛАВА 5. Исследование состава среднелетучих примесей, присутствующих в образцах конденсата выдыхаемого воздуха здоровых людей, больных астмой и хронической обструктивной болезнью лёгких 104
Заключение 109
Благодарности ПО
Выводы 111
Список литературы 113
Приложение 1 126
Приложение 2 129
Приложение 3 142
- О применении анализа выдыхаемого воздуха в медицинской диагностике
- Выбор условий хроматографического разделения и масс- спектрометрического детектирования
- Масс-спектры модельных соединений, полученные методом электронной ионизации
- Изучение и оптимизация условий термодесорбции веществ из модельной смеси
Введение к работе
Работа посвящена определению среднелетучих органических веществ в водном конденсате выдыхаемого воздуха человека (КВВ). КВВ — биологический объект, интерес к изучению которого возник в начале 80-х годов XX века. Это было связано с необходимостью разработки новых способов диагностики заболеваний лёгких на ранней стадии (причём, желательно неинвазивных способов диагностики). Привлекательность данного способа заключается в простоте схемы сбора конденсата, возможности проводить эту процедуру многократно без нанесения вреда человеческому организму.
Применение метода хромато-масс-спектрометрии для определения среднелетучих органических соединений в различных объектах (в том числе водных) широко распространено. Существует определённый ряд трудностей для использования*данного метода при анализе КВВ, таких как чрезвычайно низкое содержание определяемых компонентов, большое число компонентов^ для разделения и идентификации, возможная нестабильность ряда компонентов. В данной работе было уделено особое внимание возможности.. определения среднелетучих термостабильных органических соединений различной полярности на ультраследовом уровне в водных растворах и КВВ.
Для уменьшения пределов обнаружения газохроматографического определения веществ в органических растворах применяют различные способы ввода больших по объёму проб органических растворов (экстрактов). в инжектор газового хроматографа. Увеличение объёма вводимой пробы с 1 до 100 мкл позволяет в некоторых случаях уменьшить значения пределов обнаружения в соответствующее число раз.
КВВ рассматривался в этой работе как самостоятельный объект для анализа. Для сбора КВВ не существует общепринятой методики, однако довольно распространён способ, основанный на использовании установки, производимой серийно. Используемый при этом порядок действий при сборе
8 КВВ? основан на последних представлениях о динамике образования конденсата и данных о стабильности различных определяемых компонентов в данной матрице..Объём пробы конденсата, как правило, не превышает 3 мл..
Актуальность темы.
Исследованию химического состава выдыхаемого воздуха, с целью изучения возможности' диагностики различных лёгочных заболеваний посвящено большое число- работ. Это связано* с: тем, что* применяемые в медицине инструментальные: методы диагностики не: обеспечивают высокой степени достоверности на ранних: стадиях заболеваний, что приводит к неправильному лечению- и связанным;, с ним негативным последствиям.. Подавляющее болыдинство*публикаций;по выдыхаемому воздуху посвящено исследованию состава, газообразных, легколетучих щ, в меньшей- степени; среднелетучих органических соединений, которые концентрируют с: использованием адсорбции' и, реже, абсорбции с последующим анализом.1 малош части абсорбата.Наиболее эффективныйметод анализа;. используемый в; данной, области; основан* на. газохроматографическом разделении' в; комбинации!; с. различными- методами; детектирования; Масс-спектрометрическое: детектирование позволяет производить одновременное определение веществ; разных: классов; Однако; анализ газообразной! части* выдыхаемого воздуха неадекватноjотражает состав?выдыхаемых эндогенных: соединений: в связи с тем, что* многие летучие и среднелетучие соединенияі могут поступать в лёгкие из:окружающей среды.
Отдельно; выделяют такой объект, как водный конденсат выдыхаемого* воздуха, получаемый- путём охлаждения? выдыхаемого воздуха» до-температуры, -10С В настоящее время: существует множество^ (сотни)? публикаций; по анализу КВВ; В подавляющем; большинстве из них речь идёт об! определении нелетучих, органических соединений различными: методами. В; литературе известны лишь единичные публикации по исследованию состава среднелетучих примесей в КВВ; Концентрации- присутствующих в
9 КВВ летучих и среднелетучих органических соединений очень низкие (10"7% по массе и ниже), и состав их практически неизвестен.
Изучение состава смеси этих примесей в КВВ представляет несомненный интерес в связи с возможностью использования полученных данных в целях диагностики лёгочных заболеваний. Анализ среднелетучих примесей, сконцентрированных в КВВ, может лучше отражать состав выдыхаемых органических соединений, по сравнению с анализом адсорбата или абсорбата выдыхаемого воздуха. Продукты жизнедеятельности организма попадают из различных органов в кровь, из крови-в межклеточную жидкость лёгких, а оттуда на поверхность слизистой и в аэрозоль, который затем'собирают в конденсоре. Для исследования состава смесей соединений, содержащихся в КВВ, актуальна разработка способа их одновременного определения на ультраследовом уровне, так как существующие способы не обеспечивают такой возможности.
В связи с этим, целью настоящей работы являлась разработка способа определения среднелетучих органических соединений,различной,полярности на ультраследовом уровне в КВВ методом ГХ/МС и изучение состава смесей зарегистрированных этим способом соединений, выделенных из образцов КВВ, собранных у здоровых, больных бронхиальной астмой и хронической обструктивной болезнью лёгких (ХОБЛ) людей.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: изучить литературные данные о составе смесей^ среднелетучих органических соединений в выдыхаемом воздухе-и КВВ и. составить на основе этих данных модельные смеси; а выбрать оптимальные условия хроматографического разделения. модельных смесей среднелетучих органических соединений, которые могут присутствовать в выдыхаемом воздухе, согласно литературным данным; а изучить масс-спектры электронной и химической ионизации ряда выбранных модельных соединений и определить пределы детектирования в обоих режимах ионизации; а разработать способ сорбционного концентрированиях одновременным удалением растворителя из больших проб органических растворов модельных среднелетучих органических соединений различной полярности и перевода всего концентрата аналитов в хромато-масс-спектрометр; а изучить жидкостную экстракцию модельных соединений различной полярности из водных растворов с использованием высаливания при их содержании в растворе на уровне 10"8 - 10'6%; а разработать способ определения ультрамалых содержаний среднелетучих органических соединений различной полярности в водных растворах, основанный на жидкостной экстракции с предварительным высаливанием, удалении растворителя в присутствии сорбента из пробы экстракта и ГХ/МС анализе всего концентрата; и использовать его для изучения состава смесейг среднелетучих примесей в КВВ; с использованием разработанного способа провести анализ 3-х серий образцов КВВ, собранных у здоровых, больных ХОБЛ и больных бронхиальной астмой (не менее 10-ти образцов в каждой серии); сравнить результаты анализа 3-х серий образцов КВВ, с целью выявления возможности использования разработанного способа анализа КВВ и полученных данных для диагностики лёгочных заболеваний.
Научная новизна.
Исследовано сорбционное концентрирование из органических растворов ультраследовых количеств модельных соединений различной полярности и летучести с удалением растворителя в процессе концентрирования вне аналитической системы и перевод концентрата термодесорбцией в хромато-масс-спектрометр:
Разработан способ определения среднелетучих органических соединений различной полярности в органических растворах, основанный на удалении растворителя из пробы большого объёма (100 мкл) раствора в присутствии сорбента, термодесорбции концентрата и его ГХ/МС анализе. Пределы обнаружения— 10"8 - 10"б%.
Изучена жидкостная экстракция' ультрамалых количеств модельных соединений с предварительным высаливанием из водных растворов*.
Разработан, способ определения среднелетучих органических соединений различной полярности в водных растворах, основанный на жидкостной экстракции с предварительным высаливанием, отборе пробы экстракта и её концентрировании с удалением, органического растворителя* вне аналитической системы, в. присутствии сорбента, термодесорбции и ГХ/МС анализе концентрата анализируемой пробы. Пределы, обнаружения-составили величины порядка15x10"9 - 5х10"7%.
С использованием, разработанного* способа, анализа водных растворов; изучен состав смесей, среднелетучих "органических соединений,, присутствующих в- образцах КВВ здоровых людей, больных бронхиальной астмой' и ХОБЛ, и обнаружено присутствие в КВВ' большого числа органических соединений, относящихся к различным классам, содержащихся-' на уровне 10"8 - 10"6%, из которых идентифицировано 33'соединения.
Проведено сопоставление результатов анализа для трёх групп образцов. КВВ (собранных у 30-ти здоровых людей, 20-ти больных бронхиальной астмой и 20-ти больных ХОБЛ) по 40-ка обнаруженным компонентам. С использованием алгоритма, основанного на линейных методах теории-распознавания образов, показано, что здоровых и больных бронхиальной астмой, можно различить с надёжностью 75%, здоровых и*больных ХОБЛ— с надёжностью 85%, больных бронхиальной астмой и ХОБЛ — с надёжностью 83%.
Выявлена группа веществ, которые могут рассматриваться как потенциальные маркеры бронхиальной астмы и ХОБЛ.
Практическая значимость работы.
Разработанные способы определения среднелетучих органических соединений различной полярности в органических и водных растворах нашли применение при изучении состава проб КВВ здоровых, больных бронхиальной астмой и больных ХОБЛ.
В результате их применения показана возможность дифференциации здоровых, больных бронхиальной астмой и больных ХОБЛ с высокой' достоверностью. Разработанные способы могут найти применение при изучении возможности неинвазивной диагностики заболеваний путём исследования состава КВВ.
На защиту выносятся:
Способ определения ультраследовых содержаний среднелетучих органических соединений различной полярности в органических растворах, основанный на сорбционном концентрировании аналитов с удалением. растворителя в процессе концентрирования вне аналитической системы, термодесорбции и ГХ/МС анализе концентратам " *
Способ определения ультраследовых содержаний среднелетучих органических соединению различной полярности в водных растворах и конденсате выдыхаемого воздуха, основанный на жидкостной экстракции с высаливанием, сорбционном концентрировании аналитов из экстракта с удалением растворителя в процессе концентрирования вне аналитической* системы, термодесорбции и ГХ/МС анализе концентрата.
Перечень среднелетучих органических веществ обнаруженных в образцах КВВ, с использованием разработанного способа.
Результаты определения состава смесей среднелетучих органических соединений, обнаруженных в 70-ти образцах проб КВВ (30 - для здоровых, 20 - для больных бронхиальной астмой и 20 — для больных ХОБЛ).
Результаты сравнения состава образцов КВВ, собранных у здоровых, больных ХОБЛ и больных бронхиальной астмой, показывающие
13 возможность различия между собой здоровых, больных астмой и больных ХОБЛ.
Группа обнаруженных в КВВ веществ, которые можно рассматривать как потенциальные маркеры заболеваний: ХОБЛ и бронхиальной астмы.
Апробация работы.
Основные результаты работы были представлены на всероссийском симпозиуме «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях» (23-27 апреля 2007 г., Москва) и на всероссийской конференции с международным участием «Масс-спектрометрия и её прикладные проблемы» (12-16 сентября 2005 г., Москва).
Публикации.
Результаты работы представлены в 5 публикациях (2 статьи и 3 тезиса докладов).
Структура и объём работы.
Диссертация состоит из введения, в котором отражены цель и основные задачи, актуальность, научная новизна, практическая значимость т апробация работы, пяти глав, заключения, выводов, списка литературы и трёх приложений.
В первой главе приведён обзор литературы по анализу выдыхаемого воздуха и КВВ. Также там есть раздел, посвященный методам ввода больших проб органических растворов в капиллярный газовый хроматограф.
Во второй главе представлен список использованных в работе веществ и материалов, а также оборудования. Описана методика эксперимента. В третьей, четвёртой и пятой главах последовательно описаны результаты проведённых экспериментов по разработке способа определения среднелетучих органических соединений различной полярности в органических, водных растворах и КВВ методом ГХ/МС с предварительным сорбционным концентрированием пробы органического раствора либо жидкостного экстракта объёмом 100 мкл с удалением растворителя вне аналитической системы и вводом концентрата путём термодесорбции в
14 хромато-масс-спектрометр, определению среднелетучих органических соединений в КВВ с использованием разработанного способа, изучению состава образцов КВВ трёх серий (здоровых людей, больных ХОБЛ, больных бронхиальной астмой) со сравнением полученных результатов.
В приложении 1 приведён краткий список соединений, обнаруженных в выдыхаемом воздухе человека и относящихся к различным классам. В приложении 2 приведены рисунки масс-спектров электронной ионизации модельных соединений, использованных в настоящей работе. В приложении 3 — масс-спектры всех характеристичных соединений, обнаруженных во всех изученных образцах КВВ.
Материал диссертации изложен на 158 страницах, содержит 88 рисунков и 25 таблиц. Список литературных источников состоит из 108 наименований.
О применении анализа выдыхаемого воздуха в медицинской диагностике
В постановке цели работы мы исходили из предпосылки возможного применения анализа выдыхаемого воздуха на содержание выявленных среднелетучих органических соединений при диагностике заболеваний.. Особый интерес в данном случае представляет выявление веществ-биомаркеров из числа компонентов, находящихся в выдыхаемом воздухе,в следовых и ультраследовых количествах.
Изучение литературы по анализу выдыхаемого воздуха с целью диагностики выявило несколько основных направлений, по которым -проводятся исследования. Проведение анализа воздуха с определением максимального числа компонентов и последующее сравнение состава выдыхаемого воздуха больных и здоровых людей. Изучение биомолекулярных процессов, происходящих при данном заболевании, выделение потенциальных биомаркеров, проверка правильности выбора этих биомаркеров с использованием наиболее чувствительных и селективных методов. Разработка методики быстрого скрининга без количественного и качественного определения индивидуальных компонентов, проведение статистических исследований результатов скрининга большого количества больных и здоровых людей. Остановимся более подробно на каждом из них. К первой группе относится ряд работ, авторы которых проводят ГХ/МС определение летучих органических соединений (ЛОС), сконцентрированных из выдыхаемого воздуха на углеродных сорбентах. За основу для анализа берут методы ТО-14 и ТО-17 (U.S. Enviromental Protection Agency), предназначенные для определения JIOG в атмосферном воздухе на уровне не ниже 1-0,1 ppb. Авторами разработано оригинальное устройство для пробоотбора, предусматривающее прокачку части выдыхаемого воздуха через сорбент с фиксированной скоростью (0,-5 л/мин) и температурой (40С). Температуру поднимают специально для предотвращения сорбции воды. Перед вводом пробы в хроматограф проводят криофокусирование [3,4,7,8,]:
В своей работе авторы делают упор на определение углеводородов, так как алканы нормального и разветвлённого строения-могут быть продуктами окислительного стресса; а, следовательно, и биомаркерами многих заболеваний.
Авторами- проведены исследования- выдыхаемого воздуха большого числа здоровых людей и людей с различными заболеваниями. Из опубликованных данных [7,8] о статистической обработке результатов исследования можно сделать вывод о возможности проведения диагностики путём скрининга углеводородов, содержащихся в выдыхаемом воздухе. Данные подход, однако, подвергается критике, так как в воздухе окружающей среды уже содержится большое количество углеводородов, и определить какие из них относятся к выделяемым организмом, а какие к атмосферным, по мнению ряда авторов, практически невозможно [4]. Следует также отметить, что одновременное определение следовых количеств изомерных углеводородов с использованием идентификации только по библиотекам масс-спектров (как описано в статьях) обладает низкой достоверностью. Ко второй группе относятся работы по изучению механизма окислительного стресса, а также попытки найти взаимосвязь между концентрациями продуктов окислительного стресса в выдыхаемом воздухе и наличием того или иного заболевания. К таким соединениям можно отнести: летучие углеводороды (этан, пентан, гексан), альдегиды (формальдегид, уксусный альдегид и некоторые другие). Как правило, для определения выбирают достаточно чувствительный и селективный метод количественного анализа [9-12].
К третьей группе можно отнести попытку создать систему диагностики, основанную на скрининг-методах, не позволяющих получить информацию о качественном или количественном составе выдыхаемого воздуха. Данный подход был реализован на основе двух аналитических методов: матрицы селективных газовых сенсоров («электронный нос») [13] и масс-спектрометра PTR-MS (химическая ионизация в парах воды припрямом вводе) [14,15]. Проведённые исследования показывают принципиальную возможность медицинской диагностики1 по методу «отпечатков пальцев», однако, сама постановка задачи не позволит выйти за рамгаг скрининг-метода, результаты, которого всегда нужно подтверждать традиционными методами диагностики. Окислительный (оксидативный) стресс Один из наиболее распространённых подходов в диагностике по составу выдыхаемого воздуха основан на определении, концентраций веществ, являющихся продуктами окислительного стресса, сопровождающего воспалительные процессы. Под окислительным стрессом обычно подразумевают процессы радикального окисления биомолекул, происходящие в организме. Окислителями в данном случае являются свободные радикалы или высокореакционноспособные соединения (например, перекись, водорода), которые образуются в результате-процессов, выработки и усвоения энергии в организме (например, основного источника активного кислорода — митохондрий), или попадают в, организм извне, с пищей или воздухом. Окислению- свободными радикалами подвержены, практически все органические соединения, входящие в состав живых тканей: Наибольший интерес, для медиков; представляют продукты перекисного окисления липидов (лейкотриены, простагландины, интерлейкины), а также медиаторы, образованием которых сопровождаются воспалительные процессы[16-20].
Окислительный стресс сопровождает многие заболевания, человека. Следовательно, по- концентрациям продуктов, окислительного стресса в биологических тканях, можно судить о наличии того.или иного заболевания. С точки зрения анализа выдыхаемого воздуха1 нас интересуют наиболее летучие продукты окислительного стресса. Подобными индикаторами . являются.такие вещества; образующиеся»в процессе окисления липидов, как алканы, альдегиды, кислоты.
Выбор условий хроматографического разделения и масс- спектрометрического детектирования
Выбор условий хроматографического разделения осуществляли с использованием 17-ти компонентной модельной смеси. Скорость потока газа-носителя меняли в пределах от 1 до 2 мл/мин. Начальную температуру термостата хроматографа варьировали в районе 40-45С, продолжительность начальной изотермы — 3-5 мин. Скорость нагрева термостата хроматографа меняли в пределах от 5 до 50С, разделив температурную программу на 2 участка в точке 200С. Конечную температуру термостата меняли в пределах — 250-3 00С. Продолжительность конечной изотермы меняли от 1 до 5 мин. Температуру инжектора хроматографа и температуру соединительной линии меняли вместе с конечной температурой термостата в диапазоне 250-300С. Анализ 24-х компонентной модельной смеси осуществляли в условиях выбранных для 17-ти компонентной. Масс-спектрометрическое детектирование осуществляли в режиме-регистрации полного ионного тока. Сканирование осуществляли в диапазоне значений m/z от 35 до 350. Температура источника ионов составляла 250С. энергия электронов — 70 эВ. Для определения пределов обнаружения последовательно проводили анализ модельных смесей, полученных разбавлением исходной в 1000, 100 и 10 раз (в МТБЭ). Каждый анализ повторяли 3 раза. При переходе от смеси к смеси осуществляли холостой опыт (вводили пробу чистого растворителя).
Для определения кетонов и альдегидов использовали детектирование в режиме химической ионизации, наряду с электронной ионизацией. В этих экспериментах использовали растворы модельных смесей альдегидов и кетонов, для которых подбирали условия хроматографического разделения. Варьировали скорость нагрева термостата хроматографа от 5 до 40С, количество участков с разными скоростями нагрева (до 3-х), объёмную скорость газа-носителя — от 1 до 2 мл/мин. При масс-спектрометрическом детектировании поток газа-реагента (изобутан) меняли в пределах от 0,5 до 2,5 мл/мин. Температуру источника ионов меняли в диапазоне от 120 до 150С. Энергия электронов испускаемых термокатодом составляла 80 эВ. Сканирование проводилив диапазоне масс от 65 до 350 m/z. Детектирование проводили в режимах сбора данных по полному ионному току (TIC) и селективного ионного мониторинга (SIM) по двум основным массам в масс-спектре каждого вещества.
На данной стадии эксперимента перенос вещества на сорбент осуществляли микрошприцем напрямую. Объём вводимой пробы составлял 1 мкл. Удаление растворителя не производили. Перенос пробы с сорбента в инжектор хроматографа проводили путём термодесорбции в потоке гелия. Гелий в картридж с сорбентом подавали за минуту до соединения картриджа с инжектором. Первоначально проводили изучение влияния на процесс переноса вещества с сорбента в инжектор газового хроматографа таких параметров, как температура десорбции, объёмная скорость потока газа-носителя, температура колонки хроматографа, температура начального участка колонки длиной 6-см, продолжительность термодесорбции. Температуру термодесорбции и объёмную скорость потока газа-носителя варьировали совместно в диапазоне от 250 до 300С и от 1 мл/мин до 5 мл/мин. Далее параметры варьировали по отдельности. Температуру — в промежутке от 310 до 390С с интервалом в 10С. Значения температуры термостата — 40, 37, 35С. Температуру начального участка колонки — в пределах от 10 до -20С с интервалом 10С. Продолжительность термодесорбции — от 1 до 5 мин с интервалом 1 мин.
Сорбционное концентрирование модельных соединений из растворов (17-ти и 24-х компонентные модельные смеси) изучали с использованием в каческтве сорбентов СКВ и Тепах GC в комбинации с СКВ, количества которых составляли: 1,5-6 мг для Тепах GC и 0,5-2 мг для СКВ. Сорбент располагался в кварцевом лайнере, через который пропускали поток газа (азота). Посредством шприцевого дозатора с постоянной скоростью подавали в лайнер анализируемый раствор. Объёмная скорость потока анализируемого раствора — 5-30 мкл/мин, объёмная скорость потока газа — 5-100 мл/мин. Термодесорбцию осуществляли в условиях выбранных ранее в результате исследования сорбции/десорбции модельных соединений.
Масс-спектры модельных соединений, полученные методом электронной ионизации
Были изучены масс-спектры модельных соединений. Проведено их сравнение с масс-спектрами из библиотеки масс-спектров NIST за 2005 год. Сравнение масс-спектров производилось по двум параметрам совпадения (Match Factor), которые рассчитывает поисковая программа. Эти два параметра: прямое совпадение (direct match) и обратный поиск (reverse search). Идеальному совпадению соответствует значение параметра равное 999, спектру без пиков соответствует 0.
Различия в вычислении параметров заключаются в процедуре составления векторов: в случае прямого совпадения производится сравнение по всем ионам, присутствующим в изучаемом масс-спектре, в случае обратного поиска - исключаются значения взвешенных интенсивностей тех ионов, которые отсутствуют в масс-спектре сравнения. Более подробно о процедуре сравнения масс-спекров неизвестных соединений с масс-спектрами из бибилотек масс-спектров можно прочитать в соответствующей литературе [104-108]. Соответствующие модельным веществам 24-х компонентной смеси значения описанных выше параметров приведены в таблице 6. Таблица 6. Результаты поиска по библиотеке масс-спектров для модельных соединений 24-х компонентной модельной смеси с концентрациями веществ в интервале от 4х10"10 до 9х10"9 г/мкл.
При расчёте параметра S/N принимается допущение о том, что уровень фонового шума вблизи хроматографического пика значимо не изменяется, а его основная составляющая - шум от электронного умножителя. Участок фонового сигнала выбирают наиболее близкий к пику определяемого вещества. На нём должны отсутствовать хроматографические пики других компонентов (Рисунок 12).
Существуют автоматические процедуры, как для определения участка фонового сигнала, так и для выделения хроматографического пика. Однако, на практике их использование возможно только при условии, что рядом с хроматографическим пиком отсутствуют другие (пики веществ) со сходными масс-спектрами, и форма пика определяемого компонента близка к идеальной.
Регистрация пиков и определение отношений сигнала к шуму производились по масс-хроматограммам наиболее интенсивных ионов в информативной части масс-спектра. В случае регистрации параметра по полному ионному току происходит суммирование фонового сигнала по массам, не входящим в масс-спектр определяемого компонента, что в свою очередь приводит к снижению значений параметра S/N Вычисление пределов обнаружения Значение пределов обнаружения индивидуальных компонентов при хромато-масс-спектрометрическом определении зависит от нескольких основных факторов. Предел детектирования масс-спектрометра определяется минимальным, проходящим через детектор масс-спектрометра за время одного скана количеством вещества, которое можно идентифицировать. Предел детектирования для каждого конкретного вещества определяют по масс-хроматограмме, построенной по наиболее интенсивному иону в масс-спектре, для которого параметр S/N является максимальным. При вычислении предела детектирования следует учитывать, что значение интенсивности шума зависит от интенсивности аналитического сигнала (количества вещества попадающего на детектор) — это особенность электронного умножителя. Для данной конкретной модели масс 62 спектрометра в первом приближении эту зависимость можно считать прямо пропорциональной. Из-за этого эффекта лучше рассчитывать пределы детектирования по результатам исследования модельных растворов с наименьшими возможными концентрациями определяемых веществ.
Пределы обнаружения при хромато-масс-спектрометрическом определении также очень сильно зависят от методики хроматографического разделения. Увеличение ширины хроматографического пика приводит к уменьшению отношения S/N при одинаковой концентрации определяемого соединения. В случае же очень узкого пика (вещество проходит через масс-спектрометр за время- равное или менее 3-х сканов) возможно снижение чувствительности из-за того, что максимум приходится на время между 2-мя сканами, т.е. высота пика (и его1 площадь) будет меньше, и резко ухудшится воспроизводимость. В случае капиллярной газовой хроматографии следует учитывать следующие параметры: объёмную скорость газа-носителя, температурную программу (скорость нагрева), диаметр колонки, толщину и природу неподвижной фазы.
Отдельно нужно обратить внимание на устройство ввода вещества, в колонку газового хроматографа. Использование стандартных инжекторов S/SL позволяет избежать проблем, связанных с размыванием вещества по начальному участку колонки (хроматографические пики получаются достаточно узкими вне зависимости от температуры кипения вещества). Однако, использование такого инжектора исключает возможность ввода проб больших объёмов. Использование ввода пробы методом термодесорбции со специального картриджа (как будет показано далее) приводит к увеличению ширины пика, в зависимости от температуры кипения и химической природы определяемого компонента.
Изучение и оптимизация условий термодесорбции веществ из модельной смеси
При изучении влияния условий термодесорбции, на количество десорбированного в хроматограф с картриджа вещества и на. ширину пиков наиболее летучих компонентов- смеси варьировали следующие параметры: температуру термостата хроматографа- во время термодесорбции, температуру участка длиной 6 см в начале хроматографической колонки во время термодесорбции, продолжительность термодесорбции, температуру картриджа и скорость потока газа-носителя,вовремя термодесорбции.
Основным препятствием при вводе больших по объёму проб растворов аналитов (десятки и сотни микролитров) в инжектор капиллярного газового хроматографа является необходимость предварительного удаления растворителя- без потерь (или с незначительными потерями) определяемых веществ в процессе. Применяемое нами» в. данной- работе устройство для термодесорбциш было разработано, ранее с целью обеспечения-возможности ввода больших по объёму проб с удалением растворителя вне аналитической системы и переводом концентрата аналитов в инжектор хроматографа путём термодесорбции в потоке газа-носителя. Важен тот факт, что в. рассматриваемом способе ввода больших проб практически весь растворитель должен быть отделён от анализируемой пробы уже на стадии ввода вещества в инжектор. Поэтому перенос концентрата аналитов осуществляется в потоке газа-носителя (Не) с сорбента по кварцевому капилляру (игле) в инжектор и далее на начальный участок колонки. Предполагается, что за счёт разницы температур в термодесорбере, инжекторе и колонке, а также за счёт характера неподвижной фазы капиллярной колонки, будет происходить улавливание определяемых веществ на небольшом начальном участке капиллярной колонки.
Таким образом, чтобы сконцентрировать пробу на меньшем участке колонки, следует понизить температуру колонки (т.е. термостата хроматографа), и задать минимально возможное значение потока газа-носителя при термодесорбции. Первое приводит к ускорению процесса сорбции за счёт увеличения градиента температуры, а второе сокращает путь, пройденный горячим газом-носителем до того момента, когда сорбция будет полной. При этом следует отметить, что, чем выше будет температура газа-носителя, тем больше будет размывание зоны компонента в хроматографической колонке, в которойпроизводится концентрирование.
Изменение температуры термостата хроматографа во время термодесорбции с 40 до 35С привело к заметному увеличению времён удерживания (Таблица 16), и некоторому уменьшению значений ширины пиков наиболее летучих веществ (для п-цимена это изменение составило с 1,5 до 1,2 мин). Дальнейшее понижение температуры термостата не представлялось целесообразным, так как время, необходимое для охлаждения термостата до 30С, в условиях лаборатории превысило 1 ч, а охлаждение ниже комнатной температуры (примерно 25С) вообще не представлялось возможным в данном конструктивном исполнении. Таблица 16. Времена удерживания веществ, входящих в состав 17-ти компонентной модельной смеси, при вводе пробы термодесорбцией при температуре термостата хроматографа равной 40 и 35С.
Было решено изучить возможность уменьшения ширины пиков наиболее летучих компонентов модельных смесей за счёт охлаждения небольшого начального участка хроматографической колонки (6 см) при помощи устройства, работа которого основана на элементе Пельтье. Температуры начального участка колонки, при которых проводили эксперимент, составляли-35Є (температура термостата хроматографа), 10С, 0С, -10С и -20С. При этом фиксировали время удерживания и величину ширины пика у основания для наиболее летучих компонентов модельной смеси, представляющих разные классы, т.е. отличающихся по полярности- (п-цимен, гептанон-4, 2,6-диметилгептанон-4, додекан, деканол).
Ширина пика у основания изученных компонентов менялась по-разному. Для п-цимена наблюдалось некоторое уменьшение ширины пика (с 1 мин до 0,75 мин) на участкеот 10 до -10 С. Для 2,6-диметилгептанона-4 и деканола-1 наблюдался чётко выраженный минимум при 10С. Ширина пика додекана уменьшилась почти в 2,5 раза при температуре -20С. При -10С наблюдался локальный минимум.
Было проведено исследование зависимостей величины аналитического сигнала компонентов от времени десорбции при прочих постоянных параметрах. Под временем десорбции понимался промежуток времени, в течение которого осуществлялся нагрев картриджа с сорбентом в процессе ввода пробы. Время десорбции меняли от 1 до 5 мин с интервалом в 1 мин. Картридж нагревали до 250С, скорость потока газа-носителя составляла 2 мл/мин, температура инжектора — 250С, температура колонки — 35С.
Сначала провели исследование зависимости ширины пиков определяемых компонентов модельных смесей от значений температуры десорбции и потока гелия. Температуру варьировали в пределах от 250С до 300С, объёмную скорость потока — от 1,1 мл/мин до 5 мл/мин. Зависимость ширины пика п-цимена у основания от объёмной скорости потока гелия и от температуры термодесорбции, время термодесорбции 5 мин. Значение объёмной скорости потока газа-носителя равное 1,1 мл/мин — минимальное автоматически регистрируемое при данной комплектации хроматографа (инжектор S/SL и капиллярная колонка RTX-200MS, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина фазы 0,25 мкм, длина 30 м). Дальнейшее уменьшение объёмной скорости потока возможно только при условии замены хроматографической колонки.
По результатам исследования была зафиксирована общая тенденция к уменьшению значений ширин пиков веществ модельной смеси. Наиболее чётко эта тенденция выражена для веществ с наименьшими температурами кипения (то есть с большими значениями ширины пика у основания). В качестве примера далее приведена соответствующая диаграмма для п-цимена. Как видно из рисунка 27, значения ширины пика у основания в данных условиях определения для наиболее летучих соединений отличались значительным разбросом.
Было также изучено влияние увеличения массы сорбента Тепах GG на полноту переноса веществ с сорбента в инжектор и на. хроматографическое разделение компонентов модельной смеси. Из приведённых в таблице 17 данных видно, что с увеличением; массы сорбента; аналитический сигнал легколетучих веществ увеличился, однако, при этом сильно возросли значения ширины пиков для большинства изученных соединений. Уширение пиков произошло в данном случае в связи с тем, что увеличилось, время;. необходимое для десорбции каждого из веществ, а фокусирование наиболее летучих компонентов на колонке малоэффективно.
