Содержание к диссертации
Введение
1. Применение газовой хроматографии с атомно-эмиссионным детектором (АЭД) для определения качественного и количественного состава компонентов смесей 15
1.1. АЭД и его различные конструкции 15
1.2. Сравнение АЭД с другими детекторами для газовой хроматографии 21
1.3. Применение АЭД для определения элементного состава компонентов смесей и их содержания 27
1.4. Области практического применения ГХ-АЭД 52
2. Оборудование, исходные вещества и методика эксперимента .59
2.1. Оборудование 59
2.2. Исходные вещества и материалы 59
2.3. Методика эксперимента 68
2.3.1. Условия регистрации сигналов элементов атомноэмиссионным детектором 68
2.3.2. Приготовление смесей модельных соединений для изучения возможности определения отношений чисел атомов элементов 69
2.3.3. Приготовление модельной смеси н-алканов для изучения возможности проведения количественного анализа без градуировки 72
2.3.4. Извлечение активных компонентов таблетированных фармацевтических препаратов в органический раствор 73
2.3.5. Определение компонентов модельных смесей и активных компонентов таблетированных фармацевтических препаратов методом ГХ-АЭД 73
3. Изучение зависимости сигналов АЭД по углероду и водороду и их отношений от структуры, состава элементов и количества компонента 75
3.1. Изучение возможности определения отношений Пс/Пн для н-алканов Сп-Сіб 75
3.1.1. Определение отношений пс/пн в общепринятом режиме работы детектора 75
3.1.2. Изучение возможности повышения точности определения отношений пс/пн при изменении состава плазмы 81
3.2. Изучение возможности определения отношений пс/пн для разных классов органических соединений при использовании вещества стандарта, отличающегося по структуре и составу элементов от определяемых компонентов 86
3.2.1. Определение отношений пс/пн для соединений разных классов при использовании в качестве стандарта вещества, отличающегося от определяемых по структуре и составу элементов 86
3.2.2. Изменение пределов детектирования по углероду и водороду для различных классов соединений при использовании максимального содержания кислорода в гелии 90
3.2.3. Снижение концентрационного предела обнаружения среднелетучих органических соединений 92
4. Изучение возможности определения отношений пс/па, пс/пвг, пс/пр, nc/ns и r»c/nN методом ГХ-АЭД 96
4.1. Определение отношений пс/па в молекулах ПХБ при использовании в качестве вещества-стандарта одного из гомологов ПХБ 96
4.2. Определение отношений Пс/па и пс/пвг в молекулах летучих галогенсодержащих углеводородов при использовании вещества-стандарта, отличающегося по составу элементов от определяемых соединений 98
4.3. Определение отношений пс/пр, пс/пы и nc/ns при использовании вещества-стандарта, отличающегося по структуре от определяемых соединений 100
5. Изучение возможности определения содержания компонентов смесей углеводородов без градуировки по каждому компоненту 104
5.1. Определение содержания компонентов «модельной» смеси н-алканов без градуировки 104
5.2. Определение содержания компонентов «неизвестной» смеси углеводородов за счет определения их элементного состава 106
6. Изучение возможности определения активного компонента фармацевтических препаратов методом ГХ-АЭД 109
6.1. Установление качественного элементного состава активного компонента в препаратах диазепама, феназепама, кларитина и винпоцетина 112
6.2. Определение отношений пс/пн и содержания активного компонента в препаратах диазепама, феназепама, кларитина и винпоцетина без использования их стандартных образцов 113
Заключение 117
Выводы 119
- Сравнение АЭД с другими детекторами для газовой хроматографии
- Методика эксперимента
- Изучение возможности определения отношений пс/пн для разных классов органических соединений при использовании вещества стандарта, отличающегося по структуре и составу элементов от определяемых компонентов
- Определение содержания компонентов «неизвестной» смеси углеводородов за счет определения их элементного состава
Введение к работе
Актуальность темы. Идентификация компонентов смесей летучих и среднеле-тучих органических соединений является одной из сложнейших задач. Наиболее распространённым способом идентификации заданных соединений в смеси при наличии соответствующих стандартных образцов этих соединений является идентификация по хроматографическим временам удерживания. Соединение считается идентифицированным при совпадении времен удерживания компонента смеси и заданного (предполагаемого) соединения, хотя такая идентификация неоднозначна. Достоверность идентификации значительно повышается, если наряду со временами удерживания используются отношения площадей пиков, зарегистрированных двумя детекторами: универсальным (ПИД) и селективным (ФИД, ЭЗД, ТИД). Существенным ограничением при таком сочетании является отсутствие информации обо всех элементах, входящих в состав молекул компонентов смеси, резкое различие в чувствительности обоих детекторов и большие затраты времени в случае измерений отношений сигналов ПИД и ряда селективных детекторов.
Достоверность идентификации заданных (предполагаемых) соединений существенно возрастает при сочетании данных о временах удерживания и масс-спектрометрических данных, полученных с электронной либо химической ионизацией, однако и в этом случае информация об элементах, входящих в состав молекул компонентов, способствует увеличению достоверности идентификации.
В связи с этим перспективным газохроматографическим детектором, дающим информацию об элементах (С, Н, F, CI, Br, I, Р, S, О, N и др.), присутствующих в молекулах компонентов смесей органических соединений, является атомно-эмиссионный детектор, обладающий высокой селективностью и чувствительностью по этим элементам (пределы детектирования 1-20 пг/с, в зависимости от элемента) [1]. Использование газовой хроматографии с атомно эмиссионным детектором (ГХ-АЭД) позволяет резко увеличить достоверность идентификации предполагаемых соединений, основанной на использовании времен удерживания, благодаря получению целого ряда отношений сигналов соответствующих элементов, входящих в состав молекул определяемых компонентов, т.е. получению многомерного признака компонентов смеси.
Наиболее привлекательным является использование ГХ-АЭД для определения отношений чисел атомов элементов в молекулах компонентов смесей, а также определения содержания этих компонентов без градуировки по каждому из них и использования этих данных для идентификации и определения содержания как предполагаемых, так и неизвестных соединений [2, 3]. Необходимым условием для решения этих задач является регистрация сигналов соответствующих элементов, не зависящих от структуры и состава элементов в молекуле определяемого компонента, и его количества, поступившего в детектор.
В настоящее время исследователи чаще всего используют автоматизированную систему ГХ-АЭД, разработанную в 1989 году компанией Hewlett-Packard. Существенным ограничением данного прибора по сравнению с другими, более старыми вариантами атомно-эмиссионных детекторов, является невозможность одновременной регистрации всех элементов.
Литературные данные, посвященные изучению возможности определения отношений чисел атомов элементов или проведения количественного анализа без градуировки методом ГХ-АЭД, противоречивы. В большинстве публикаций показано, что в общем случае сигнал атомно-эмиссионного детектора для соответствующих элементов зависит от структуры молекулы, состава элементов и количества определяемого компонента. В некоторых работах, напротив, утверждается о независимости сигнала детектора от этих параметров. Однако, как правило, в таких работах было изучено небольшое число модельных соединений или используемое вещество-стандарт было близким по структуре, составу элементов и/или количеству к определяемым соединениям.
Лишь в небольшом числе найденных нами публикаций условия эксплуатации АЭД отличались от общепринятых, т.е. рекомендованных компанией Hewlett-Packard; и в этих работах поиск оптимальных условий осуществлялся с целью достижения максимальной чувствительности, а не максимальной точности определения отношений чисел атомов элементов или количественного состава. Несмотря на высокую актуальность проблемы снижения зависимости сигналов АЭД по соответствующим элементам от структуры и количества вещества, нами не было найдено ни одной публикации, в которой был бы произведен поиск условий, оптимальных с точки зрения регистрации менее зависимых от структуры и количества вещества сигналов АЭД. Ни в одной из найденных нами работ не изучалось влияние содержаний газов-реагентов в гелии на точность определения отношений чисел атомов элементов в молекуле. Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение возможности регистрации сигналов атомно-эмиссионного детектора, независимых от структуры, элементного состава и количества определяемого соединения, и разработка способа определения отношений чисел атомов углерода и водорода в молекулах компонентов смесей органических соединений и их количественного определения без проведения градуировки по каждому компоненту при использовании метода газовой хроматографии с атомно-эмиссионным детектором.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- изучить зависимость сигналов АЭД по углероду и водороду для членов одного гомологического ряда (н-алканов) от структуры и количества компонента, путём определения отношений пс/пн в общепринятых условиях работы АЭД при использовании члена гомологического ряда в качестве вещества-стандарта;
- на примере С-, Н-, N-, О-, Р-, S-, F-, С1- и Br-содержащих органических соединений исследовать зависимость сигналов АЭД по углероду и водороду в общепринятых условиях от структуры молекул компонентов смесей и состава элементов при использовании в качестве стандарта соединения, отличающегося по этим параметрам от определяемых компонентов, путем определения отношений ПсІПн,
- исследовать условия, минимизирующие зависимость сигналов АЭД по углероду и водороду от структуры и элементного состава определяемых веществ, и разработать способ определения отношений псіпи в молекулах компонентов смесей углеводородов, а также N-, О-, Р-, S-, F-, О- и Вг-содержащих органических соединений с высокой точностью, не зависящей от структуры, элементного состава и содержания компонентов;
- оценить пределы детектирования по углероду и водороду для различных соединений в зависимости от условий эксперимента;
- разработать способ снижения концентрационных пределов обнаружения, основанный на вводе больших по объему проб органических растворов в систему ГХ-АЭД с удалением растворителя вне аналитической системы;
- изучить зависимость сигналов АЭД по каналам серы, азота, фосфора, хлора и брома от структуры и элементного состава для представителей соответствующих классов органических соединений методом ГХ-АЭД, путём определения отношений псіпа, пс/пвг, ndns псіпр, ncln \
- изучить возможность определения содержания компонентов смесей углеводородов без градуировки по каждому компоненту методом ГХ-АЭД.
Научная новизна. Изучена зависимость сигналов АЭД по углероду и водороду от структуры и количества компонента для близких членов гомологического ряда н-алканов в общепринятых условиях на основании данных определения отношений пс1пн и показано, что отношение этих сигналов и связанная с ним погрешность определения отношений псіпн зависят от количества компонента даже в том случае, когда вещество-стандарт - член гомологического ряда.
Изучена зависимость сигналов АЭД по углероду и водороду от структуры и элементного состава для большого числа классов органических соединений, в состав которых входили такие элементы, как С, Н, N, О, F, CI, Br, Р и S, путем определения отношений пс/пн. Показано, что отношение этих сигналов зависит от структуры и элементного состава компонентов; в общепринятых условиях относительная погрешность определения отношений пс1пн достигала 20% и выше.
Изучена возможность минимизации зависимости сигналов АЭД по углероду и водороду от количества компонента, его структуры и элементного состава, и уменьшения погрешности определения отношений пс1пн за счет увеличения содержания газа-реагента кислорода в гелиевой плазме. Показано, что при максимальном для данного АЭД содержании кислорода в гелии (около 10%) зависимость сигналов АЭД по углероду и водороду от перечисленных параметров, при использовании вещества-стандарта, отличного по этим параметрам от определяемых соединений, была минимальна, что обеспечивало возможность определения отношений пс1пн с высокой точностью.
Изучена возможность снижения концентрационных пределов обнаружения ГХ-АЭД за счет ввода больших по объему проб органических растворов в аналитическую систему и разработан способ, позволяющий снизить предел обнаружения более чем на два порядка.
Исследована возможность определения отношений пс/па, nclnBn nclns, пс1пр и nclnN в молекулах компонентов смесей. Показано, что определение этих отношений с высокой точностью при использовании вещества-стандарта со структурой, отличающейся от структуры определяемых соединений, невозможно как в общепринятом режиме работы детектора, так и в других исследованных нами условиях.
Исследована возможность определения количественного состава компонентов смесей углеводородов без проведения градуировки по каждому компоненту с использованием ГХ-АЭД в общепринятых и разработанных нами условиях. На примере модельной смеси н-алканов показана возможность определения количественного состава без градуировки с относительной погрешностью около 4%. Предложен способ, позволяющий проводить определение элементного состава и содержания компонентов смесей углеводородов «неизвестного состава» с высокой точностью при использовании полученных данных об элементном составе.
Исследована возможность обнаружения активного компонента в таблетированных формах фармацевтических препаратов и определения его содержания с высокой точностью при использовании ГХ-АЭД. Разработан способ быстрого скрининга фармацевтических препаратов на фальсификаты, основанный на регистрации элементов, присутствующих в молекуле активного компонента, определении отношения пс1пн в молекуле этого компонента и его содержания в таблетированной форме без градуировки.
Практическая значимость. Предложен способ определения отношений псІпн в молекулах компонентов смесей С, Н, N, О, Р, S, F, С1 и Вг-содержащих органических соединений, основанный на использовании ГХ-АЭД с гелиевой плазмой, обогащенной кислородом, позволяющий увеличить достоверность идентификации микроколичеств компонентов смесей, элюируемых из хроматографической колонки. Способ применим как для предполагаемых, так и неизвестных соединений.
Предложен способ ввода больших по объему проб органических растворов в систему ГХ-АЭД с удалением растворителя вне аналитической системы, позволяющий снизить концентрационные пределы обнаружения более чем на 2 порядка. Способ существенно расширяет возможности метода ГХ-АЭД с точки зрения обнаружения, идентификации и количественного определения следовых концентраций компонентов смесей.
Из полученных данных по изучению возможности определения отношений сигналов углерода и таких элементов, как CI, Br, N, Р и S, сделан вывод о том, что для неизвестных компонентов смесей, когда невозможно выбрать стандарт, близкий по структуре и элементному составу к определяемым соединениям, возможности системы ГХ-АЭД ограничиваются только установлением качественного элементного состава.
Предложен способ определения содержания компонентов сложных углеводородных смесей без градуировки по каждому компоненту и определения элементного состава с высокой точностью. Этот способ может быть особенно востребован для решения ряда задач в нефтепереработке и нефтехимии, когда стандарты определяемых соединений недоступны или структура определяемых соединений неизвестна, либо число компонентов настолько велико, что градуировка становится практически нереализуемой.
Предложен способ скрининга фармацевтических препаратов на соответствие спецификации качественного состава активного компонента и его содержания в таблетированной форме, не требующий использования стандартного образца активного компонента. Этот способ позволяет увеличить достоверность контроля качества фармацевтической продукции в промышленности и организовать быстрый скрининг соответствующих фармацевтических препаратов на фальсификаты. Результаты работы нашли практическое применение на кафедре аналитической химии химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. На защиту выносятся:
— результаты исследования зависимости сигналов АЭД, соответствующих углероду и водороду, от структуры и количества компонента, полученные при определении отношений псіпн для членов одного гомологического ряда (н-алканов), в общепринятом режиме работы АЭД при использовании их гомолога в качестве вещества-стандарта;
— результаты изучения влияния содержания кислорода в гелии на величины отношений сигналов АЭД по каналам углерода и водорода для н-алканов, присутствующих в смеси в различных концентрациях;
— результаты исследования зависимости сигналов АЭД, соответствующих углероду и водороду, от структуры и элементного состава соединений, полученные путем определения отношений пс/пн для различных С-, Н-, N-, О-, Р-, S-, F-, О- и Вг-содержащих органических соединений, в общепринятом режиме работы АЭД при использовании вещества стандарта, отличающегося по структуре и элементному составу от определяемых соединений;
— выбранные нами оптимальные условия работы АЭД с гелиевой плазмой, обогащенной кислородом, позволяющие определять отношения пс1пн в молекулах компонентов смесей с наибольшей точностью благодаря минимизации зависимости соответствующих сигналов от структуры молекул компонентов, элементного состава и их содержания;
— результаты определения отношений псіпн для различных С-, Н-, N-, О-, Р-, S-, F-, С1- и Вг-содержащих органических соединений, полученные при использовании в качестве вещества-стандарта соединения, отличающегося по структуре и элементному составу от определяемых соединений, в выбранных нами оптимальных условиях работы АЭД, и соответствующих пределов детектирования;
— способ ввода больших по объему проб органических растворов в ГХ-АЭД с удалением растворителя вне аналитической системы, позволяющий снизить концентрационный предел обнаружения более чем на 2 порядка;
— результаты изучения возможности определения отношений чисел атомов псіпсь псІПвп псіп , псіщ и псіпр в различных условиях детектирования (скорости потоков, состав газов-реагентов);
— способ определения содержания известных компонентов углеводородных смесей без проведения градуировки по каждому компоненту;
— способ определения элементного состава и содержания компонентов смесей углеводородов «неизвестного состава» с высокой точностью при использовании полученных данных об элементном составе;
— способ скрининга фармацевтических препаратов на фальсификаты, основанный на регистрации элементов в молекуле активного компонента с последующим определением его содержания и отношения псІпн в нем без использования стандартного образца активного компонента. Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Третьем международном симпозиуме "100 лет хроматографии" (Москва, Россия, 2003 г), на Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы» (Москва, Россия, 2004 г.), на Двадцать Седьмом международном симпозиуме по капиллярной хроматографии и электрофорезу (Рива дель Гарда, Италия, 2004 г.), на Европейской конференции по Аналитической Химии "Euroanalysis XIII" (Саламанка, Испания, 2004 г.), на Двадцать Восьмом международном симпозиуме по капиллярной хроматографии и электрофорезу (Лас Вегас, США, 2005 г.), на Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии. Применение в нефтехимии» (Самара, Россия, 2005 г.) и на Сороковом конгрессе IUPAC "Innovation in Chemistry" (Пекин, Китай, 2005 г.).
Публикации. По материалам работы опубликовано 12 работ в виде статей и тезисов докладов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов и списка использованных литературных источников.
Во введении обоснована актуальность темы работы, сформулированы цель, научная новизна, практическая значимость и положения, выносимые на защиту.
Первая глава является литературным обзором, посвященным применению атомно-эмиссионного детектора для определения качественного и количественного состава компонентов смесей.
Во второй главе описаны оборудование, исходные вещества и материалы и методика эксперимента.
В третьей главе представлены результаты изучения зависимости сигнала АЭД по каналам углерода и водорода от структуры молекул, состава элементов и количества компонента. Приведены результаты определения отношений пс1пн в общепринятом режиме работы АЭД и в найденных нами условиях, позволяющих минимизировать зависимость сигналов АЭД по углероду и водо роду от перечисленных параметров, и соответствующие пределы детектирования.
В четвертой главе представлены результаты изучения возможности определения таких отношений, как пс/па, nclnBr, пс/пР, nclnN и nc/ns, в общепринятых условиях работы АЭД и в других исследованных нами условиях.
В пятой главе представлены результаты исследования возможности определения содержания известных компонентов смесей углеводородов без градуировки по каждому компоненту. Проведено сравнение результатов такого определения в общепринятом режиме работы АЭД и в найденном нами режиме. Показана возможность определения элементного состава и содержания компонентов смесей углеводородов «неизвестного состава» с высокой точностью с использованием полученных данных об элементном составе.
В шестой главе рассмотрена возможность проведения быстрого скрининга фармацевтических препаратов на фальсификаты методом ГХ-АЭД, основанного на регистрации элементов в молекуле активного компонента, определении отношения пс/пн и определении содержания этого компонента без проведения по нему градуировки.
Материал диссертации изложен на 135 страницах, содержит 22 таблицы и 5 рисунков. Список литературных источников состоит из 131 наименования.
Сравнение АЭД с другими детекторами для газовой хроматографии
Сравнительные характеристики высокочувствительных и высокоселективных детекторов, применяемых в газовой хроматографии [16]: - ЭЗД очень чувствителен по отношению к полигалогенированным соединениям, но не способен различать галогены между собой и дает отклик на многие соединения, молекулы которых обладают большим сродством к электрону, такие, как ангидриды, дикетоны и нитросоединения; отклик ЭЗД резко зависит от структуры молекулы. - Детектор Холла, или кондуктометрический детектор (КД), обладает высокой селективностью по отношению к галоген-, азот- и сероорганическим соединениям, но этот детектор не различает галогены между собой и менее чувствителен. - АФД (азотно-фосфорный, или термоионный детектор) селективен по отношению к N- и Р-содержащим соединениям, но его сигнал зависит от структуры. Детектор обладает низкой чувствительностью к некоторым азотсодержащим соединениям, что связывают с особенностью механизма протекающей в детекторе реакции, обусловливающей отклик детектора только по отношению к тому азоту, который в соединении химически связан с атомом углерода. - ПФД часто используется для определения S- и Р-содержащих соединений, однако отклик детектора нелинеен по отношению к сере и снижается при наличии углеводородов, элюирующихся одновременно с определяемым соединением. Селективность по Р по отношению к S составляет приблизительно 100. - ППФД обладает более высокой, чем ПФД, селективностью и чувствительностью к Р- и S-содержащим соединениям. - Масс-спектрометры высокого разрешения во многих случаях позволяют определить молекулярную (брутто-) формулу, но при широком наборе элементов достоверность определения уменьшается и требуется информация о составе элементов. Кроме того, их стоимость очень высока. Масс-спектрометры низкого разрешения позволяют определить структуру соединения, если его масс-спектр, полученный в режиме электронной ионизации, присутствует в базе данных; для большинства соединений возможно определение молекулярной массы при условии регистрации молекулярного иона; кроме того, по масс-спектрам низкого разрешения в некоторых случаях можно установить наличие в молекуле хлора или брома. Метод ГХ-МС низкого разрешения в ряде случаев предоставляет важную информацию о составе соединений, но достоверность данных, полученных этим методом, может быть существенно увеличена при использовании информации, полученной методом ГХ-АЭД. В табл. 3, приведенной в монографии сотрудника компании Hewlett-Packard [1], посвященной атомно-эмиссионному детектору, приведены некоторые общие характеристики ГХ-детекторов, позволяющие сравнить АЭД с другими селективными детекторами.
Как следует из таблицы, по сравнению с рядом ГХ-детекторов атомно-эмиссионный детектор обладает довольно низкими пределами детектирования, но небольшим линейным диапазоном. Уникальным и важнейшим свойством атомно-эмиссионного детектора является возможность высокоселективной и высокочувствительной регистрации всех элементов, входящих в состав органических соединений. Из таблицы также можно сделать вывод о том, что чувствительность ГХ-АЭД сопоставима с чувствительностью таких методов, как ГХ-ЭЗД и ГХ-МС, что вызвало у нас некоторые сомнения. Пределы детектирования, приведенные в таблице для МСД, являются явно завышенными. Что касается ЭЗД, то для него приведен наиболее низкий предел детектирования, в то время как для разных по структуре соединений он варьируется в пределах нескольких порядков. Помимо рассмотрения табл. 3, мы обратились к публикациям, в которых проведено сравнение АЭД и других детекторов на примере конкретных модельных соединений. Несмотря на широкое применение АЭД в аналитической практике, нами было обнаружено лишь небольшое число работ, посвященных сравнению АЭД с другими селективными детекторами с использованием одного набора соединений, в одинаковых хроматографических условиях. Так, в результате сравнения АЭД с детектором электронного захвата (ЭЗД), детектором Холла, азотно-фосфорным детектором (АФД) и пламенно-фотометрическим детектором (ПФД), было показано [17], что метод ГХ-АЭД за счет высокой селективности позволяет определить наибольшее количество различных пестицидов в сложной матрице сельскохозяйственных продуктов. Обсуждается число обнаруженных с помощью каждого детектора пестицидов, но не их содержание. В работе приведены пределы детектирования, полученные только при использовании АЭД и составлявшие 0.31, 0.15 и 3.00 нг для хлорпирифоса (по каналу хлора), диазинона (по каналу фосфора) и эталфлуралина (по каналу фтора), соответственно. Показана возможность применения ЭЗД, ПФД, МСД и АЭД для определения ряда пестицидов [18]. Пределы детектирования различных пестицидов, 25 полученные при использовании ЭЗД, составили 0.01-0.05 нг; ПФД — около 0.1 нг; АЭД - 0.2-2 нг; МСД - 0.5-3 нг (при регистрации суммарного ионного тока). Чувствительность АЭД к хлорсодержащим соединениям была в 20-80 раз ниже, чем чувствительность ЭЗД, и у обоих детекторов зависела от структуры соединений. Чувствительность ПФД была также несколько выше чувствительности АЭД. Пределы детектирования МСД в полном ионном токе были выше пределов детектирования АЭД.
Определение пестицидов методом ГХ-АЭД проводили методом внешнего стандарта, для каждого пестицида использовали отдельный градуировочный график. При анализе летучих галогенированных углеводородов [19] было проведено сравнение АЭД и ЭЗД. Пределы детектирования ЭЗД для большинства соединений были на порядок ниже пределов детектирования, полученных с помощью АЭД. Преимущество АЭД перед ЭЗД состояло только в его более высокой селективности. Пределы детектирования полихлорированных бифенилов, полученные методом ГХ-АЭД, были более высокими (250-400 пг), чем при определении ПХБ методом ГХ-ЭЗД (0.02-0.04 пг), но сигнал по О практически не зависел от структуры, и общее количество ПХБ можно было определить с использованием единого стандарта, принадлежащего к классу ПХБ, с точностью 5-10% [20]. Аналогично, для семи ПХБ, содержащих от трех до семи атомов хлора в молекуле, коэффициенты чувствительности АЭД по хлору, в отличие от ЭЗД, были приблизительно одинаковы, и определение ПХБ в биологических пробах было проведено методом количественного анализа без градуировки [21]. Факторы отклика индивидуальных ПХБ по хлору различались на 1-6%, по углероду - на 1.5-6%, но по водороду — на 1-45%, т.е. сигнал по водороду зависел от структуры даже внутри одного класса соединений. Пределы детектирования составляли 250-400 пг. Для количественного определения метилсульфонилполихлорированных бифенилов и ДДЕ и их метаболитов в тканях животного происхождения в качестве газохроматографических детекторов использовали АЭД и ЭЗД [22]. При работе с АЭД для каждого определяемого соединения использовали отдельный градуировочный график. Регистрацию сигналов проводили по каналам углерода, серы и хлора. При использовании АЭД полученные результаты были более точными, хотя в целом результаты определения серы методами ГХ-АЭД и ГХ-ЭЗД хорошо согласовывались. В работе 1983 года [23] были показаны преимущества использования атомно-эмиссионного детектора по сравнению с ПИД с точки зрения проведения количественного анализа без градуировки. Было изучено 53 модельных соединения, содержащих такие гетероатомы, как D, О, N, F, О, Вг, I, S, Р, Hg, причем при использовании АЭД регистрация сигнала велась для них одновременно. Использование АЭД давало более близкий к истинному ответ о содержании вещества, хотя при проведении количественного анализа без градуировки наиболее достоверные результаты были получены по каналам тех элементов, которые вносили наибольший вклад в молекулярную массу анализируемого соединения.
Методика эксперимента
Имеющийся в нашем распоряжении атомно-эмиссионный детектор компании Agilent был сконфигурирован таким образом, что через плазму проходил поток гелия со скоростью 30 мл/мин, в который можно было добавлять от 0 до 3.5 мл/мин кислорода, от 0 до 2.6 мл/мин водорода и от 0 до 2.0 мл/мин смеси азот:метан (9:1). В некоторых случаях согласно рекомендации производителя вместо скорости потока гелия 30 мл/мин использовали повышенную скорость потока гелия: 220 мл/мин. Общепринятая процедура настройки потоков газов-реагентов, рекомендованная производителем прибора для достижения оптимального с точки зрения чувствительности и селективности режима, состояла из следующих этапов: 1) Начало подачи газа-реагента кислорода в поток гелия; 2) Изменение потока кислорода и его регулировка таким образом, чтобы отношение площадей пиков, зарегистрированных при 725 нм (эмиссия О) и 728 нм (эмиссия Не), было равным 0.12 ± 0.01; 3) Выключение подачи кислорода и начало подачи водорода; 4) Изменение потока водорода и его регулировка таким образом, чтобы отношение площадей пиков, зарегистрированных при 486 нм (эмиссия Н) и 492 нм (эмиссия Не), было равным 10 ± 1; 5) Выключение подачи водорода и начало подачи кислорода; 6) Измерение площади пика, зарегистрированного при 492 нм (эмиссия Не); 7) Начало подачи смеси метан:азот; 8) Измерение площади пика, зарегистрированного при 486 нм (эмиссия Н); 9) Изменение потока смеси метан:азот и его регулировка таким образом, чтобы отношение площадей пиков, зарегистрированных при 486 нм (эмиссия Н) и 492 нм (эмиссия Не), было равным 3.3 ± 0.2 (выключая подачу смеси метан: азот при измерении площади пика, зарегистрированного при 492 нм). После выполнения этой процедуры скорость потока кислорода через плазму составляла около 0.25 мл/мин, что соответствовало содержанию кислорода в гелии около 1%; скорость потока водорода — около 0.1 мл/мин, что соответствовало содержанию водорода в гелии около 0.3%; скорость потока смеси метан:азот - около 0.5 мл/мин, что соответствовало содержанию этой смеси в гелии около 2%. Эти условия здесь и далее мы будем называть «общепринятым» режимом работы детектора. Настройку прибора производили каждый раз после его включения. В данной работе производили одновременную регистрацию следующих групп элементов: - С (496 нм), Н (486 нм), С\ (479 нм) и Вг (478 нм); - С (193 нм), N (174 нм) и S (181 нм); - С (193 нм), Р (178 нм) и S (181 нм). В некоторых случаях также производили отдельную регистрацию О (171 нм) и F (690 нм). 2.3.2. Приготовление смесей модельных соединений для изучения возможности определения отношений чисел атомов элементов ДЛЯ изучения зависимости сигналов АЭД по углероду и водороду от структуры и количества компонента путем определения отношений и 7«я в молекулах н-алканов использовали растворы, содержащие 5x10",1x10",5x10", 7 7 1x10" и 5x10" гімкл модельных углеводородов Сц-Сіб.
Исходные растворы индивидуальных компонентов, содержащие по 5x10"5 гімкл н-алканов в гексане, готовили растворением около 50 мг каждого углеводорода в 1 мл гексана. Необходимые для работы модельные смеси готовили из исходных растворов методом смешения и последовательного разбавления гексаном. Для определения отношений Пс1пн в молекулах бензола и толуола при использовании гексана в качестве стандарта производили ввод 0.2 мкл неразбавленных гексана, бензола и толуола в инжектор ГХ с помощью автодозатора в режиме с делением потока с коэффициентом деления 1:500, что соответствовало вводу количеств этих соединений, равных приблизительно (3-И)хЮ"7г. Для изучения возможности определения отношений чисел атомов элементов в молекулах соединений других классов использовали модельные смеси, состав которых приведен в табл. 7. Для определения отношений псіпн в каждую смесь в качестве внутреннего стандарта, отличающегося по структуры и/или элементному составу от остальных компонентов, добавляли н-алкан. Приготовление растворов для изучения возможности проведения количественного анализа без градуировки требовало максимальной точности взвешивания и смешения навесок компонентов в одной ёмкости перед добавлением растворителя. Поскольку модельные углеводороды при комнатной температуре находились в жидком состоянии, необходимо было исключить возможность искажения количественного состава модельной смеси за счёт частичной сорбции компонента в шприце и последующего его смыва при отборе следующего компонента. Поэтому для отбора навесок компонентов модельных смесей использовали одноразовые стеклянные капилляры. Пузырек объемом 2 мл помещали на чашку аналитических весов, измеряли его массу, и стеклянными капиллярами последовательно дозировали в него навески компонентов смеси, регистрируя изменение веса пузырька. Для отбора каждого следующего компонента использовали новый стеклянный капилляр.
После того, как все компоненты смеси были перенесены в пузырек и взвешены, в пузырек микрошприцем добавляли растворитель. Полученный раствор методом последовательных разбавлений доводили до необходимого уровня концентраций. Таким способом была приготовлена модельная смесь №11 следующего состава: СііН24-3.32х10"8г/л кл; Сі2Н26 -2.75x10"8 г/мкл; СізН28-1.03х10"7г/л л77; СнНзо- 1.57x10"7 г/мкл; Сі6Н34 - 9.40х 10"8 г/мкл. 2.3.4. Извлечение активных компонентов таблетированных фармацевтических препаратов в органический раствор Извлечение активных компонентов из таблетированных фармацевтических препаратов в органический раствор проводили методом жидкостной экстракции в ультразвуковом поле. Одну таблетку каждого из препаратов взвешивали на аналитических весах и затем растирали до однородного порошка в ступке при помощи пестика. Навеску полученного порошка (50-100 мг) помещали в пузырёк объемом 2 мл, в который затем добавляли 1.5 мл органического экстрагента. В качестве экстрагентов использовали такие растворители, как ацетонитрил, ацетон, этанол и метанол. Для растворения активного компонента фармацевтических препаратов в экстрагенте использовали активацию ультразвуковым полем в течение 15 минут. Затем раствор центрифугировали в течение 5 мин со скоростью 4000 об/мин. Далее надосадочную жидкость сливали и для получения раствора с определенной концентрацией активного компонента при необходимости разбавляли экстрагентом. Полученный раствор использовали в дальнейших исследованиях. 2.3.5. Определение компонентов модельных смесей и активных компонентов таблетированных фармацевтических препаратов методом ГХ-АЭД ДЛЯ разделения компонентов смесей углеводородов использовали кварцевую капиллярную колонку НР-1 (Agilent, Германия) 25 м х 0.32 мм х 0.17 мкм с привитой неподвижной фазой 100% диметилполисилоксан. Для разделения компонентов смесей модельных соединений всех остальных классов, а также для отделения активных компонентов фармацевтических препаратов от примесей и растворителя — использовали колонку HP-5MS (Agilent, Германия) 25 м х 0.25 мм х 0.25 л юи с привитой неподвижной фазой 5% дифенил 95% диметилполисилоксан. Ввод проб осуществляли с помощью шприца на \0мкл, установленного в автодозатор. Неразбавленные бензол, толуол и гексан вводили в инжектор ГХ последовательно в режиме с делением потока с коэффициентом деления 1:500; вводимый объем каждого соединения составлял 0.2 мкл. Ввод модельных смесей № 3 и 9 осуществляли в режиме с делением потока с коэффициентом деления 1:100. Ввод остальных проб осуществляли в режиме без деления потока; для удаления остатков растворителя линию сброса автоматически открывали через 2 мин (коэффициент деления потока 1:10). Объем вводимой пробы каждой модельной смеси составлял 1 мкл. Скорость потока газа-носителя через колонку составляла 1-5 мл/мин. Температуру устройства ввода пробы и соединительной линии хроматографа и атомно-эмиссионного детектора изменяли в пределах 250-300С.
Изучение возможности определения отношений пс/пн для разных классов органических соединений при использовании вещества стандарта, отличающегося по структуре и составу элементов от определяемых компонентов
Как уже обсуждалось в обзоре литературы, в имеющихся на сегодняшний день публикациях информация о возможности регистрации сигналов АЭД по разным элементам, независимых от структуры и элементного состава исследуемых соединений, представлена противоречиво. Как правило, в тех работах, в которых утверждается о независимости сигнала ГХ-АЭД от структуры, рекомендуется использовать вещество-стандарт, близкое по структуре и составу элементов к определяемым соединениям, что неприемлемо при определении неизвестных компонентов. Поэтому мы решили изучить зависимость сигналов по углероду и водороду для широкого круга С, Н, N, О, F, CI, Br, Р и S-содержащих органических соединений при использовании вещества-стандарта со структурой и составом элементов, отличающимися от исследуемых. 3.2.1. Определение отношений пс/пн для соединений разных классов при использовании в качестве стандарта вещества, отличающегося от определяемых по структуре и составу элементов Для изучения возможности регистрации соответствующих сигналов, независимых от структуры и элементного состава определяемого компонента, нами была исследована возможность определения отношений псіпн Для модельных соединений, содержащих различные элементы и принадлежащих таким классам соединений, как ароматические и полиароматические углеводороды, три-алкилфосфаты, летучие хлор- и бромсодержащие углеводороды, полихлориро-ванные бифенилы, алкилсульфиды, хлорфенолы, азотсодержащие пестициды и фторсодержащие соединения. Полный перечень модельных соединений приведен в табл. 5 в Разделе 2.2. Мерой независимости сигналов по углероду и водороду от структуры и состава элементов исследуемых веществ являлась точность определения отношений ПсІПН. В качестве вещества-стандарта использовали н-алкан, т.е. соединение, отличающееся по структуре и составу элементов от определяемых. Выбор «-алкана осуществляли таким образом, чтобы его хроматографический пик не перекрывался с пиками других компонентов смеси. Даже в том случае, когда концентрации всех компонентов смеси и вещества-стандарта одинаковы, нельзя исключить влияние концентрации соответствующего элемента в плазме на результат определения отношений пс1пн. За счет различий в структуре и элементном составе содержание углерода и водорода в молекуле вещества-стандарта может в 2-5 раз отличаться от их содержания в молекулах определяемых соединений при равных концентрациях этих соединений.
Таким образом, при определении отношений псіпн с использованием в качестве стандарта соединения со структурой и составом элементов, отличающимися от структуры и состава элементов определяемого соединения, мы всегда будем наблюдать смешанное влияние на результат различий в структуре и в концентрации по элементу. Кроме того, из данных, полученных для «-алканов в различных концентрациях, следовало, что в найденных нами условиях (максимальное содержание кислорода в гелии) правильность определения отношений псіпн не зависела от концентрации. Поэтому для изучения возможности определения отношений псіпн для разных классов соединений мы ограничились выбором одинаковых или близких концентраций компонентов модельных смесей, включая вещество-стандарт. Для разделения компонентов смесей выбранных нами классов мы ограничились выбором одной хроматографической колонки с фазой HP-5MS типа SE-54 (5% дифенил 95% полидиметилсилокеан), поскольку она более универсальна для разделения соединений, полярности которых различаются. Нами была выбрана следующая температурная программа: начальная температура 40 или 60С (в течение 2 мин; начальная температура выбиралась в зависимости от температуры кипения растворителя), нагрев со скоростью 10- 20С/мин (в зависимости от смеси) до 290С, изотерма 290С до выхода последнего компонента. При использовании этой программы пики компонентов модельных смесей были полностью разделены. Тем не менее, в ряде случаев форма пиков была несимметричной, что могло быть обусловлено влиянием детектора, а не системы разделения. В табл. 11 представлены результаты определения отношений пс1пн для соединений, принадлежащих к различным классам. Чтобы сравнить общепринятый режим с режимом, предлагаемым нами, отношения пс1пн определяли при содержании кислорода в гелии, равном 1 и 10%, соответственно. В качестве веществ-стандартов использовали н-алканы, т.е. соединения со структурой и составом, отличающимися от структуры и состава изучаемых соединений. Как видно из табл. 11, при увеличении содержания кислорода в гелии с 1 до 10% относительная погрешность определения отношений пс/пн для всех изученных модельных соединений, за исключением 1-бром-2,3,5,6-тетрафторбензола, уменьшалась до 1-8% и практически не зависела от структуры и элементного состава анализируемого соединения.
В то же время при содержании кислорода в гелии, равном 1%, погрешность определения существенно зависела от того, насколько используемое вещество-стандарт было близко по структуре к определяемому соединению. Исключение составил 1-бром-2,3,5,6-тетрафторбензол, относительная погрешность определения отношений пс/пн для которого составляла более 40% в обоих режимах. По-видимому, это можно объяснить высоким содержанием фтора, который прочно связывал углерод и препятствовал его атомизации в гелиевой плазме. 3.2.2. Изменение пределов детектирования по углероду и водороду для различных классов соединений при использовании максимального содержания кислорода в гелии В табл. 12 сопоставлены пределы детектирования (ПД) (на элемент), полученные для изученных модельных соединений, принадлежащих различным классам, при общепринятом и максимальном содержании кислорода в гелии, поступающем в плазму. Видно, что при увеличении содержания кислорода в гелии с 1 до 10% пределы детектирования по углероду и водороду увеличивались в 3-8 раз и 3-10 раз, соответственно. Для вычисления отношений чисел атомов углерода и водорода в молекуле необходимо использовать площади хроматографических пиков по обоим каналам, поэтому из полученных нами данных можно сделать следующий вывод: изменение содержания кислорода в гелии с 1 до 10% приводит к падению чувствительности приблизительно на порядок. Это является ограничением предложенного нами способа повышения точности определения отношений пс1пн. Таким образом, в результате проведенного нами исследования на примере большого класса органических соединений, содержащих различные гетеро-атомы, была показана возможность достижения условий, в которых сигналы АЭД по углероду и водороду практически не зависели от структуры анализируемого вещества и вещества-стандарта, при этом относительная погрешность определения отношений псіпн составляла в среднем около 4% и не превышала 8%. Эти условия обеспечивались при содержании кислорода в гелии, равном 10% (максимальном возможном в использованном приборе). Ограничением такого подхода является увеличение пределов определения по веществу примерно на порядок. 3.2.3. Снижение концентрационного предела обнаружения среднелетучих органических соединений Как показано в предыдущем разделе, пределы детектирования по углероду и водороду для изученных соединений в общепринятых условиях составляли 11 17 около 10" г и 10" г и выше, а при использовании гелиевой плазмы, обогащенной кислородом - около 10"10 г и 10"11 г, соответственно, в зависимости от содержания углерода и водорода в молекуле и формы пика. При этом, как правило, объем анализируемой пробы как в наших экспериментах, так и в опубликованных работах по использованию ГХ-АЭД, составлял 1 мкл. Актуальным являлось снижение концентрационного предела обнаружения по этим, а также по другим элементам как в общепринятых условиях анализа методом ГХ-АЭД, так и особенно в найденных нами, которые обеспечивают наиболее точное определение отношений пс/пн, но в то же время в этих условиях наблюдается увеличение пределов детектирования.
Определение содержания компонентов «неизвестной» смеси углеводородов за счет определения их элементного состава
Важной особенностью количественного анализа смесей углеводородов неизвестного состава без градуировки по каждому компоненту методом ГХ-АЭД является возможность определения их содержания на компонент, поскольку углеводороды - единственный класс соединений, элементный состав которых можно установить при условии точного определения отношений пс1пн. Вычисление процентного содержания углерода в молекулах углеводородов при использовании данных ГХ-АЭД проводится по формуле (5): молекуле данного углеводорода. Из формулы (5) видно, что погрешность определения процентного содержания углерода мало зависит от погрешности определения отношений пс/пн, так как эта величина «12. Соответственно, количество каждого из компонентов смесей углеводородов может быть вычислено по формуле (6): т = 100xmc/(wc, %) (6), где т - количество данного углеводорода на компонент, тс — количество углерода, соответствующее определяемому углеводороду. Для того, чтобы изучить возможность определения содержания компонентов неизвестных смесей углеводородов, мы использовали смесь №11. Для компонентов этой смеси за счет определения отношений пс1пн экспериментально определяли процентное содержание углерода в них и затем с использованием полученного значения процентного содержания углерода рассчитывали содержание каждого компонента. В табл. 20 и 21 представлены результаты определения процентного содержания углерода в молекулах углеводородов, входящих в состав модельной смеси №11, и соответствующие концентрации этих углеводородов, рассчитанные с использованием полученных данных об их элементном составе. Как видно из данных, приведенных в табл. 20, для «неизвестных» углеводородов на основании данных определения отношений пс/пн в предложенных нами условиях с плазмой, обогащенной кислородом, возможно определение процентного содержания углерода с высокой точностью. При этом точность определения процентного содержания углерода для компонентов смесей углеводородов практически соответствует точности определения, специфицируемой для современных элементных анализаторов при анализе высокочистых индивидуальных соединений.
Из табл. 21 видно, что при использовании гелиевой плазмы, обогащенной кислородом, и экспериментальных значений процентного содержания углерода в молекулах компонентов углеводородных смесей, рассчитанных на основании данных определения отношений пс/пн, возможно определение содержания компонентов смесей углеводородов без градуировки по каждому компоненту с относительной погрешностью около 4%. В то же время при использовании общепринятых условий эта погрешность может достигать 17%. Способ определения как м?с,%, так и содержания компонентов смесей углеводородов без градуировки по каждому компоненту с использованием ГХ-АЭД предложен нами впервые. Глава 6. Изучение возможности определения активного компонента фармацевтических препаратов методом ГХ-АЭД В настоящее время в мире остро стоит проблема обнаружения фальсифицированных фармацевтических препаратов. По оценкам экспертов, в России фальсификаты составляют 10-12% рынка фармацевтических препаратов. Различают пять типов фальсифицированных фармацевтических препаратов: 1) препараты, не содержащие активного вещества; 2) препараты, в которых действующее вещество заменено на другое, более дешевое и менее эффективное; 3) препараты, в которых действующее вещество содержится, как правило, в меньшей концентрации (20-30%), чем требуется; 4) препараты, в которых содержится специфицируемое действующее вещество в соответствующей концентрации, однако действующее вещество получено не специфицируемым производителем, а неизвестным, не несущим ответственности за качество действующего вещества и состав примесей в нем, но действующего под маркой производителя патентованного продукта. К этой же группе в определенной степени относятся препараты-дженерики, выпускаемые под другим или близким к оригинальному названием, которые в идеале должны выпускаться по запатентованной технологии (после окончания срока действия патента), а в действительности они могут быть получены по любой другой технологии и содержать другие примеси, обладающие неизвестными физиологическими свойствами; 5) просроченные препараты, которые должны подлежать уничтожению, но поступают в продажу за счет изменения срока годности, указанного на упаковке. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, около 60% фальсифицированных фармацевтических препаратов относятся к первому типу. Обнаружение фальсифицированных фармпрепаратов первого, третьего и, частично, второго типа проводят при использовании таких методов, как титриметрия, спектрофотометрия, тест-методы, ВЭТСХ, ВЭЖХ и ИК-спектро-скопия [125]. Эти методы малопроизводительны, так как требуют наличия стандартных образцов как активного компонента, так и соответствующего фармпрепарата, проведения предварительной градуировки по этому компоненту и регулярной ее проверки. Кроме того, является желательным знание состава примесей и исключение их влияния на определение содержания активного компонента. Поэтому быстрый скрининг проб фармпрепаратов на соответствие оригинальному препарату при использовании существующих подходов неосуществим, что является одной из причин роста выпуска фальсифицированной продукции.
Нами не было найдено ни одной работы, в которой для установления подлинности того или иного фармацевтического препарата использовали бы метод ГХ-АЭД. Однако, по нашему мнению, именно этот метод может быть успешно применен для быстрого скрининга фармацевтических препаратов в отсутствие стандартов определяемых соединений и выявления поддельных фармацевтических препаратов, принадлежащих к первой, второй и третьей группе фальсификатов. При условии отработки способа выделения и концентрирования примесей, метод также может быть перспективен с точки зрения выявления поддельных препаратов, принадлежащих к четвертой и пятой группе фальсификатов. Нами была исследована возможность проведения скрининга фармацевтических препаратов на соответствие специфицированному активному компоненту и его содержанию методом ГХ-АЭД для первых трех групп фальсификатов по следующей схеме: 1) экстракция активного компонента фармацевтического препарата органическим растворителем; разбавление полученного экстракта до концентрации, приемлемой для проведения ГХ-АЭД определения активного компонента; 2) регистрация хроматограмм экстракта фармацевтического препарата ГХ-АЭД по каналам тех элементов, которые входят в состав активного компонента этого препарата, для первичного установления соответствия активного компонента по элементному составу; 3) регистрация хроматограмм экстракта фармацевтического препарата по каналам углерода и водорода в режиме, обеспечивающем минимальную зависимость сигналов детектора по каналам С и Н от структуры и концентрации веществ (содержание кислорода в гелии 10%); регистрация хроматограмм внешнего стандарта в том же режиме; 4) обработка полученных хроматограмм, вычисление отношений пс1пн и содержания (по каналу углерода) для активного компонента фармацевтического препарата с использованием информации о процентном содержании углерода в молекуле активного компонента; исходя из полученных данных, вывод о соответствии качественного и количественного состава активного компонента фармацевтического препарата специфицированному. Ограничением такого подхода являются его применимость только к тем фармацевтическим препаратам, активный компонент которых находится в форме, пригодной для газохроматографического анализа; а также требование полноты извлечения активного компонента в органический растворитель, которая устанавливается в процессе экстракции. Это требование должно быть выполнено и при стандартном подходе. Основным критерием при выборе фармацевтических препаратов, используемых в качестве объектов исследования, было выполнение требования по летучести и термической стабильности активного компонента.
