Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1, РЕГИСТРАЦИЯ АКТИВНОСТИ МЕЧЕНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА СДОЯХ ХРОМА
ТОГРАФИЧЕСКИХ СОРБЕНТОВ . . . . . 10
-
Зависимость результатов радиохроматографического анализа от характера распределения меченого вещества по толщине слоя сорбента 10
-
Эффективность регистрации меченых соединений, нанесенных на хроматографические сорбенты 14
-
Структура важнейших хроматографических сорбентов . .19
-
Особенности измерения активности на хроматографических сорбентах, обусловленные применением ецин-тилляционного метода .22
-
Аппаратура для регистрации активности на радио-хроматограммах и методы обработки результатов измерений , 23
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 27
-
Материалы 27
-
Методы исследования распределения меченого вещества и сцинтиллятора по толщине слоя сорбента . . 28
-
Измерение активности на хроматограммах и определение, относительной эффективности регистрации ... 31
-
Определение степени десорбции с сорбента меченых соединений раствором сцинтиллятора 34
-
Определение ослабления света сцинтилляций слоями хроматографических сорбентов и влияния отражающих свойств подложки на результаты измерений ... .34
-
Определение разрешающей способности хроматогра-фического счетчика » . . . 35
-
Анализ компонентов нуклеиновых кислот методом тонкослойной хроматографии на силикагеле . 36
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЗВДЕНИЕ
3. ФОРМИРОВАНИЕ ПРОФИЛЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ВЕЩЕСТВА ПО ТОЛЩИ
НЕ СЛОЯ СОРБЕНТА 41
3.1» Ослабление света слоями сорбентов .41
3.2. Формирование профиля концентрации вещества в
стартовых пятнах .... ........ .45
3.3, Формирование окончательного профиля концентра
ции вещества на хроматограммах .......... .54
4. ОСОБЕННОСТИ РЕГИСТРАЦИИ МЕЧЕННЫХ ТРИТИЕМ СОЕДИНЕНИЙ
НА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ СОРБЕНТАХ 65
-
Влияние молярной активности меченного тритием препарата на эффективность его регистрации 65
-
Относительная эффективность регистрации меченных тритием соединений на бумажных хроматограммах 68
-
Относительная эффективность регистрации меченных тритием соединений на тонких слоях целлюлозы ... .80
-
Относительная эффективность регистрации меченных тритием соединений на слоях модифицированной целлюлозы 83
-
Относительная эффективность регистрации меченных тритием соединений на слоях силикагеля 87
-
ВЛИЯНИЕ СЦИНТИЛЛЯТОРА НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ РЕГИСТРАЦИИ МЕЧЕННЫХ ТРИТИЕМ СОЕДИНЕНИЙ НА СЛОЯХ СОРБЕНТОВ 94
-
ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ РАДИОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА МЕЧЕННЫХ ТРИТИЕМ СОЕДИНЕНИЙ НО
_ 4 -
-
Сравнение сцинтилляционного и ионизационного способов регистрации активности на радиохро-матограммах » .110
-
Возможность введения поправок на различную эффективность регистрации меченных тритием соединений 116
-
Способы уменьшения различий в эффективности регистрации меченых соединений ........... 121
-
Погрешности радиометрического анализа хромато-
грамм сцинтилляционным методом ..... 127
ВЫВОДЫ 134
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 136
ПРЙЯОШЕНИЕ I, Формулы некоторых соединений, использованных при проведении исследований ........ 151
ПРЙДОЖЕНИЕ 2. Счетчики для сцинтилляционных измерений
активности меченых соединений на радиохромато-
граммах 154
Введение к работе
Анализ методами радиохроматографии в настоящее время получил исключительно широкое распространение в связи с повсеместным использованием соединений, меченных радионуклидами. Подобные соединения применяют при проведении исследований в биохимии, медицине, молекулярной биологии и других областях науки.
Одной из основных характеристик качества меченых соединений является радиохимическая чистота (РХЧ). Величина ее выражается, как правило, в процентах и показывает долю активности препарата, которая приходится на целевое соединение. Радиохимическими примесями при этом считаются присутствующие в препарате меченые соединения, отличные от целевого по химической форме.
Необходимость контроля РХЧ связана с тем, что использование меченых соединений с недостаточно высокими значениями этого параметра может привести к существенным искажениям результатов исследований с применением радиоактивной метки.
В большинстве случаев РХЧ меченых соединений определяют хроматографически. Для анализа нелетучих соединений применяют методы жидкостной колоночной, бумажной или тонкослойной хроматографии. По мере развития высокоэффективной жидкостной колоночной хроматографии (ВЭЖХ), этот метод все шире используется для определения РХЧ. Однако, при наличии в препарате примесей, обладающих очень большим временем удерживания или сорбирующихся на колонке необратимо, точное определение РХЧ методом ВЭЖХ становится невозможным.
От этого недостатка свободны методы анализа с применением бумажной и тонкослойной хроматографии. Для определения РХЧ на готовой хроматограмме определяют распределение активности по ее длине. Расчет проводят по формуле: где РХЧ - радиохимическая чистота целевого компонента; А - активность целевого компонента; Z.&L - сумма активностей всех компонентов смеси, включая целе-вой.
В большинстве случаев, однако, при расчете величины РХЧ используют не величину активности соответствующих хроматографи-ческих зон, а пропорциональную ей сумму импульсов, зарегистрированных приборами при измерениях. Как известно, число импульсов, регистрируемое приборами, связано с активностью пробы соотношением /К= f/. А. Коэффициент пропорциональности /^ называется эффективностью регистрации и зависит от свойств нуклида, используемого детектора, физического состояния образца и т.д.36
При вышеупомянутой замене величины активности на соответствующее число импульсов, необходимым условием является равен- ^оэффициент пропорциональности ^ между величинами абсолютной активности и числом регистрируемых импульсов было рекомендовано называть коэффициентом регистрации /I/, сохранив термин "эффективность регистрации" лишь для обозначения доли частиц, зарегистрированных детектором, от общего числа попавших в него частиц* Для целей настоящего исследования будут иметь значение не абсолютные, а относительные значения коэффициента регистрации, вычисленные относительно коэффициента регистрации одного из веществ, измеренного в тех же условиях и при- ство эффективности регистрации на всех участках хроматограм-мы в процессе измерений. Выполнение этого условия обычно молчаливо предполагается, однако справедливость такого предположения никем не была строго доказана. Более того, имеются веские основания считать, что далеко не во всех случаях удается обеспечить необходимое равенство эффективностей. Основные проблемы здесь возникают при работе с соединениями, меченными низкоэнергетическими А-излучателями, и в первую очередь тритием.
Тритий очень широко используют для получения меченых органических веществ. В первую очередь это связано с доступностью и дешевизной исходного изотопного сырья, с возможностью ввести тритий практически во все органические соединения, а также с весьма благоприятным сочетанием радиофизических характеристик этого нуклида. Очень низкая энергия излучения трития позволяет свести к минимуму побочные воздействия и делает его незаменимым при проведении многих биохимических и медицинских исследований.
В то же время свойства трития, как радионуклида, приводят к возникновению серьезных проблем при хроматографическом анализе меченых соединений. Пробег основной массы А -частиц трития (Емакс#= 18,6 кэВ, ЕсредНв= 5,6 кэВ /2/) крайне мал. В ма- нятого за стандарт. Поскольку величины относительной эффективности регистрации и относительного коэффициента регистрации при этом равны между собой, а термин "эффективность регистрации" является общепринятым (см., например, /76,78,81 и др./), именно он и будет использоваться в данной работе. териалах с плотностью I г/см3 90$ энергии излучения этого нуклида теряется на расстоянии 0,5 мкм от источника /3/. Плотность хроматографических сорбентов составляет около 1,5 г/см3 для целлюлозы /4/ и около 2,2 г/см3 для силикагеля /5/, а толщина хроматограмм колеблется от 0,15 до 0,4 мм для бумажных и от 0,1 до 0,2 мм для тонкослойных. В связи с этим результаты определения активности на хроматограммах становятся зависимыми от характера распределения данного меченого соединения по толщине слоя сорбента, а также от плотности и пористости самого сорбента.
Анализ литературных источников показывает, что кроме этого для соединений, меченных тритием, наблюдается явление зависимости эффективности регистрации на хроматограммах от химической природы меченого вещества.
В такой ситуации практически невозможно достоверное определение РХЧ меченного тритием соединения по общепринятой методике, предполагающей во всех случаях равенство эффективностей регистрации различных соединений.
Следует отметить, что указанная проблема имеет значение не только для случая определения РХЧ как паспортной характеристики выпускаемых промышленностью меченых соединений. Те же самые факторы влияют на погрешность определения выходов химических реакций, констант их скоростей, количеств побочных продуктов и других величин, вычисляемых из распределения активности на хроматограмме смеси меченных тритием органических соединений.
Целью настоящей работы являлось определение источников погрешностей при радиохроматографическом анализе методами бу- мажной и тонкослойной хроматографии на различных сорбентах соединений, меченных тритием, а также разработка условий анализа, обеспечивающих высокую достоверность получаемых результатов.
В процессе работы была впервые экспериментально доказана связь результатов измерения активности на хроматограммах с характером распределения меченных тритием соединений по толщине слоя сорбента; изучены закономерности формирования профиля такого распределения на всех стадиях получения хроматограммы.
Изучено явление зависимости эффективности регистрации на хроматограммах от природы меченого соединения и сорбента. Впервые получены значения относительной эффективности регистрации более 20 меченных тритием биологически активных соединений (компоненты нуклеиновых кислот, углеводы, аминокислоты).
Исследовано влияние состава сцинтилляционных смесей на результаты радиохроматографического анализа меченых соединений. Проанализирован вклад различных факторов в общую погрешность определения состава смесей меченых соединений на хроматограммах и предложен оптимальный метод проведения радиохроматографического анализа соединений, меченных тритием.
На основе анализа различных конструкций сцинтилляционных сканирующих счетчиков разработана и сконструирована автоматизированная система на базе мини-ЭВМ для проведения радиохро-матографических измерений.
I. РЕГИСТРАЦИЯ АКТИВНОСТИ МЕЧЕНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА СЛОЯХ ХРОМАТОГРАШЧЕСКИХ СОРБЕНТОВ До настоящего времени, несмотря на повсеместное использование радиохроматографии для анализа меченых соединений, практически не проводилось систематических исследований, посвященных выяснению особенностей хроматографического анализа меченых препаратов, В мировой литературе имеется единственная монография /6/, посвященная вопросам радиохроматографии. Эта работа носит характер методического пособия и вопросы, связанные с достоверностью результатов количественного радиохроматографического анализа в ней практически не затронуты. В то же время опубликовано значительное количество отдельных наблюдений, свидетельствующих о неоднозначности интерпретации результатов радиохроматографического анализа.
I.I. Зависимость результатов радиохроматографического анализа от характера распределения меченого вещества по толщине слоя сорбента
Метод бумажной хроматографии стали применять для разделения меченых соединений с начала 50-х годов, и уже в 1954 году авторы работы /7/ отмечали, что при измерении на хроматограмме активности меченного углерод«н-14 соединения активность со стороны нанесения вдвое превышает активность, зарегистрированную с обратной стороны. Наблюдаемое явление авторы отмечают просто как интересный факт и никак не комментируют.
В 1956 году был предложен способ определения удельной активности меченных углеродом-14 соединений на бумажных хроматограм-мах по высотам или площадям регистрируемых пиков /8/. Первоначально была сделана попытка использовать калибровочные графики. Авторы утверждали, что удельная активность может быть определена - II - с точностью не хуже 3%, отмечая при этом, что калибровочная прямая не воспроизводится от полоски к полоске сорбента. Каждый раз вместе с неизвестным веществом необходимо было наносить стандарт. Подобную ситуацию объясняли неконтролируемым остаточным содержанием в сорбенте хроматографических растворителей, которые увеличивали поглощение fl-частиц в слое.
Весьма вероятно, что колебания результатов в этом случае были обусловлены неконтролируемыми условиями сушки хроматограмм и соответствующими изменениями профиля распределения меченого вещества по толщине слоя сорбента.
Автор работы /9/, опубликованной в I960 году, исследовал возможности регистрации меченных тритием соединений на бумажных хро-матограммах с помощью счетчиков Гейгера-Мюллера без окошек. Он отмечал, что из-за малого пробега я-частиц трития регистрация распадов возможна только из очень тонкого поверхностного слоя хрома-тограммы и пришел к выводу о невозможности в таких условиях получения эффективности регистрации выше 1%, В этой же работе отмечено, что максимальная асимметрия распределения получается при нанесении меченого соединения на хроматограмму, т.е. в стартовом пятне. В результате последующего развития хроматограммы вещество может распределяться равномерно.
В работах /10,11/ также отмечено, что после нанесения на хроматограмму раствора вещества и испарения растворителя основная масса препарата остается на поверхности. В результате получается значительная асимметрия профиля распределения вещества по толщине слоя сорбента и измерения эффективности регистрации дают неверные результаты. Авторы этих работ считают, что для получения достоверных результатов достаточно, чтобы пятно вещества сдвинулось со старта под действием элюирующего растворителя. В работе /10/ при- водится величина эффективности регистрации меченных тритием соединений в этих условиях - 0,7%. Измерения были сделаны на газовом проточном пропорциональном счетчике без окошка.
Несколько позже было установлено /12,13/, что достижение равномерного распределения вещества по толщине слоя в процессе хрома-тографирования еще не гарантирует получения достоверных результатов при последующих измерениях активности. Авторы работы /12/ отмечали, что при неравномерной сушке (имеется в виду возможность преимущественного испарения растворителя с одной из поверхностей хроматограммы) вещества могут неодинаково мигрировать к разным поверхностям, и указали на необходимость исследования профиля концентрации вещества по толщине слоя сорбента.
В работах /13,14/ тоже отмечается, что при высушивании хроматограммы потоком горячего воздуха, направленным на одну из сторон полоски, распределение вещества, меченного углеродом-14, получается сильно асимметричным. При равномерной сушке асимметрии не наблюдалось. Автором работы /13/ была сделана попытка связать степень асимметрии, возникающей при высушивании, с величиной R^ вещества в данной хроматографической системе, однако такой закономерности обнаружить не удалось.
Меченные тритием вещества использовали в своих исследованиях авторы работы /15/. В некоторых их экспериментах различие в счете с разных сторон хроматограммы, обусловленное неравномерной сушкой, достигало 5 раз. В этой же работе показано, что регистрируемая активность пятен меченных тритием стероидов, измеренная ионизационным методом сразу после нанесения, значительно превышает активность тех же пятен, измеренную на развитой хроматограмме.
В работе /16/ сообщается о попытках воздействовать на геометрическое распределение вещества по сечению хроматограммы. Авторы - ІЗ - этого сообщения закрывали одну сторону хроматограммы во время хроматографирования полиэтиленом; готовые хроматограммы опрыскивали водой с последующей интенсивной сушкой теплым воздухом; готовые непросушенные хроматограммы погружали в раствор полистирола в бензоле с добавкой 2,5-дифенилоксазола, Лишь в последнем случае наблюдалось существенное увеличение площади регистрируемых пиков. Однако, в связи с трудоемкостью подобной процедуры обработки, вряд ли можно широко использовать ее на практике.
Авторы всех перечисленных и ряда других работ (например, /17, 18/) отмечали, что различия в результатах измерения активности с разных сторон одной и той же хроматограммы обусловлены низкой проникающей способностью излучения трития или углерода-14 и определяются в каждом конкретном случае характером распределения меченого вещества по толщине слоя сорбента. Однако до настоящего времени не проводилось никаких исследований, направленных на выяснение закономерностей формирования профиля пятна по толщине слоя сорбента и на экспериментальное определение формы такого профиля. Единственная известная нам работа /19/, касающаяся геометрических очертаний пятен меченых веществ на хроматограммах, посвящена изучению формы пятен с поверхности и не касается вопросов распределения по толщине.
Вопросы влияния профиля распределения вещества по толщине слоя сорбента на результаты измерений на тонкослойных хроматограммах в литературе практически не получили освещения. Вероятно, это связано с тем, что наличие непрозрачной подложки не позволяет проводить измерения активности с двух сторон хроматограммы и экспериментально зафиксировать различия. Один из немногочисленных примеров влияния распределения на результаты измерений для тонко- - 14 -слойной пластины с целлюлозой приводится в работе /20/.
1.2. Эффективность регистрации меченых соединений, нанесенных на хроматографические сорбенты
Важнейшим условием получения достоверных результатов при измерениях активности на радиохроматограммах является равенство эффективности регистрации меченых соединений вне зависимости от их химической природы и положения на полоске сорбента.
В процессе исследований с применением меченых соединений, наряду с тем, что была установлена зависимость результатов измерений от характера распределения вещества по толщине слоя сорбента, накапливались и другие наблюдения. Они касались фактов зависимости эффективности регистрации от химической природы меченых веществ.
Так, авторы работы /21/ отмечают, что осажденные на бумажных фильтрах продукты частичного гидролиза меченных тритием молекул ДНК имеют существенно большую эффективность регистрации, чем меченый тимидинтрифосфат (ТТШ) в тех же условиях. Измерения проводились в жидком сцинтилляторе и эффективность регистрации полимерных молекул в 5 - 6 раз превышала эффективность для ТТФ. Наблюдаемое различие авторы объясняют тем, что сравнительно небольшие размеры молекул ТТФ позволяют им проникать в глубину фибров (капилляров) бумажного волокна. При этом резко возрастает поглощение fi-частиц материалом сорбента и эффективность регистрации снижается. Значительно более крупные молекулы ДНК не способны проникнуть внутрь капилляров.
В уже упоминавшейся работе /17/, наряду с замечаниями по поводу зависимости результатов измерений от распределения вещества по толщине хроматограммы, автор отмечает также факт разной эффектив- ности счета двух меченых соединений. Он обнаружил, что после хро-матографирования стеариновая кислота, меченная тритием, регистрируется пропорциональным счетчиком с эффективностью, в четыре раза большей, чем бензойная. По его мнению наблюдаемые различия могут быть обусловлены, например, большей летучестью бензойной кислоты, что приводит к снижению ее концентрации в поверхностных слоях хроматограммы. Автор не исключает и существования каких-то, пока неизвестных, фундаментальных законов бумажной хроматографии, согласно которым некоторые вещества движутся при хроматографировании у поверхностей слоя сорбента. В другой, более подробной своей работе /22/, тот же автор отмечает, что эффективность регистрации может изменяться еще и вследствие окисления малых количеств вещества, распределенного на значительной поверхности сорбента. Для получения достоверных результатов в таких условиях он предлагает использовать жидкостный сцинтилляционный метод измерений после элгоции вещества с хроматограммы.
Зависимость эффективности регистрации меченных тритием соединений от материала подложки изучал автор работы /23/. В качестве подложек были использованы различные сорта хроматографических бумаг (в том числе и ионообменные), слои целлюлозы и стекловолокно. В табл.1.1 представлена часть полученных им результатов. Все исследованные вещества мало растворимы в растворе сцинтиллятора, и поэтому автор сразу исключает возможность объяснения наблюдаемых различий в эффективности разной степенью перехода меченых соединений в сцинтиллятор.
В результате проведенных исследований он приходит к выводу, что в рассматриваемых условиях, при измерениях меченых соединений на фильтрах в жидком сцинтилляторе, главную роль в определении эффективности регистрации играет капиллярная структура используе-
Таблица I.I Эффективность регистрации меченных тритием соединений, нанесенных на сорбенты /23/ х 2-Метил-1,4-нафтохинондифосфат, тетранатриевая соль зе6Полиметилметакрилат мого сорбента. Нанесенные на фильтр вещества могут проникать глубоко в фибры или в аморфные (не кристаллические) области между цепочками сахарных остатков. Пробег &-частиц трития значительно меньше, чем диаметр фибрилл, поэтому эффективность регистрации зависит от степени прямого контакта молекул меченого вещества со сцинтилляционной средой. Вещества с большой молекулярной массой регистрируются с большей эффективностью, т.к. их молекулы не способны проникать внутрь фибров.
Эффективность регистрации повышается при измерениях на стекловолокне, у которого отсутствуют микрокапилляры, а также на ацети-лированной целлюлозе в связи с тем, что в процессе ее производства разрушается фибриллярная структура исходной целлюлозы.
При измерениях в жидком сцинтилляторе следует иметь в виду возможность растворения меченых соединений в сцинтилляционной жидкости и соответствующего увеличения эффективности регистрации /24/.
Следует отметить, что условия измерений для веществ, нанесенных на фильтры и опущенных в жидкий сцинтиллятор, и для веществ на радиохроматограммах не вполне идентичны. Однако, как будет показано ниже, многие закономерности, связанные со структурой сорбентов и природой меченых соединений, являются сходными для обоих способов.
Факты различной эффективности регистрации меченных тритием аминокислот и нуклеозидов на бумажных хроматограммах отмечали в работах /20,25/.
Одним из наиболее детальных исследований, посвященных особенностям регистрации тритированных соединений на целлюлозных сорбентах в жидких сцинтилляторах является работа /26/. В результате проведенных экспериментов ее авторы пришли к следующим выводам:
I) Наличие в сцинтилляционной системе целлюлозных сорбентов не вносит заметных изменений в механизм сцинтилляционного процесса (т.е. эффекты гашения сцинтилляций несущественны).
2).Бумажные фибры ведут себя как конгломерат капиллярных трубок, проницаемых только для водных растворов, в которые могут проникать вещества с небольшим размером молекул. Такие соединения, меченные тритием, могут не детектироваться по двум причинам: во-первых, молекулы жидкого ецинтиллятора не могут проникнуть в капиллярную микроструктуру, во-вторых, пробег j5-частиц слишком мал, чтобы добраться до ецинтиллятора. Эти особенности несущественны для больших меченных молекул, остающихся на поверхности капилляров целлюлозы.
3) Использование в сцинтилляционных смесях гидрофильных раство- рителей должно приводить к увеличению эффективности регистрации меченых соединений в присутствии воды (на влажных фильтрах) и это подтверждается экспериментально для сцинтилляторов на основе диоксана.
4) Стекловолокно ведет себя как конгломерат непроницаемых для веществ нитей, где молекулы могут располагаться только на поверхности. Поэтому на стекловолокне наблюдается выравнивание различий в эффективности регистрации высокомолекулярных и низкомолекулярных соединений.
Авторы работы /27/ отмечают, что в современных медико-биологических исследованиях очень часто применяют методику определения удельной активности самых разных соединений, в которой растворы этих веществ, нанесенные на фильтрующие подложки, опускают в жидкий сцинтиллятор. Полученную при измерениях скорость счета далее непосредственно переводят в величину удельной активности, совершенно не учитывая зависимости результатов подобных измерений от природы соединений, поглощения й -частиц материалом фильтра и т.п. Далее в работе /27/ приводятся результаты экспериментов, которые в очередной раз демонстрируют сложность ситуации, возникающей при измерениях по упомянутой методике. В заключение авторы приходят к выводу, что получение достоверных результатов возможно только в том случае, когда измеряемая проба вместе с фильтром полностью растворяется в сцинтилляционной жидкости.
Различия в эффективности регистрации меченных тритием соединений на фильтрах из ионообменной бумаги отмечены в работе /28/. Для получения достоверных результатов авторы этой работы предлагают перед измерениями полностью десорбировать вещества с фильтров.
Прямые указания на факты различной эффективности регистрации разных меченых соединений на тонких слоях неорганических сорбентов при измерениях на хроматограммах в литературе отсутствуют.
1.3. Структура важнейших хроматографических сорбентов
Одним из наиболее широко используемых в бумажной и тонкослойной хроматографии материалов является целлюлозное волокно. Его используют в виде листов (бумажная хроматография) либо в виде порошка, который наносится на подложки из различного материала (тонкослойные пластины).
Элементарным звоном макромолекулы целлюлозы является ангид-po-J) -глюкоза. Степень полимеризации в зависимости от происхождения целлюлозы и способа ее обработки может колебаться от 300 до 8000. Величину внутренней поверхности природного целлюлозного волокна однозначно охарактеризовать невозможно/Это связано с тем, что результаты определения внутренней поверхности целлюлозы сильно зависят от полярности и величины молекул сорбируемых газов и паров /4/.
В качестве особенностей структуры бумажного полотна в работе /9/ названы следующие:
Сложный гетерогенный состав, характеризующийся наличием в композиции бумаги как относительно длинных, так и коротких волокон.
Анизотропность по трем взаимно перпендикулярным направлениям бумажного листа, связанная с различием в ориентации волокон, в распределении их по размерам и т.д.
Капиллярно-пористый коллоидный характер, обусловливающий такие свойства бумаги, как впитывающая способность, воздухопро- ницаемость, гигроскопичность, деформация при изменении влажности, необратимое изменение свойств в результате сушки и другие.
Установлено, что связь между отдельными волокнами целлюлозы в бумаге осуществляется в основном за счет водородных связей между свободными гидроксильными группами отдельных целлюлозных цепочек, В механизме связывания могут участвовать диполи молекул воды, образующие различные мостиковые связи /29, с.318/.
Следует отметить, что процесс удаления влаги из целлюлозных материалов имеет для них особое значение /30/. При этом наряду с физическим удалением влаги из межволоконного пространства происходит образование новых водородных связей, а также резкое изменение электрических свойств поверхностного слоя целлюлозы. В связи с микрогетерогенностью целлюлозных волокон и с наличием в них аморфных участков с повышенным содержанием ге-мицеллюлоз кислотного характера, распределение зарядов на поверхности, волокна имеет мозаичный характер /31/. При малых расстояниях между отдельными волокнами электрические поля разных волокон компенсируют друг друга. Экспериментально установлено, что в процессе высушивания бумажного полотна на его поверхности возникают отрицательные электрические заряды, причем при снижении влажности с 60$ до 10% поверхностная плотность зарядов возрастает в 3 раза /31/. Наличие электрического заряда на поверхности волокон может оказывать влияние на распределение в массе сорбента ионизированных молекул меченых веществ. Электрические свойства целлюлозных слоев зависят и от природы растворителя, которым они пропитаны.
Наряду с целлюлозными сорбентами самое широкое распространение, особенно в тонкослойной хроматографии, получил силика-гель. Общая формула этого сорбента - S>i0^ 'х.И^0' элементарные пространственные ячейки представляют собой тетраэдры из атомов кремния и кислорода i.SlOA )t Полимерные цепи из таких ячеек образуют пористую структуру с развитой внутренней поверхностью. Для тонкослойной хроматографии используют порошок сили-кагеля с размерами частиц 5-40 мкм. Величина удельной поверхности силикагелей разных марок колеблется от 30 до 600 иг/г, размеры пор составляют 10 -25 нм /32,33/.
Основную роль в процессе адсорбции на силикагеле играют поверхностные гидроксильные группы, связанные с атомами кремния. Механизм адсорбции состоит в образовании водородных связей адсорбируемым веществом со свободными гидроксильными группами поверхности.
При сцинтилляционных измерениях на радиохроматограммах приходится принимать во внимание дополнительно ряд факторов. Это оптические свойства слоя сорбента, наличие подложки, ее прозрачность и отражающую способность /34/. При описании оптических свойств слоев хроматографических сорбентов обычно используют теорию Кубелки-Мунка /35,36/, хотя есть сообщения о том, что на тонкослойных хроматограммах возможны отклонения от выведенных ими закономерностей /37/. Сведения об оптической прозрачности слоев хроматографических сорбентов для света сцинтилляций в литературе отсутствуют.
Существенную роль при измерениях активности должна играть величина пористости сорбента. В первую очередь это относится к бумажным хроматограммам. В бумажном листе имеются истинные, или сквозные, поры, которые пронизывают всю толщу листа, односторонне замкнутые поры, проникающие в бумажный лист на разную глубину, а также поры, замкнутые в объеме бумаги /38/. Объем истинных пор составляет около 2% общего объема пористости /39/.
Диаметр основной массы пор не превышает 4 мкм /40/.
1.4. Особенности измерения активности на хроматографических сорбентах, обусловленные применением сцинтилляционного метода
Сцинтилляционный метод регистрации активности меченных тритием соединений на хроматограммах стали применять с конца 50-х годов /41/. Позже этот метод получил развитие в работах ряда авторов /42,43/, в том числе и советских /44,45/. Сравнение эффективности регистрации излучения трития сканирующими сцинтил-ляционными и ионизационными ечетчикаяи на хроматограммах показало, что эта величина для обоих методов практически одинакова /46/.
Во всех упомянутых работах измерения активности проводили непосредственно на хроматограммах после введения в них твердого или жидкого сцинтиллятора. Наряду с этим используется и метод, предложенный автором работ /47,48/. Сущность его в том, что сорбент с тонкослойных хроматограмм соскабливают небольшими зонами в отдельные сосуды с жидким сцинтиллятором и потом измеряют активность полученных взвесей. Для точного соскабливания позже был разработан автоматический прибор /49/.
При сцинтилляционных измерениях следует учитывать ряд специфических особенностей, присущих этому методу. К таким особенностям следует отнести возможность гашения сцинтилляций, как химического, так и цветового /50/. Химическое гашение может быть вызвано остатками растворителей в хроматограмме или веществами, которые элюируются с сорбента /51/. Цветовое гашение может наблюдаться при работе с окрашенными продуктами /52/.
Многих трудностей при измерениях удается избежать, если разделенные на хроматограмме соединения предварительно элгоировать в жидкий сцинтиллятор и измерять уже активность жидкой пробы. Однако и в этом случае остается ряд проблем, которые необходимо принимать во внимание /53/. Самыми существенными среди этих проблем являются полнота элюирования и зависимость эффективности регистрации меченых соединений от сорбции их, например на стенках сосуда с жидким сцинтиллятором /53,54/, Особенно важны эти проблемы при работе с полярными и высокомолекулярными соединениями /55,56/.
При наличии в сосуде с жидким сцинтиллятором порошка сорбента (измерения с предварительным соскабливанием зон с тонкослойных хроматограмм) вопросы зависимости результатов измерений от сорбционной способности веществ приобретают первостепенное значение. Изменение эффективности регистрации меченных углеродом-14 соединений в подобных условиях изучали авторы работы /57,58/.
1.5. Аппаратура для регистрации активности на радиохромато-граммах и методы обработки результатов измерений
Для регистрации активности меченых соединений на хроматограм-мах в разное время было предложено значительное количество методик. Так, довольно широко, особенно при работе с двумерными хроматограммами, использовали метод авторадиографии /59,60/. Количественные данные в этом случае могут быть получены при денситометрировании авторадиограмм. Для увеличения чувствительности метода, особенно при работе с тритием, было предложено предварительно пропитывать хроматограммы антраценом /61/, или добавлять его к сорбенту до хроматографирования /62/; пропитывать хроматограммы составами с 2,5-дифенилоксазолом /63-65/ или добавлять к сорбенту катодолюминофоры /66/. Снижение температуры также позволяет повысить чувствительность авторадиографи- ческого детектирования /67/. Более того, при температуре порядка -19бС некоторые растворители, например бензол, становятся весьма неплохими твердыми сцинтилляторами /68/.
Основным недостатком авторадиографического метода детектирования является необходимость проведения длительной экспозиции, которая зачастую составляет многие десятки часов.
Наибольшее распространение получили методики измерения активности на хроматограммах с применением сканирующих счетчиков. В подобных счетчиках чаще всего используют ионизационные или ецинтилляционные детекторы радиоактивности /69,70/, хотя есть примеры применения и других детекторов, например полупроводникового /71-73/.
История создания и совершенствования сканирующих счетчиков для радиохроматограмм подробно изложена в работе /6/. В настоящее время наиболее широкое распространение получили сканирующие приборы с газовыми проточными пропорциональными счетчиками в качестве детекторов. В частности, широко используются приборы фирм Ibzdkofy (ФРГ), РыкаЫ ЛstruMend* Се, и Лґи.сг<іг> Скіахао (США), Радная. ЄсрміртгусЬ &J. (Великобритания). Недавно На рыНКе ПОЯВИЛИСЬ ПОДОбНЫе Приборы фирм ЛҐь*УУ)Є.еА. (Франция) и JlPoka- (Япония). В то же время ецинтилляционные детекторы почти не применяются. В литературе имеется лишь несколько описаний приборов со сцинтилляционными детекторами /74-78/. Вероятнее всего, подобная ситуация сложилась в силу чисто случайных (коммерческих) причин, а не является отражением каких-либо особых преимуществ ионизационного способа измерений перед сцинтилляционным.
При отсутствии сканирующего счетчика измерения активности на сорбентах проводят, как правило, методом жидкостного сцинтилля- ционного счета. Для тонкослойных хроматограмм сорбент можно соскабливать небольшими зонами в жидкий сцинтиллятор /49,79,80/, либо закреплять слой специальными клеящими составами и снимать его целиком /81/. Гелевые сорбенты обычно разрезают на небольшие фрагменты, которые помещают затем в отдельные сосуды с жидким сцинтиллятором /82/. Бумажные хроматограммы тоже можно разрезать на небольшие фрагменты и измерить их активность тем же способом.
Для того, чтобы исключить влияние присутствия сорбента в сосудах со сцинтиллятором, предложены различные способы растворения сорбентов /83-85/. Ряд методик предложен для улучшения десорбции меченых веществ с сорбента в сцинтиллятор /86-89/, или учета возможности неполного перехода вещества в раствор /90/.
Обработка результатов измерения активности меченых соединений на хроматограммах заключается в том, чтобы соотнести активность, зарегистрированную в той или иной зоне хроматограммы, с определенным веществом и рассчитать относительное содержание компонентов в исследуемой смеси. Следует отметить, что, несмотря на широкое распространение этой методики при работах с мечеными соединениями, большая часть исследователей никак не учитывает возможность получения искаженных результатов с радио-хроматограмм. Сведения о методической погрешности радиохрома-тографического анализа соединений, меченных низкоэнергетическими излучателями, в литературе отсутствуют. В качестве погрешности определения важнейшей характеристики меченых соединений - радиохимической чистоты - в лучшем случае приводят погрешность определения числа импульсов в пике, соответствующем основному веществу /91/.
Методы автоматизированной обработки информации, полученной с радиохроматограмм, в целом не отличаются от общепринятых в газовой или жидкостной хроматографии /92,93/. Однако есть и ряд специфических моментов, которые необходимо учитывать при обсчете именно радиохроматограмм. В частности, это касается учета фона и его изменений на хроматограмме, вопросов обсчета пиков с "пьедесталами" и т.п. Правильный, на наш взгляд, подход к обработке информации с радиохроматограммы в общих чертах приводится в работе /91/. В работе /94/ описан конкретный алгоритм простой обработки с использованием настольного программируемого калькулятора.
Приборы для измерения активности на радиохроматограммах, выпускаемые зарубежными фирмами, как правило, имеют встроенные микропроцессоры с возможностью простейшей обработки получаемой информации (см., например, /95,96/). В последних моделях подобных приборов регистрация активности осуществляется без движения хроматограммы.
До настоящего времени отечественной промышленностью не производятся ионизационные или сцинтилляционные сканирующие приборы для радиохроматограмм.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2Л. Материалы
При проведении экспериментов использовали компоненты нуклеиновых кислот, углеводы и аминокислоты, меченные тритием или углеродом-14, изготовленные в лаборатории синтеза меченых биологически активных соединений Радиевого института им.В.Г.Хло-пина или поставляемые В/О "Изотоп". Формулы соединений приводятся в приложении I.
В таблицах 2.1 и 2.2 приведены основные характеристики использованных хроматографических сорбентов.
2.2, Методы исследования распределения меченого вещества и сцинтиллятора по толщине слоя сорбента
Для визуализации профиля распределения меченого вещества по толщине слоя хроматографического сорбента была разработана авторадиографическая методика. Для получения авторадиограмм лезвием бритвы срезали поперечный слой сорбента (бумага Ватман ЗММ) в области центра пятна (рис.2,1). Толщина среза около 0,1 мм. Срезы плотно прижимали к кусочкам рентгеновской пленки Inefu-strex, fi&n. CS4 ( kodbkj Англия). Экспозиция длилась 24 часа при комнатной температуре, активность в пятне, с которого делают срез, 0,8 - 1,2 МВк. Для получения увеличенного изображения использовали обычный фотоувеличитель и авторадиограмму в качестве негатива.
Для послойного секционирования хроматограмм использовали биологический микротом. Кусочек хроматограммы с пятном фиксировали парафином на деревянном основании размерами 25 * 15 * х10 мм. Слои толщиной порядка 0,03 мм срезали параллельно плоскости хроматограммы. Каждый снятый слой помещали в сосуд, содержащий 5,0 + 0,1 мл жидкого сцинтиллятора ЖС-8 и после перемешивания проводили измерение скорости счета полученных проб на жидкостном сцинтилляционном счетчике совпадений. Полученные результаты использовали для построения гистограмм распределения меченого вещества по толщине слоя сорбента.
Для выяснения особенностей распределения сцинтиллятора по толщине слоя сорбента использовали модель слоя, которая представляла собой стопку из 5 - 7 плотно сжатых в специальном приспособлении квадратиков хроматографической бумаги Ватман I
Полоска сорбента ' Отделенный срез
Рентгеновская пленка
Рис,2.1. Подготовка среза хроматографической бумаги к авто-радиографированш - зо - размером 5*5 см. Стопку пропитывали погружением в 10$ раствор 2,5-дифенилоксазола в бензоле или диоксане или в сцинтилляцион-ную жидкость ЖС-8. Последняя представляет собой раствор 5 г 2-(4-бифенилил)-5-фенилокеазола и 150 мл 1-метилнафталина в 850 мл диоксана /98/,
После высушивания в течение 30 минут в неподвижном воздухе при комнатной температуре стопку разделяли на отдельные листочки и радиометрически определяли содержание сцинтиллятора в каждом из них. Для этого по I с»г от каждого слоя помещали в сосуды с 2,0 - 0,02 мл бензола для растворения сцинтиллятора. Через 30 минут аликвоту полученного раствора (0,100 і 0,001 мл) переносили в измерительный сосуд, содержащий 5,0 - 0,1 мл бензола и измеряли скорость счета приготовленных таким образом проб при облучении их внешним источником излучения (цезий-137) в сцинтилляционном счетчике совпадений. Предварительными опытами было показано, что в таких условиях число импульсов, зарегистрированное за определенный промежуток времени, пропорционально количеству сцинтиллятора в растворе. Результаты 4-7 параллельных измерений усредняли и использовали для построения графиков распределения сцинтиллятора по толщине слоя сорбента.
Для выяснения возможного влияния пятен меченых соединений на равномерность пропитки сцинтиллятором по площади хромато-граммы был поставлен следующий эксперимент. Полоски сорбента (хроматографическая бумага, тонкослойные пластины) с нанесенными на них в виде пятен растворами немеченых соединений (аде-нин, уридин-5-дифосфат, аденозин-5-трифосфат) в количестве от I до 40 мкг в пятне диаметром не более 5 мм пропитывали вышеуказанными растворами сцинтилляторов и высушивали. Полученные - ЗІ - полоски сканировали под фотоумножителем при облучении внешним источником - цезием-137. При этом изменение количества сцинтил-лятора, приходящегося на единицу площади хроматограммы, вызывало бы соответствующее изменение регистрируемой скорости счета,
2,3. Измерение активности на хроматограммах и определение относительной эффективности регистрации
Измерение радиоактивности на хроматограммах проводили на специально изготовленных сцинтилляционных сканирующих счетчиках совпадений (см. прил.Z ). Параметры счетчика, на котором были получены основные экспериментальные данные: скорость сканирования 0,8 мм/с; чувствительность по тритию (активность на хроматограмме, вызывающая трехкратное превышение флуктуации фона) - 3 Бк/с мм^; эффективная ширина щели 2,7 мм; разрешающая способность (расстояние между краями пятен, при котором отношение скорости счета в провале к скорости счета на максимумах пиков составляет 0,5) - 1мм.
Перед измерениями в хроматограмму вводят сцинтиллятор. Для этого бумажные хроматограммы пропитывают погружением, а тонкослойные - опрыскиванием 10^-ным раствором 2,5-дифенилоксазола в бензоле или ецинтилляционной жидкостью ЖС-8. Для пропитки бумажные хроматограммы, поддерживаемые за кончики двумя пинцетами, погружают на 10 - 15 секунд в раствор сцинтиллятора. После этого хроматограммы подвешивают в вытяжном шкафу для испарения растворителя.
Тонкослойные хроматограммы опрыскивают в горизонтальном положении из пульверизатора до равномерного смачивания (слой сор-- бента становится глянцевым) и оставляют в таком положении до испарения растворителя (5 - 10 минут).
При использовании сцйнтилляционной жидкости ЖС-8 для измерений на бумажных хроматограммах, сцинтиллятор вводят тоже опрыскивая хроматограмму из пульверизатора до равномерного смачивания (глянец по всей длине хроматограммы).
При сканировании хроматограмм, обработанных жидкостью ЖС-8, необходимо предотвращать испарение ее компонентов в процессе сканирования. Для этого хроматограмму в счетчике покрывали полоской политетрафторэтиленовой (тефлоновой) пленки толщиной 0,1 мм.
В процессе сканирования информация выводится на самопишущий потенциометр КСП-4 и параллельно фиксируется пересчетным прибором ПСО-2-2* Через каждые 10 секунд зарегистрированное пересчетным прибором количество импульсов отпечатывается на ленте прибора БЗ-І5. В момент печати перо самописца делает отсечку так что впоследствии не сложно соотнести то или иное число импульсов на цифрограмме с записью распределения активности на ленте самописца.
Эффективность регистрации каждого соединения определяли относительно эффективности регистрации стандарта, в качестве которого был выбран меченный тритием аденин с молярной активностью 1500 ТБк/моль.
Для определения относительной эффективности известное количество меченого соединения (0,2 - 0,4 МБк) наносили в виде водного раствора на полоску сорбента так, чтобы пятна исследуемого вещества чередовались с пятнами вещества-стандарта. Объем наносимой пробы составлял 2-3 мкл для бумаги Ватман ЗШІ и 1-2 мкл для остальных сорбентов. Сушку после нанесения про- водили в неподвижном воздухе при комнатной температуре. В таких условиях распределение вещества по толщине бумажных хромато-грамм получается симметричным относительно плоскости, проходящей через центр бумажного листа и параллельной его поверхностям. Скорость счета с обеих сторон пятна практически одинакова. После обработки сцинтиллятором полосы сканировали в сцинтилля-ционном счетчике. Бумажные полоски сканировали с обеих сторон и числа импульсов, зарегистрированные для данного пятна, суммировали.
Для определения эффективности регистрации на стеклянной пластине растворы меченых соединений и аденина наносили на стеклянную пластинку в виде капель по 2 - 3 мкл. После высушивания в неподвижном воздухе пластинку укладывали стороной нанесения на полоску хроматографической бумаги, пропитанной раствором 2,5-дифенилоксазола, и сканировали в сцинтилляционном счетчике со стороны стекла.
Эффективность регистрации данного соединения определяли как отношение числа зарегистрированных импульсов (для бумажной хро-матограммы - суммы импульсов, зарегистрированных с обеих сторон) к величине нанесенной активности. Для вычисления значения относительной эффективности полученный результат делили на эффективность счета стандарта в тех же условиях; где N и Л - числа импульсов, зарегистрированные при сканировании для данного пятна и пятна стандарта, соответственно; А и Аа - величина активности в пятне вещества исследуемого и вещества-стандарта, соответственно.
Для каждого соединений проводили не менее десяти параллельных определений. Погрешность результатов не превышает 10% для полинуклеотидов и 6% для остальных соединений при доверительной вероятности 95%.
2.4. Определение степени десорбции с сорбента меченых сое динений раствором сцинтиллятора
Нанесенные на слой силикагеля и высушенные пятна веществ (I мкл раствора, 0,1 - 0,2 МБк) вырезали вместе с подложкой и помещали в сосуд, содержащий 1,0 — 0,01 мл сцинтиллятора ЖС-8. После перемешивания в течение I минуты на мешалке, вращающей сосуд попеременно в одну и другую стороны на 360 с периодом 0,5 с, 0,100 - 0,001 мл полученного раствора переносили в сосуд с 5,0 — 0,1 мл того же сцинтиллятора и измеряли скорость счета полученного раствора. В подобных условиях скорость счета пробы пропорциональна количеству вещества, смытого сцинтилля-тором с сорбента.
2.5. Определение ослабления света сцинтилляций слоями хро- матографических сорбентов и влияния отражающих свойств подлож ки на результаты измерений
С целью определения прозрачности слоев хроматографических сорбентов в условиях, наиболее близких к реальным условиям измерений, эксперименты проводили следующим образом. На полоску хроматографической бумаги наносили пятна растворов меченного тритием аденина, подсушивали и пропитывали погружением в 10% раствор 2,5-дифенилоксазола в бензоле. После испарения бензола полоску укладывали в счетчик, покрывали полоской целлофана и сканировали. Целлофан необходим для того, чтобы при последующих измерениях исключить контакт меченого вещества со ецинтил-лятором из прилегающего слоя сорбента. Сумму зарегистрированных при сканировании импульсов фиксировали.
Готовили новую полосу сорбента, пропитанного тем или иным сцинтиллятором по обычной методике. Эту полоску укладывали в счетчик поверх покрытой целлофаном полоски с пятнами и повторяли сканирование. Величина отношения чисел импульсов, зарегистрированных при втором и первом сканированиях, служила мерой прозрачности слоя сорбента. Полученные данные позволили рассчитать толщину слоя половинного ослабления света сцинтилляций.
Для определения роли отражения от подложки полоску сорбента с нанесенными пятнами вещества и пропитанную сцинтиллятором сканировали сначала положив под нее черную бумагу (отражение от подложки отсутствует), потом вторично на подкладке из алюминиевой фольги, которая используется в качестве основы для слоя сорбента на тонкослойных пластинах. Отношение суммы импульсов, зарегистрированных при втором сканировании, к сумме импульсов, зарегистрированных при отсутствии отражения от подложки, позволяло судить о влиянии отражения на результаты измерений.
2.6. Определение разрешающей способности хроматографичес-кого счетчика
Для определения реальной разрешающей способности сканирующего счетчика на полоску хроматографической бумаги наносили пятно раствора меченого вещества так, чтобы диаметр пятна сое- тавлял 10 - 15 мм. Пропитанную сцинтиллятором полоску сканировали в счетчике, причем сверху на пятно, перпендикулярно направлению сканирования, укладывали полоски светонепроницаемой бумаги разной ширины (рис.2.2 а). При сканировании таких пятен на диаграммной ленте записываются два пика, степень разрешения которых зависит от ширины полоски светонепроницаемой бумаги.
Установлено, что провал между регистрируемыми пиками составляет половину высоты пиков при ширине маскирующей полоски I мм.
Для выяснения способности введенного в сорбент сцинтиллятора выступать в качестве световода (что приводило бы к уширению регистрируемых пиков) проводили сканирование полос сорбента, на которых часть нанесенного пятна вещества была закрыта светонепроницаемой бумагой (рис.2.2 б). В этом случае при наличии свечения бумаги вне пределов пятна, наблюдалось бы различие в скорости изменения числа импульсов с разных сторон регистрируемого пика.
Подобных различий обнаружить не удалось.
2.7. Анализ компонентов нуклеиновых кислот методом тонкослойной хроматографии на силикагеле
До недавнего времени неорганические сорбенты и, в частности, силикагель, считались малоподходящими носителями для разделения компонентов нуклеиновых кислот /99,100/, т.к. достигаемое на них разделение оказывалось хуже, чем на слоях целлюлозы.
Несмотря на это, существует ряд работ, в которых представлены системы растворителей для разделения некоторых компонентов нуклеиновых кислот (НК) как на закрепленных, так и на не- Маска
Направление сканирования
Маска
Направление сканирования
Рис.2.2. Положение светонепроницаемых масок на полоске сорбента с пятном; а) при определении разрешающей способности счетчика; б) при определении световодности бумаги* закрепленных слоях силикагеля /101—103/. Во всех перечисленных и ряде других работ авторами не сообщалось о разделении моно-, ди- и трифосфатов нуклеозидов достаточно широкого ряда. Использование известных систем для разделения компонентов НК на широко доступных стандартных пластинах с силикагелем Силуфол не обеспечивает требуемого разделения (системы I - ІУ в табл.2.3).
В связи с необходимостью проведения быстрого определения радиохимической чистоты ряда соединений, которые использовались в исследованиях, нами была разработана система для тонкослойной хроматографии. Эта система - диоксан-вода-аммиак (6:4:1) -на пластинах Силуфол позволяет добиться хорошего разделения достаточно широкого набора нуклеозидов и нуклеозид-5-моно-, ди- и трифосфатов рибо- и дезоксирибо- рядов (система У в табл.2.3 и табл.2.4).
