Содержание к диссертации
Введение
1. Общая характеристика работы 8
2. Обзор литературы 10
2.1. Природа спилловер-водорода 10
Атомарная природа спилловер-водорода 11
Нз частицы 16
Ионные пары 16
Нойоны 18
2.2. Термическая активация трития. Тритиевая планиграфия 23
2.3. Активация трития ВЧ разрядом 37
2.4. Реакция высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена 41
2.5. Исследование региоселективности изотопного обмена водородных атомов твердого органического соединения 48
2.6. Исследование механизма твердофазных реакций с использованием квантово-химического моделирования 52
3. Экспериментальная часть 65
3.1. Материалы и приборы 65
3.2. Методы исследования 67
3.2.1. ВТКИО водорода на тритий 67
ВТКИО в пептидах 67
ВТКИО в белках 68
3.2.2. Очистка р-галактозидазы 68
Приготовление клеточных экстрактов 68
Фракционирование сульфатом аммония 69
Гель-фильтрация 69
Анион-обменная хроматография 69
3.2.3. Определение ферментативной активности В-галактозидазы и В-глюкозидазы 69
3.2.4. Определение концентрации белка 70
3.2.5. Подготовка белка к протеолизу 70
3.2.6. Гидролиз белка глутамилэндопептидазой из Bacillus intermedius 71
3.2.7. ВЭЖХ продуктов гидролиза В-галактозидазы. 71
3.2.8. Определение радиоактивности растворов 71
3.2.9. ЯМР-спектроскопия 72
3.2.10. Методика ab initio расчетов. 72
3.2.11. Определение доступности С-Н связей в а-конотоксине G1 73
4. Результаты и обсуждение 74
4.1. Исследование твердофазного изотопного обмена в пептидах 74
4.2. Исследование твердофазного изотопного обмена в белках 89 ВЫВОДЫ 98 Благодарности 99
Приложение а 100
Список литературы
- Атомарная природа спилловер-водорода
- Реакция высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена
- ВТКИО водорода на тритий
- Гидролиз белка глутамилэндопептидазой из Bacillus intermedius
Введение к работе
Изотопно-меченые белки, пептиды и аминокислоты являются необходимым инструментом для исследования многих биохимических процессов, лежащих в основе жизнедеятельности организмов. Меченные тритием соединения представляют особую ценность потому, что замена водорода тритием не приводит к заметному изменению биологических свойств, а водород присутствует практически во всех биологически активных соединениях. Реакции между твердым органическим веществом и активированным тритием интенсивно исследуются учеными многих стран. Для непосредственного введения трития используют, как правило, физические методы активации, такие как термическая активация на нагретой вольфрамовой спирали и микроволновая активация трития. При взаимодействии газообразного водорода с нанесенными катализаторами - металлами платиновой группы, происходит миграция водородных атомов, связанных с поверхностными атомами металла, на носитель. Этот эффект был назван спилловером водорода (СВ). Для синтеза меченных тритием соединений особенно эффективной является реакция высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО), основанная на взаимодействии органического соединения и СВ.
При ВТКИО в смеси, образованной твердым органическим соединением, нанесенным на неорганический носитель, и высокодисперсным металлом платиновой группы, под действием СВ с высокой скоростью происходит замещение водорода на тритий при сохранении конфигурации асимметрических углеродных атомов. Ранее в лаборатории изотопно-замещенных физиологически активных веществ на примере аминокислот были проведены экспериментальные и теоретические исследования механизма реакции ВТКИО. Исследован одноцентровый синхронный механизм замещения при насыщенном углеродном атоме, характеризующийся образованием в переходном состоянии пента-координированного углерода и трехцентровой связи с участием приходящего и уходящего водородных атомов. Исследование взаимодействия твердого органического соединения с СВ при ВТКИО представляет как теоретический, так и практический интерес. С помощью этого эффективного и универсального метода получены кратно меченные тритием физиологически активные соединения. В связи с этим представляется актуальным выяснение основных закономерностей твердофазной реакции пептидов и белков с участием спилловер-трития и исследование влияния пространственной организации полипептидов на реакционную способность их фрагментов при ВТКИО. Квантово-химические расчеты выполнены под руководством и при участии профессора д.х.н. Ю.А. Борисова (ИНЭОС РАН).
Атомарная природа спилловер-водорода
В гетерогенном катализе спилловером называют транспорт активных частиц, сорбированных или образованных на одной фазе, на другую фазу, которая в данных условиях не сорбирует или не образует эти частицы1. Термин "спилловер" (от английского spill over - перетекать) был введен Бударом и сотр . Фаза, генерирующая активные частицы, носит название инициатора (или активатора), а фаза, предоставляющая места для адсорбции активных частиц, - акцептора. Если эти фазы находятся в непосредственном контакте, то спилловер считается первичным, если же они разделены дополнительным инертным носителем - вторичным.
Первые непосредственные доказательства спилловера были получены, по-видимому, в работе Хубиара при восстановлении трёхокиси вольфрама до вольфрамовой бронзы при комнатной температуре . Известно, что WO3 восстанавливается водородом при температурах выше 200С с образованием оксида W4O11 синего цвета. Если же чистый Нг пропускать над механической смесью 0.5% Pt/АІгОз + WO3, то изменение цвета происходит уже при комнатной температуре. На механической смеси АЬОз + WO3 такого эффекта не наблюдается. Это объясняют тем, что водород диссоциирует на Pt и мигрирует через АЬОз на WO3 в виде атомов или ионов Н .
Явление спилловера широко распространено в катализе нанесенными металлами и смешанными оксидами. Эффект спилловера наблюдается не только с атомами водорода 3,4,5,6,79 но и кислорода 7,\ азота5 9, а также с частицами СОl0,n, NCO 5 12 и некоторыми другими 5 13. Большая часть опубликованных к настоящему времени статей на эту тему посвящена спилловеру водорода. Хотя спилловер, особенно водородный, непрерывно исследовался в последние четыре десятилетия, некоторые ключевые вопросы, такие как природа активированных частиц и характер их взаимодействия с подложкой, до сих пор остаются без ответа. Физическая природа водородных спилловерных частиц всесторонне обсуждалась уже в ранних публикациях по водородному спилловеру 1А14 15. Феномен спилловера водорода (СВ) заключается в том, что концентрация СВ слишком мала, чтобы обнаружить его прямое спектроскопическое присутствие современными инструментальными методами, в то время как его значение для гетерогенного катализа слишком велико, чтобы его переоценить. Поэтому обсуждение характера диффузии активированных водородных частиц и их природа, всё ещё продолжается 16,17. Только сравнительно недавно было начато теоретическое исследование взаимодействия органического вещества с СВ.
Атомарная природа спилловер-водорода
Надо отметить, что предметом дальнейшего рассмотрения будут частицы активированного водорода и дейтерия (Н и В соответственно), которые образуются при первичном сшшловере (с металла на подложку). В попытках прямого обнаружения спилловерных частиц использовались различные спектроскопические методы (ЯМР, ЭПР, ИК) с надеждой, что это также позволит ответить на вопрос о физической природе Н частиц5А16 18.
Присутствие Н атомов было обнаружено Лендом и др.19 при исследовании СВ на двухкомпонентном катализаторе Р АЬОз-вЮг посредством ЯМР спектроскопии. Дальнейшие ЯМР исследования по адсорбции водорода на металлических кластерах показали, что в дополнение к количеству водорода, обнаруживаемому ЯМР на металле, на поверхности подложки должны присутствовать и другие водородные частицы, которые невозможно непосредственно наблюдать ЯМР спектроскопией 2 1,223. Дополнительное доказательство СВ можно было бы получить, сравнивая количество водородных частиц, наблюдаемых ЯМР спектроскопией, с количеством, определенным гравиметрическими и объемными адсорбционными измерениями -25,26 7. ЯМР спектроскопией Рут и др. 28 косвенно показали, что на подложке Rh/SiCh катализатора сформировано спектроскопически ненаблюдаемое количество водорода. Продольное время релаксации Ті в ЯМР гидроксильных протонов может существенно сокращаться в присутствии парамагнитных частиц. Так как этот эффект наблюдался для СВ20 25 27, было сделано заключение, что спилловерные частицы являются парамагнитными Н атомами.
Однако попытки исследовать ЭПР спектроскопией непосредственно парамагнитные атомы водорода, которые, как предполагается, соответствуют спилловерным частицам, до сих пор не были успешны. Н атомы не были обнаружены даже в тех каталитических системах, где СВ очевидно происходит -29,30. Но, с другой стороны, реакции спилловерных частиц с органическими радикалами неоднократно наблюдались с помощью ЭПР и ИК спектроскопии "«з9-30»31»32. Хак, Ваяние и Нейкам 15,29 посредством ЭПР спектроскопии исследовали реакцию СВ, образованного на Pt или Pd-Y цеолите с двумя органическими радикалами (антрацен и ион перилена). Исчезновение радикалов коррелирует с реакцией частиц, которые авторы называют Н радикалами (т.е. Н атомами). Метод ЭПР также использовался Карлейем и др.30 с целью обнаружения диссоциации водорода на катализаторе Pd/АЬОз при комнатной температуре. Атомарный водород реагировал со спин-ловушкой (N-трет-бутил-а-фенилнитроном, PBN), образуя парамагнитные частицы до уровня, обнаружимого ЭПР спектроскопией. Однако, никакого прямого ЭПР спектроскопического доказательства Н атомов не было получено
Реакция высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена
Каталитический гидрогенолиз газообразным тритием широко используется для синтеза меченных тритием органических соединений. Он может быть осуществлен в твердой фазе в отсутствии растворителя. Впервые твердофазный гидрогенолиз был использован для синтеза меченных тритием нуклеиновых оснований реакцией каталитического дегалогенирования 159. Реакции в отсутствии растворителя могут происходить или на каталитических центрах металла или на кислотных центрах поверхности неорганического носителя. Отсутствие растворителя при проведении реакции еще не является основанием для отнесения этих реакций к происходящим при участии СВ. При этом даже в одной каталитической системе возможно изменение каталитического центра от металлического к кислотному. Исследовалась реакция изомеризации и пиролиза н-гептана на 0,2% Pt, нанесенного на сульфатированную окись циркония (Pt/SZ) в интервале низкого давления 190-760 торр и высокого давления 760-3000 торр при температуре 150-250 С 60. Порядок реакции по водороду отрицательный для низкого давления и положительный для высокого. С ростом температуры порядок реакции в обоих случаях стремиться к нулю. При изменении условий реакции меняется природа каталитического центра. При высокой температуре и высоком давлении углеводород активируется на кислотных центрах, в то время как при низкой температуре и низком давлении реакция происходит на центрах, образованных присоединением водорода к металлу, вида [Н-(Ме)т(Н+)х]х+. На кислотных центрах энергия активации примерно в 2 раза ниже, чем на металле (15 ккал/моль и 30 ккал/моль).
Современные исследования показали, что во многих случаях реакции гидрогенолиза твердых органических соединений происходят на поверхности металла, а не под действием СВ.
В работе161 исследовалось гидрирование твердых алкенов и алкинов на нанесенных Pd катализаторах в отсутствии растворителя. Опубликованы обзоры, посвященные этим реакциям 162,ш. Исследовали гидрирование дифенилацетилена, цис- и транс-стильбена а также а,р-ненасыщенных кислот. Использовали Pd/SiCh и Pd/C при 20С, 48 час. Наблюдается гидрирование более гладкое, чем в ТГФ. Обнаружена зависимость скорости реакции от температуры плавления субстрата и продукта. Сделан вывод о том, что реакция происходит в расплаве, и чем легче он образуется, тем быстрее идет реакция. Гидрирование дифенилацетилена на Pd/C происходит значительно быстрее, чем на Pd/SiOfc при этом реакция идет через образование цис-стильбена, что свидетельствует в пользу реакции в расплаве на поверхности металла. Данные были подтверждены микрофотографией продуктов реакции. Китамура и др.164 также показали, что реакции без растворителя происходят в расплаве реакционной зоны. В качестве примера реакции твердофазного гидрирования предлагается рассмотреть реакцию без растворителя между аллилбензолом и газообразным тритием в присутствии катализатора Pd/BaSCU 165. Реакцию проводят при комнатной температуре и наблюдают образование пропилбензола с высоким выходом и включение изотопа по всем С атомам в пропильном радикале. Метка включается преимущественно при С1. Реакция не может быть рассмотрена в качестве твердофазной, так как аллилбензол является жидкостью при выбранной температуре. Также отсутствуют доказательства того, что реакция происходит с участием СВ. Нам представляется наиболее вероятным то, что эта реакция происходит на центрах металла. В пользу этого свидетельствует также большое включение трития в аллильное положение по отношению к двойной связи.
Для синтеза меченных изотопами водорода биологически активных соединений, % особенно эффективной оказалась реакция, основанная на применении высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО)1б6,167. Интенсивный изотопный обмен между атомами водорода твердого органического соединения и газофазным изотопным водородом наблюдается в системе высокодисперсного металла группы платины, твердого органического соединения (или его комплекса с металлом платиновой группы) и носителя (графит, АЬОз, ВаБСч, СаСОз). Исходными органическими соединениями могут быть амины, аминокислоты, углеводы, пептиды, нуклеозиды, карбоновые кислоты и др. 168 Реакция проводится, как правило, при температуре от 373 до 523К и давлении 5-50кПа в течение 0.1-2.0 часов. При этом изотопный обмен происходит с высокой степенью сохранения конфигурации асимметрических атомов углерода, что делает возможным получение меченных тритием аминокислот и других биологически активных соединений с высокой степенью замещения водорода на тритий без рацемизации 1б9. При реакции ВТКИО в молекулах алифатических аминокислот в первую очередь обмениваются на тритий атомы водорода метальных групп. Водородные атомы, связанные со вторичными и третичными атомами углерода, в меньшей степени подвержены обмену. Хорошо известно, что третичные водородные атомы реагируют с радикалами значительно легче, чем первичные. Поэтому гипотеза об атомарной природе СВ не объясняет наблюдаемого характера региоселективности реакции ВТКИО. Более приемлемой представляется гипотеза о протонном характере СВ. Спилловер водорода сопровождается возникновением одновременно электронной и ионной проводимости на поверхности раздела дисперсная металлическая фаза-носитель90. Это говорит о том, что водород, по-видимому, мигрирует в виде протона в паре с электроном. В пользу того, что СВ реагирует как заряженная протон-содержащая частица свидетельствуют также результаты квантово-химических расчетов, о чем подробно будет сказано в дальнейшем.
С помощью реакции ВТКИО можно ввести изотопную метку непосредственно в молекулу синтетического или природного пептида. Реакцию можно проводить с минимальными количествами исходных веществ. Метка включается преимущественно в аминокислотный остаток на N-конце пептида169 170. Метод позволяет получить продукт с высокой специфической радиоактивностью, полностью сохраняющий биологическую активность.
ВТКИО водорода на тритий
Концентрацию белков измеряли модифицированным для микро количеств методом Лоури-Фолина (плашечный вариант)187. Раствор А. 2%-ный Na2C03 в 0,1 М NaOH. Раствор Б. 0,5%-ный CuS04»5H20 в 1%-ном тартрате натрия. Раствор В. Смешивали 5 мл раствора А с 0,1 мл раствора Б. Ежедневно готовили заново. Раствор Г. Коммерческий реагент Фолина (Fluka), 5-кратно разбавленный водой. Использовали образец, содержащий 1-10 мкг белка в 20 мкл. Добавляли 100 мкл раствора В и, после выдерживания в течение 10 мин при комнатной температуре, добавляли 10 мкл раствора Г. Выдерживали 30 мин, а затем определяли поглощение при 490 нм.
Концентрацию белка определяли по градуировочному графику, построенному с помощью бычьего сывороточного альбумина (Sigma).
Подготовка белка к протеолизу Раствор 1 мг белка в 200 мкл 0.1 М калий фосфатного буфера, рН 8.5, 6 М гуанидин гидрохлорид (Merck) помещали в пробирку (Eppendorf 1.5 мл), добавляли 10 мкл 2-меркаптоэтанола (Sigma) и продували пробирку азотом. После инкубации в течение ночи при 37 С прибавляли 15 мкл 4-винилпиридина. После инкубации в течение 15 мин при комнатной температуре не прореагировавший 4-винилпиридин нейтрализовали 10 мкл 2-меркаптоэтанола Пиридилэтилированный белок диализовали против 25 мМ калий фосфатного буфера рН 8.0.
Гидролиз белка глутамилэндопептидазой из Bacillus intermedins
К 500 мкл 25 мМ калий фосфатного буфера рН 8.0, содержащего 0.5 мг пиридилэтилированного белка, прибавляли 10 мкл 0.2 мг/мл раствора глутамилэндопептидазы в 20 мМ Трис-гидрохлоридном буфере рН 8.4, 0.1 М NaCl. После инкубации в течение 4 часов при 37 С раствор замораживали и лиофилизовали.
ВЭЖХ продуктов гидролиза (З-галактозидазы
Полученную после гидролиза белка смесь пептидов фракционировали на колонке Phenomenex Primesphere С18 (250x3.2 мм, 5 микрон) в градиенте концентрации ацетонитрила (2% - 40% за 80 мин) в присутствии 0.1% трифторуксусной кислоты при скорости потока 0.3 мл/мин. Полученные фракции подвергались рехроматографии на той же колонке в градиенте концентрации метанола (2% - 80% за 80 мин) в присутствии 0.1% трифторуксусной кислоты при скорости потока 0.3 мл/мин.
Определение радиоактивности растворов
Определение радиоактивности растворов проводили на сцинтилляционном счетчике РЖС-20 методом внешнего стандарта. Измеряемый раствор содержал 4-5 мл жидкостного сцинтиллятора RIASOLVE (Koch-Light Laboratories Ltd , Англия) и аликвоту определяемого раствора, объем которой не превышал 0,5 мл. Расчет значения радиоактивности проводили по формуле: (l-I,) X V где I - скорость счета пробы в имп/с, If - скорость счета сцинтиллятора без определяемого раствора (фон) в имп/с, X - разведение раствора, V - объем определяемого раствора в мл, Аст - скорость счета стандартного образца в пересчете на 1 мКи, v - объем аликвоты определяемого раствора в мкл, а - значение радиоактивности определяемого раствора в мКи.
Распределение трития в пептидах определяли с помощью 3Н-ЯМР. [3Н]пептид (5-10 мКи) растворяли в 600 мкл D2O (100% дейтерий, SIL, Великобритания UK) при рН 7.5. Н- и 3Н-ЯМР спектры снимали при температуре 30С на спектрометре Varian UNITY-600 (США) на рабочих частотах 600 и 640 МГц для протия и трития соответственно. Перед началом импульсной последовательности вводилась задержка длительностью 3 с для релаксации ядер к начальному равновесному состоянию. Обработка и анализ спектров проводились интерактивно в программе VNMR фирмы Varian (США). Отнесение сигналов в спектре 3Н-ЯМР [3Н]пептида взято из спектра -ЯМР, полученного в тех же условиях.
Методика ab initio расчетов. Для расчета изолированных молекулярных систем, фрагментов потенциальных поверхностей и переходных состояний реакции обмена водорода использовали метод Хартри-Фока (RHF) ш в базисе 6-31G , а также метод теории возмущения Меллера-Плессета второго порядка (МР2) с использованием базиса 6-31G . Геометрию рассмотренных систем оптимизировали с помощью аналитических градиентов без учета точечной группы симметрии. Для поиска переходных состояний применили квази-ньютоновский метод синхронного транзита189. Расчеты выполнены с использованием программ GAUSSIAN-94 l90 191, GAUSSIAN-98 т и GAMESS ш на суперкомпьютере CRAY J-90 (Национальный Энергетический Исследовательский Суперкомпьютерный Центр, Беркли, Калифорния,США).
Определение доступности С-Н связей в ос-конотоксине G1 Доступность С-Н связей а-конотоксина G1 для взаимодействия с НзО+-кислотными центрами катализатора оценивали по величине пространственной доступности соответствующих атомов водорода для молекул НгО, определенной с помощью программы MOLMOL194 для пространственной структуры пептида в кристалле (PDB код lnot) 195 и для набора из 20 структур пептида в водном растворе
Гидролиз белка глутамилэндопептидазой из Bacillus intermedius
Для изучения влияния пространственного положения пептидного фрагмента в белковой глобуле (З-галактозидазы на его реакционную способность в реакции ВТКИО провели сравнительное исследование включения трития в пептидный гидролизат белка и в нативный белок в одинаковых условиях. Таким образом, были получены две серии пептидов, для разделения которых была использована обращенно-фазовая ВЭЖХ (Рисунок 22). Для получения индивидуальных пептидных фрагментов пептидные
Колонка: Phenomenex Primesphere СІ8 (250x3.2 мм, 5 ц) Градиент: 2% - 40% ацетонитрила за 80мин, в присутствии 0.1% ТФУК, 0.3 мл/мин. фракции, собранные в градиенте метанола, подвергали рехроматографии с использованием градиента ацетонитрила и УФ-детектированием на двух длинах волн. Полученные фракции анализировали с применением MALDI масс-спектрометрии. Отнесение хроматографических пиков делали по времени удерживания, массе пептида и отношению экстинкций на двух длинах волн (210 и 280 нм). Затем проводили определение относительной радиоактивности одинаковых пептидов из двух разных серий. Для оценки влияния пространственного строения белка на реакционную способность использовали величину нормированной реакционной способности. Данные по пространственному строению исследуемой р-галактозидазы из Thermoanaerobacter ethanolicus получены с использованием метода множественного выравнивания аминокислотных последовательностей близких по строению белков. Рентгеноструктурным анализом ее структура пока не решена, но есть пространственная структура Р-галактозидазы из Escherichia coli. Поэтому для локализации участков исследуемой р-галактозидазы, находящихся внутри мономера и принимающих участие в образовании димера, было выполнено множественное выравнивание аминокислотных последовательностей трех Р-галактозидаз: исследуемой Р-галактозидазы из Thermoanaerobacter ethanolicus, р-галактозидазы из Escherichia coli с известной пространственной структурой, а также Р-галактозидазы из Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes EMI. (см. Приложение А). Методика определения пространственной структуры исследуемого белка была разработана в Секторе структуры белка Отдела биоинформатики ИМГ РАН Н.Н. Втюриным. Последовательность третьей р-галактозидазы была взята для увеличения достоверности множественного выравнивания. Гомология (процент идентичности после парного выравнивания) между исследуемой р-галактозидазой и р-галактозидазой из Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes EMI составляет 42%, что даёт достаточное основание считать, что пространственные структуры этих двух Р-галактозидаз имеют одинаковую архитектуру и принадлежат одному семейству пространственных структур (под термином «архитектура» подразумевается число и взаимное расположение элементов вторичной структуры в пространстве). Присутствие Р-галактозидазы из Thermoanaerobacterium I thermosulfurigenes EMI не ухудшает результаты множественного выравнивания, а помогает более достоверно локализовать внутренние участки и участки, образующие контакты в димере исследуемой Р-галактозидазы, на основе аналогичных участков в Р-галактозидазе из Escherichia coli с известной пространственной структурой.
Таблица 20. Результат анализа пептидных фрагментов Р-галактозидазы. В первой колонке под первичной структурой пептидов приведены особенности расположения аминокислотных остатков в пространственной структуре белка: а - а-спираль, Р -Р-слой,! - область контакта субъединиц. Доступная поверхность пептидов для молекул воды рассчитана с помощью программы MOLMOL. № Пептид Массапептида,Да Положение впервичнойструктуребелка Нормированнаяреакционнаяспособность вВТКИО Доступная поверхность в субъединице,%
Локализацию внутренних и наружных участков в Р-галактозидазе из Escherichia coli проводили с использованием стереоскопического визуализатора пространственных структур белковых молекул, разработанного в Секторе структуры белка Отдела биоинформатики ИМГ РАН, а также программы MOLMOL. Результаты анализа приведены в Таблице 20.
Из Таблицы 20 можно видеть, что участок 215-220 р-галактозидазы, находящийся на поверхности белковой глобулы и не участвующий в образовании вторичной
Расположение фрагментов р-галактозидазы из Tkermoanaerobacter ethanolicus (см. Таблицу 20) на белковой глобуле В-галактозидазы из Escherichia colL структуры, имеет наибольшую относительную реакционную способность, тогда как внутренний участок 338-347 в белковой глобуле имеет в 3.5 раза меньшую реакционную способность (Рисунок 23). Из приведенных данных для фрагментов 392-398 и 501-509 В-галактозидазы следует, что участие пептидных фрагментов в образовании а-спиралей и р-слоев приводит к снижению реакционной способности по отношению к СВ. Эта закономерность наблюдалась и для а-спирали зервамицина ПВ. Также заметным различием в реакционной способности обладает фрагмент 417-422, расположенный в области контакта субъединиц. Его реакционная способность снизилась более чем в 150 раз. Таким образом, образование межмолекулярного контакта резко снижает возможность протекания реакции изотопного обмена с участием СВ.
На основании полученных данных был сделан вывод о том, что на способность участвовать во взаимодействиях со спилловер-тритием влияет как химическая природа пептидного фрагмента, так и его положение в белковой глобуле. Изотопная метка включается преимущественно в пептидные фрагменты, расположенные на поверхности белковой глобулы.
![Синтез производных пиразино[1,2-a]пиразинов - потенциальных миметиков b-поворота в белках](/i/i/4400/147380.png "Синтез производных пиразино[1,2-a]пиразинов - потенциальных миметиков b-поворота в белках Лукина Татьяна Викторовна")
