Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Роль клеток-эффекторов в патогенезе ХОБЛ 15
1.2. Роль оксидант/антиоксидантной системы в патогенезе ХОБЛ 19
1.3. Роль миелопероксидазы и катионного протеина в патогенезе ХОБЛ 23
1.4. Роль протеиназ/антипротеиназной системы в патогенезе ХОБЛ 26
1.4.1. Эластаза, функции, значение в норме и при патологии 27
1.4.2. Трипсиноподобные протеиназы 29
1.4.3. Калликреин-кининовая система, роль в норме и при патологии 31
1.4.4. Ингибиторы протеиназ 35
1.5. Биомаркеры воспаления при прогрессировании ХОБЛ 38
1.6. Курение табака и биомаркеры воспаления в бронхиальном регионе 39
Глава 2. Материалы и методы исследования 43
2.1. Характеристика обследованных групп 43
2.2. Методы исследования 46
2.2.1. Определение содержания оксидант/антиоксидантной системы 48
2.2.2. Определение активности калликреина и калликреиногена 50
2.2.3. Определение активности протеиназ/ингибиторной системы 51
2.2.4. Определение катионного протеина в нейтрофилах 54
2.2.5. Определение содержания миелопероксидазы в нейтрофилах 55
2.2.6. ТЕСТ «КОЖНОГО ОКНА» 55
2.2.7. Тест с 6-минутной ходьбой 56
2.2.8.Определение содержания внутриклеточных катионных протеинов в нейтрофилах индуцированной мокроты и крови методом компьютерной морфометрии 57
2.2.9. Определение содержания миелопероксидазы в нейтрофилах мокро ты и крови методом компьютерной морфометрии 58
2.2.10. Определение содержания миелопероксидазы в нейтрофилах «кожного окна» 59
2.2.11. Исследование функции внешнего дыхания 60
2.3. Методы математической обработки полученных результатов 62
Глава 3. Результаты исследований 63
3.1. Сравнительная оценка цито-биохимических маркеров воспаления у здо ровых некурящих, «злостных курильщиков» и при обострении ХОБЛ 63
3.1.1. Активность кининогенеза в индуцированной мокроте у здоровых некурящих, «злостных курильщиков» и при обострении ХОБЛ 63
3.1.2. Сравнение показателей оксидант/антиоксидантной системы в индуцированной мокроте у здоровых некурящих, «злостных курильщиков» и при обострении ХОБЛ 65
3.1.3. Активность протеиназ и их ингибиторов в индуцированной мокроте у здоровых некурящих, «злостных курильщиков» и при обострении ХОБЛ 67
3.1.4. Содержание катионного протеина в нейтрофилах индуцированной мокроты и крови у здоровых некурящих, «злостных курильщиков» и при обострении ХОБЛ 73
3.1.5. Содержание миелопероксидазы в нейтрофилах индуцированной мокроты, крови, «кожного окна» у здоровых некурящих, «злостных курильщиков» и при обострении ХОБЛ 77
3.1.6. Клеточный состав «кожного окна» у здоровых некурящих, «злостных курильщиков» и при обострении ХОБЛ 82
3.1.7. Цитологическое исследование индуцированной мокроты у здоровых некурящих, «злостных курильщиков» и при обострении ХОБЛ 83
3.2. Активность биомаркеров воспаления при ХОБЛ после купирования обострения в сравнении с группой «злостных курильщиков» 85
3.2.1. Динамика основных клинических показателей за период лечения обострений ХОБЛ 85
3.2.2. Активность протеиназ и их ингибиторов в индуцированной мокроте у больных ХОБЛ после лечения в сравнении с группой «злостных курильщиков» 86
3.2.3. Состояние перекисного окисления липидов в индуцированной мокроте у больных ХОБЛ после лечения в сравнении с группой «злостных курильщиков» 91
3.2.4. Содержание катионного протеина в нейтрофилах индуцированной мокроты и крови у больных ХОБЛ после купирования обострения в сравнении с группой «злостных курильщиков» 93
3.2.5. Содержание миелопероксидазы в нейтрофилах крови, мокроты, «кожного окна» у больных ХОБЛ после купирования обострения в сравнении с группой «злостных курильщиков» 95
3.2.6. Активность кининогенеза в индуцированной мокроте у больных ХОБЛ после купирования обострения в сравнении с группой «злостных курильщиков» 98
3.2.7. Цитологическое исследование индуцированной мокроты у больных ХОБЛ после курса терапии в сравнении с группой «злостных курильщи ков» 100
3.3. Влияние ирритативного фактора на эффективность лечения обострений ХОБЛ и динамику биомаркеров воспаления 102
3.3.1. Содержание катионного протеина в нейтрофилах индуцированной мокроты и крови у больных ХОБЛ в зависимости от ирритативного фактора 104
3.3.2. Содержание миелопероксидазы в нейтрофилах индуцированной мокроты, крови, «кожного окна» у больных ХОБЛ в зависимости от ирритативного фактора 106
3.3.3. Активность протеиназ и их ингибиторов в индуцированной мокроте больных ХОБЛ в зависимости от ирритативного фактора 110
3.3.4. Показатели оксидант/антиоксидантной системы в индуцированной мокроте больных ХОБЛ в зависимости от ирритативного фактора 114
3.3.5. Цитологическое исследование индуцированной мокроты больных ХОБЛ в зависимости от ирритативного фактора 116
3.3.6. Активность кининогенеза в индуцированной мокроте больных ХОБЛ в зависимости от ирритативного фактора 119
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 121
Выводы 138
Практические рекомендации 140
Список литературы 141
- Роль оксидант/антиоксидантной системы в патогенезе ХОБЛ
- Определение содержания оксидант/антиоксидантной системы
- Содержание миелопероксидазы в нейтрофилах индуцированной мокроты, крови, «кожного окна» у здоровых некурящих, «злостных курильщиков» и при обострении ХОБЛ
- Содержание миелопероксидазы в нейтрофилах крови, мокроты, «кожного окна» у больных ХОБЛ после купирования обострения в сравнении с группой «злостных курильщиков»
Введение к работе
Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) — одна из важнейших проблем современного здравоохранения в связи с постоянно возрастающей распространенностью и смертностью от этого заболевания [20, 21, 71, 72, 94, 95, 96]. В настоящее время во всем мире отмечается тенденция к увеличению заболеваемости ХОБЛ: только за период с 1990 года по 1997 год этот показатель увеличился на 25% у мужчин и на 69% у женщин [21, 53, 54, 67]. В тоже время, в период с 1966 до 1995 г. летальность от ишемической болезни сердца и инсульта снизились на 45% и 58% [2]. Согласно прогнозам ВОЗ, ХОБЛ станет третьей в структуре общей смертности и пятой в структуре заболеваемости в мире к 2020 году [71, 94, 147]. В России уже сегодня по официальным данным МЗ РФ, ХОБЛ занимает 4-5 место среди всех причин смертности (после сердечно-сосудистых заболеваний, диабета, травм) [51, 67]. Наиболее важными причинами этого является ежегодное увеличение числа курящих людей, практически неограниченная реклама табачных изделий и отсутствие реальных профилактических мероприятий на государственном уровне [52, 54]. В 2000 г. от ХОБЛ в мире умерло 2 млн 740 тыс. человек. Эпидемиологические данные о заболеваемости и смертности часто не дают полного представления о значении и распространенности ХОБЛ, поскольку обычно болезнь не диагностируется до развития клинически выраженных и относительно тяжелых стадий заболевания. К большому сожалению, больные ХОБЛ обращаются за медицинской помощью уже на поздних стадиях заболевания, когда возможности терапии крайне ограничены. Так, Европейское Респираторное Общество информирует, что только 25% случаев заболевания диагностируется своевременно. По официальным данным в России около 1 миллиона больных ХОБЛ, в то время как по данным эпидемиологических исследований число таких больных в нашей стране может превышать 11 миллионов человек. В США заболеваемость ХОБЛ приближается к 15 млн. человек [53, 67, 68, 71]. ХОБЛ - заболевание с полигенным харак-
8 тером наследования, относится к группе экологически зависимых болезней органов дыхания [30]. Диагноз ХОБЛ следует предполагать у всех кашляющих пациентов при наличии факторов риска, способствующих развитию ХОБЛ. К этим факторам относятся: курение, как активное, так и пассивное; длительное воздействие профессиональных раздражителей (пыль, химические поллютанты, пары кислот и щелочей); атмосферное и домашнее загрязнение воздуха; наследственное предрасположение. Определенную роль играют частые респираторные инфекции, особенно в детском возрасте, проживание пациента в холодной климатической зоне, малый вес при рождении. Ведущим этиологическим фактором развития ХОБЛ является курение.
Известно, что заболевание развивается примерно у 15-20% курильщиков. Подтверждена роль только одного эндогенного фактора - дефицита альфа-1-антитрипсина, что отмечается не более чем у 1% всех больных ХОБЛ. Возникает вопрос - почему не все курящие заболевают? На сегодняшний день полностью не изучены механизмы, которые предупреждают развитие ХОБЛ у длительно курящих субъектов - «злостных курильщиков». К настоящему времени не сформировалось представление о протективных механизмах, предотвращающих развитие ХОБЛ.
Известно, что курение является не только важнейшим фактором риска развития ХОБЛ, но и способствует более тяжелому течению заболеванию. Многие компоненты табачного дыма оказывают непосредственное повреждающее действие на бронхолегочную ткань, инициируют воспалительный процесс с активацией нейтрофилов и макрофагов, влияют на баланс протео-литических ферментов и антипротеаз, приводят к развитию оксидативного стресса, иммунодефицитного состояния [23, 71, 129]. Выявление факторов, поддерживающих толерантность к развитию ХОБЛ, позволит дать теоретическую основу для разработки не только средств профилактики, но и лечения этого заболевания.
9 Единственная доказанная стратегия, замедляющая прогрессирование болезни, - отказ от курения [20, 21, 90, 117]. Вместе с тем, недостаточно информации о влиянии прекращения курения на клиническую картину болезни, на факторы воспаления при обострении ХОБЛ и динамику этих показателей на фоне лечения.
Цель исследования: выявление факторов толерантности «злостных курильщиков» к развитию ХОБЛ; изучение влияния курения на клиническое течение, биомаркеры воспаления и морфофункциональные свойства нейтро-филов при обострении ХОБЛ. Задачи исследования
1. Дать сравнительную оценку значений биомаркеров воспаления и показателей морфофункциональных свойств нейтрофилов в различных регионах — бронхиальном, крови, очаге асептического воспаления у «злостных курильщиков» в сопоставлении со здоровыми некурящими.
Исследовать биомаркеры воспаления и показатели морфофункциональных свойств нейтрофилов при обострении ХОБЛ и переходе в стабильное течение на различных стадиях прогрессирования болезни.
Сопоставить значения биомаркеров воспаления и показателей морфофункциональных свойств нейтрофилов у группы «злостных курильщиков» с аналогичными показателями при ХОБЛ.
Исследовать в сравнительном аспекте клиническое течение обострений ХОБЛ у некурящих, бывших курильщиков и продолжающих курить.
Сравнить цито-биохимические характеристики воспаления при обострении ХОБЛ у некурящих, бывших курильщиков и продолжающих курить.
Научная новизна работы
Впервые показано, что у «злостных курильщиков» без клинических и спирометрических признаков ХОБЛ в бронхиальном регионе формируется нейтрофильное воспаление с высокой активностью в индуцированной мок-
10 роте протеолитических ферментов — эластазы, трипсиноподобных протеаз и их ингибиторов - аі-протеиназного ингибитора, (Хг-макроглобулина, кисло-тостабильных ингибиторов, с повышенной концентрацией малонового ди-альдегида.
Впервые выявлено, что длительное курение модифицирует морфо-функциональные свойства нейтрофилов бронхиального региона, заключающиеся в большей концентрации в цитоплазме миелопероксидазы и катион-ных протеинов.
Впервые показано, что при длительном курении изменяются хемотак-сические характеристики нейтрофильного и макрофагального пулов: в отпечатке «кожного окна» по сравнению с никогда некурящими через 4 часа после скарификации визуализируется большее количество нейтрофилов, а через 20 часов не происходит трансформации нейтрофильной фазы воспаления в макрофагальную.
Впервые обнаружено, что у «злостных курильщиков» изменение мор-фофункциональных свойств нейтрофилов носит системный характер — ней-трофилы в очаге воспаления, как в бронхиальном регионе, так и при асептическом воспалении — в «кожном окне», содержат большее количество миелопероксидазы, по сравнению с группой здоровых некурящих.
Впервые показано, что у «злостных курильщиков» толерантность к развитию ХОБЛ может поддерживаться особенностями воспаления в бронхиальном регионе, отличающимися от ХОБЛ: более высокой активностью протеолитических ингибиторов — аі-протеиназного ингибитора и сс2-макроглобулина, меньшей активностью протеиназ — эластазы и трипсиноподобных протеиназ, более низкими значениями активности калликреин-кининовой системы (калликреиногена, калликреина), меньшим содержанием малонового диальдегида и более высокой активностью каталазы, большим количеством миелопероксидазы и катионного протеина в цитоплазме нейтрофилов индуцированной мокроты.
Впервые установлено, что при обострении ХОБЛ III-IV стадии у курящих, бывших курящих, никогда некурящих фактор курения не оказывает влияния на такие показатели как клинический индекс, ОФВі, дистанцию, проходимую пациентом в тесте с 6-минутной ходьбой, и их динамику после купирования обострения.
Впервые показано, что отказ от курения в течение 5-6 лет пациентов с ХОБЛ III-IV стадии, бывших злостных курильщиков, не влияет на количественные показатели биомаркеров воспаления в бронхиальном регионе и мор-фо-функциональные свойства нейтрофилов, значения которых остаются на уровне больных ХОБЛ III-IV стадии, злостных курильщиков, продолжающих курение.
Впервые установлено, что при ХОБЛ III-IV стадии у никогда некурящих пациентов количественные значения биомаркеров воспаления и морфо-функциональные свойства нейтрофилов отличаются от данных у курящих и бывших курящих больных ХОБЛ более высокой активностью калликреина, более высокой активностью эластазы при обострении и более значительным ростом активности сц-протеиназного ингибитора и а2-макроглобулина в индуцированной мокроте после купирования обострения, более низкой концентрацией миелопероксидазы в нейтрофилах крови при обострении ХОБЛ и увеличением значения этого показателя после купирования обострения.
Внедрение результатов исследования
Результаты работы применяются в учебном процессе кафедры госпитальной терапии с курсом физической реабилитации и спортивной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава, в лечебном процессе пульмонологического отделения ОГУЗ Томская областная клиническая больница.
Апробация работы
Материалы исследования доложены и обсуждены на I съезде терапевтов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2005), 15 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2005), Европейском респира-
12 торном конгрессе (Мюнхен, 2006), VII и VIII конгрессах молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2006, 2007), 7-й Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке (Москва, 2006), практической конференции для врачей ОГУЗ «Областная клиническая больница» (2006), Европейском респираторном конгрессе (Стокгольм, 2007), на проблемной комиссии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава по пульмонологии, на заседаниях кафедры госпитальной терапии с курсом физической реабилитации и спортивной медицины.
Публикации
По теме диссертации опубликована 21 печатная работа, из них 2 статьи в журналах из «Перечня ...» ВАК РФ. Получены два патента на изобретение (№2298183, №2298184 от 27 апреля 2007г.; Бюллетень изобретений №12, 2007г.).
Практическая значимость работы
Полученные данные формируют представление о некоторых протек-тивных механизмах, препятствующих развитию ХОБЛ у «злостных курильщиков», что создает теоретический базис для разработки средств прицельной профилактики и терапии ХОБЛ. Кроме того, эти данные закладывают основу поиска способов для идентификации степени риска развития заболевания.
На основании проведенного исследования сделано заключение, что наиболее информативным средством контроля эффективности лечения обострений ХОБЛ II-IV стадии является динамика респираторных симптомов — кашля, продукции мокроты, одышки, хрипов, ночного удушья и их суммарного показателя - клинического индекса, контроль дистанции, проходимой пациентом в тесте с 6-минутной ходьбой, и недостаточную информативность для мониторинга обострения показателя ОФВь
Данные настоящего исследования показывают, что отказ от курения пациентов с ХОБЛ в качестве средства, уменьшающего прогрессирование болезни, должен происходить на ранних стадиях болезни.
13 Положения, выносимые на защиту
У «злостных курильщиков» без клинических и спирометрических признаков ХОБЛ в бронхиальном регионе инициируется нейтрофильное воспаление с высокой активностью протеолитических ферментов и их ингибиторов, повышенной концентрацией малонового диальдегида в индуцированной мокроте, происходит модифицирование морфофункциональных свойств лейкоцитов нейтрофильного и макрофагального пулов.
У «злостных курильщиков» толерантность к развитию ХОБЛ может поддерживаться высокой активностью протеолитических ингибиторов и меньшей активностью протеиназ, низкой активностью калликреин-кининовой системы, высокой активностью каталазы в бронхиальном регионе, большим количеством миелопероксидазы и катионных протеинов в цитоплазме нейтрофилов бронхиального региона.
Положительная динамика лечения обострений ХОБЛ III-IV стадии проявляется независимо от фактора курения (курящие, бывшие курящие, никогда некурящие) регрессом респираторных симптомов - кашля, продукции мокроты, одышки, хрипов, ночного удушья и уменьшением их суммарного показателя — клинического индекса при отсутствии динамики значений ОФВі и дистанции, проходимой в тесте с 6-минутной ходьбой.
У бывших злостных курильщиков при ХОБЛ III-IV стадии отказ от курения в течение 5-6 лет при обострении болезни не оказывает влияния на респираторные симптомы, динамику ОФВь дистанцию в тесте с 6-минутной ходьбой, на количественные показатели биомаркеров воспаления в бронхиальном регионе и морфофункциональные свойства нейтрофилов, значения которых остаются на уровне больных ХОБЛ III-IV стадии, злостных курильщиков, продолжающих курение.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 163 страницах машинописного текста, содержит 35 таблиц, 5 рисунков и состоит из введения, обзора литературы
14 (первая глава), материалов и методов исследования (вторая глава), результатов исследования (третья глава), обсуждения результатов (четвертая глава), выводов, практических рекомендаций, списка литературы.
Библиографический указатель содержит 208 источников литературы, из которых 77 на русском языке, 131 на английском языке.
\
Роль оксидант/антиоксидантной системы в патогенезе ХОБЛ
Исследования последних лет показали, что оксиданты, в первую очередь, активные формы кислорода, играют ключевую роль в молекулярных механизмах патогенеза ХОБЛ. Респираторный тракт постоянно подвергаются действию кислорода и других ингалируемых газов - озона, диоксидов азота и серы и т.д., обладающих оксидативным эффектом [63, 64, 73, 98, 171]. Значительные количества АФК продуцируют фагоцитирующие клетки (нейтро-филы, эозинофилы, макрофаги, и т.д.) при взаимодействии с микроорганизмами, находящимися в воздухе, пылевыми частицами, иммунными комплексами [63]. На легкие прямо воздействуют оксиданты, находящиеся в табачном дыме.
В настоящее время известно, что в норме активные формы кислорода (АФК) (пероксид водорода, гипохлорит, кислородные радикалы — супероксид и гидроксил) играют важную роль во многих жизненно важных процессах в организме. Они участвуют в биоэнергетических процессах, поддержании го-меостаза, окислении и детоксикации экзо- и эндогенных соединений, обладают микробоцидными свойствами, противоопухолевыми свойствами, влияют на иммунитет [6, 100, 125]. Формирование АФК - важный защитный механизм, лежащий в основе неспецифического иммунитета: фагоцитоз приводит к многократному увеличению содержания АФК в фагоцитирующих клетках с одновременным повышением потребления кислорода в 20 и более раз ("дыхательный взрыв") [43].
Защиту от повреждающего действия АФК обеспечивают в первую очередь специальные антиоксидантные ферменты: супероксиддисмутаза (СОД), каталаза, ферменты редокс-системы глутатиона [89, 126]. Фармакологическое действие антиоксидантов обусловлено их способностью связывать свободные радикалы и уменьшать интенсивность окислительных процессов в организме. СОД является основным ингибитором образования 02-, катализируя реакцию дисмутации 02- в Н2О2. Разложение Н202 до воды и молекулярного кислорода происходит под влиянием каталазы. В норме в системе ок-сиданты-антиоксиданты сохраняется равновесие. Нарушение этого баланса в пользу оксидантов приводит к развитию так называемого оксидативного стресса [194]. Он выражается в избыточной продукции АФК и недостаточности антиоксидантной защиты.
Неконтролируемая генерация АФК и их производных вызывает повреждение белков, нуклеиновых кислот, ферментов, биомембран и в конечном итоге приводит к развитию патологических состояний, нарушая механизмы адаптации. С другой стороны, недостаток радикалов может привести к незавершенности фагоцитоза и усилить хронизацию воспалительного процесса [70]. Важным проявлением повреждающего действия АФК является ПОЛ. Ткань легких содержит в избытке ненасыщенные жирные кислоты, которые являются субстратом ПОЛ [63].
В воспалительном процессе при ХОБЛ участвуют практически все клеточные элементы респираторной системы, однако наибольшее значение придается фагоцитирующим клеткам (нейтрофилы, макрофаги, эозинофилы), которые обладают мощными специализированными системами генерации
АФК. Функциональная активность фагоцитирующих клеток в значительной степени обусловлена способностью этих клеток генерировать АФК [63, 64].
В мокроте и жидкости бронхоальвеолярного лаважа у курящих больных ХОБЛ обычно выявляется повышенное количество нейтрофилов [96]. Данной аккумуляции клеток способствуют следующие причины. Во-первых, курение ведет к 10-кратному увеличению содержания нейтрофилов в дис-тальных отделах респираторной системы. Во-вторых, в сосудах легких больных ХОБЛ повышение уровня циркулирующих Е-селектинов и внутриклеточных адгезивных молекул, увеличивающих прилипание нейтрофилов к эндотелию. В третьих, оксиданты табачного дыма вызывают полимеризацию актина нейтрофилов и снижают их деформируемость. Все выше перечисленные причины способствуют застреванию нейтрофилов в капиллярах легких и их адгезии к эндотелию [17]. В свою очередь, адгезия клеток сопровождается генерацией АФК. Затем нейтрофилы мигрируют через межэндотелиальные пространства, которые увеличиваются под действием оксидантов.
Гигантское скопление активированных нейтрофилов в капиллярной сети альвеол приводит к оксидативному стрессу, под действием которого происходит разрушение структурных элементов альвеол. Кроме этого известно, что нейтрофилы путем повышенной секреции протеиназ (нейтро-фильной эластазы, катепсин G и протеиназу-3) могут привести к альвеолярной деструкции, следствие развитие эмфиземы [96].
Оксидативный стресс играет ключевую роль в патофизиологии ХОБЛ и усиливает воспалительные и деструктивные процессы. АФК сигаретного дыма или воспалительных клеток приводят к некоторым повреждающим эффектам при ХОБЛ. Так, образующийся в реакции МПО-Н202-галоген, гипо-хлорит инактивирует ингибиторы протеиназ и таким образом усиливает распад эластина в легочной ткани под действием эластазы [185, 190]. Деструкция ткани легких обусловлена и прямой токсичностью АФК. Оксиданты не только повреждают молекулы (белки, липиды, нуклеиновые кислоты), но также опосредуют множество процессов, благоприятствующих развитию ХОБЛ: повреждают фибробласты, снижают активность сурфактанта, стимулируют образование тромбоксанов и лейкотриенов, повышают проницаемость эпителия, ухудшают функцию ресничек, снижают активность Ь-адренорецепторов и, наоборот, повышают активность холинергических структур и т.д. [63]. АФК также способствуют воспалению, активируя фактор NF-kb, организующий эксрессию многих воспалительных генов-ИЛ8 и ТНФ [94]. Наконец, оксидативный стресс может иметь отношение к обратимой обструкции бронхов [94, 176]. АФК могут напрямую увеличивать секрецию слизи [83]. Системный оксидативный стресс может вносить вклад в развитие слабости дыхательной мускулатуры, утомляемости у некоторых больных ХОБЛ [145, 194]. Современные исследования предполагают, что может быть связь между оксидативным стрессом и низким ответом на кортикостероиды при ХОБЛ [96, 130, 170]. Таким образом, оксидативный стресс может индуцировать стероидорезистентность.
Определение содержания оксидант/антиоксидантной системы
Метод основан на образовании окрашенного комплекса в условиях высокой температуры и кислого рН при взаимодействии 1 молекулы малонового диальдегида (МДА) с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) с максимальным поглощением в красной области видимого света при X — 523 нм [34].
Ход определения. Для исследования отбирают 0,2 мл мокроты, добавляют 2 мл 50 мМ трис НС1 буфера, 1,0 мл раствора ТХУ и 1,0 мл раствора ТБК. Пробу прогревают в кипящей водяной бане в течение 20 мин, затем центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин (на центрифуге типа ОПН-3).
Интенсивность окраски измеряют при длине волны 523 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Для проведения расчетов используют следующую фор 4 мл — объем водной фазы, 0.1 мл — объем мокроты, 10 — коэффициент перевода «моль/л» в «мкмоль/л», 1.56 10 — коэффициент молярной экстинкции.
Принцип метода: основан на способности перекиси водорода, образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс [47]. Ход определения: К 0,1 мл мокроты доливали 2 мл 0,03 % раствора Н2Ог. В холостую пробу добавляли вместо мокроты 0,1 мл дистиллированной воды. Пробы инкубировали в течение 10 мин при температуре 37 С. Реакцию останавливали добавлением 1мл 4% молибдата аммония. Пробы центрифугировали при 3000 об/мин. Интенсивность окраски измеряли при длине волны 410 нм против контроля. В качестве контрольной пробы использовали образец, содержащий вместо Н2Ог 2 мл воды. Для проведения расчетов используют следующую формулу: Е = ( Ахол- Аоп) / V t К, где Ахол- экстинкция холостой пробы, Аоп - экстинкция опытной пробы. V - объем вносимой пробы, 0, 1 мл, t — время инкубации, 600 сек. К — коэффициент миллимолярной экстинкции перекиси водорода, равный 22,2 К мМ см"1. Определение активности супероксиддисмутазы Принцип метода: В основе метода служит способность фермента супероксиддисмутазы при рН=10,2 тормозить реакцию окисления адреналина в адренохром [8]. Ход определения: Измерение активности супероксиддисмутазы проводят в кювете спектрофотометра. В кювету . вносили 3 мл 0,05 М Na карбонатного буфера, рН=10,2, содержащего 0,05 ЭДТА и 0,2 мл 0,1% раствора адреналина Параллельно готовили пробу, содержащую 3 мл буфера, 0,2 мл 0,1% раствора адреналина и 0,1 мл мокроты. Измеряли прирост оптической плотности при 480 нм. За единицу активности СОД принимали количество фермента, вызывающего 50% торможение окисления адреналина. Принцип метода: Активность калликреина и калликреиногена в плазме крови определяли по методу Пасхиной Т.С., Кринской А.В., 1987 [56]. Метод включает два основных этапа: получение неадсорбированной фракции белков сыворотки крови на ДЭАЭ-сефадексе А-50 и измерение активности калликреина и калликреиногена в этой фракции спектрофотометрическим методом по скорости гидролиза этилового эфира 1Ч-бензол-Ь-аргинина (БА-ЭЭ). Ход определения: 0,5 мл мокроте разводили 0,5 мл 0,02 М фосфатным буфером (рН 7.0) и переносили на колонку из полистирола объемом 3x0.8 см, заполненную ДЭАЭ-сефадексом А-50, приготовленным на том же буфере. Белки элюировали 0.02 М фосфатным буфером (рН=7.0), содержащим 0.05 М NaCl, со скоростью 1 мл/мин, собирая 5 мл фильтрата. Для определения активности калликреина к 1 мл фильтрата добавляли 1 мл 0.02 М раствора фосфатного буфера (рН=8.0) и оставляют на 10 мин при температуре 25 С. Далее в эту смесь добавляют 1 мл 1.5 мМ раствора БАЭЭ и измеряли прирост оптической плотности при А,=253 нм против контроля (2 мл фосфатного буфера и 1 мл раствора БАЭЭ). Отсчет делали каждые 3 мин в течение 15 мин. Для определения активности калликреиногена к 1 мл неадсорбированной фракции добавляли 0.8 мл фосфатного буфера, 0.1 мл 0.1% раствора трипсина и выдерживали 2 мин при 25 С. Затем добавляли 0.1 мл 2% раствора соевого ингибитора трипсина, через 15 мин в эту смесь добавляли 1 мл 1.5 мМ раствора БАЭЭ и измеряли прирост оптической плотности при А,=253 нм, делая отсчет каждые 3 мин в течение 15 мин. Содержание калликреиногена и калликреина выражали в миллиедини-цах в 1 мл сыворотки крови и вычисляли по формуле: Активность фермента, мЕ/мл = Д25з 1 3 5" 1000/0,5 1,115 1, где Д253 - прирост оптической плотности в пробе за 15 мин, 1.1— оптическая плотность, соответствующая образованию 1 мкМ N-бензоил-Ь-аргинина из БАЭЭ в 1 мл пробы, 3 — объем пробы в кювете (мл), 5 — объем неадсорбированной фракции (мл), 0.5 - количество мокроты, взятой для анализа (мл).
Содержание миелопероксидазы в нейтрофилах индуцированной мокроты, крови, «кожного окна» у здоровых некурящих, «злостных курильщиков» и при обострении ХОБЛ
Выявлены значимые различия в содержании миелопероксидазы в неитрофилах мокроты в группе здоровых некурящих по сравнению с группой «злостных курильщиков» (табл.7). Содержание миелопероксидазы выше в группе «злостных курильщиков» в 2 раза (Р 0,001) (рис.3).
На II, III, IV стадии ХОБЛ содержание миелопероксидазы в неитрофилах мокроты уменьшается по сравнению с группой «злостных курильщиков» в 1,8, в 1,9 и в 1,4 раза соответственно (Р 0,001) (рис.4).
Не выявлены различия в количестве МЛО в неитрофилах мокроты между больными ХОБЛ всех групп и здоровыми некурящими.
Следовательно, нейтрофилы мокроты у «злостных курильщиков» характеризуются повышенным содержанием миелопероксидазы по сравнению со здоровыми некурящими и больными ХОБЛ. При формировании ХОБЛ и по мере её прогрессирования концентрация миелопероксидазы в неитрофилах мокроты снижается.
Не выявлены различия в содержании миелопероксидазы в неитрофилах крови между группами здоровых некурящих и «злостных курильщиков» (табл.8). В зависимости от стадии содержание МПО в крови также значимо не меняется.
В нейтрофилах «кожного окна» концентрация миелопероксидазы через 4 часа после скарификации выше в 4 раза (Р 0,05) в группе «злостных курильщиков» по сравнению с группой здоровых некурящих (табл.9) (рис.5).
Через 20 часов сохраняется аналогичное соотношение. Выявлено, что у больных с IV стадией болезни концентрация МПО в нейтрофиле меньше, чем у «злостных курильщиков». Статистически не выявлено различий в количестве МП в нейтрофилах «кожного окна» в зависимости от стадии.
В норме через 4 часа к стеклу прилипает 70-80% нейтрофилов и 20-30% моноцитов/макрофагов. Через 20 часов картина меняется и на стекле преобладают моноциты/макрофаги (60 — 70 %). Если смены не происходит — следует ожидать проблем с репарацией у данного больного. Опасение основано на том, что мононуклеары необходимы для запуска фиброгенеза в очаге. Это может быть причиной вялотекущего воспаления, язв, абсцессов и пр. Вместе с тем, персистенция нейтрофильного воспаления инициирует процессы деструкции матрикса и других биоструктур. Выявлена несвоевременность смены фаз у «злостных курильщиков» и у больных ХОБЛ (табл. 10).
У лиц, относящихся к «злостным курильщикам», а также при ХОБЛ в очаге воспаления через 20 часов количество нейтрофилов уменьшается недостаточно быстро, замедляется поступление макрофагов, которых к этому времени становится не более 30% , вместо 70% в норме. Кроме того, через 4 часа в области скарификации в группах «злостных курильщиков» и больных ХОБЛ уменьшено количество макрофагов.
У больных ХОБЛ значимо увеличивается количество дегенеративных форм нейтрофилов в 1,5 и 2 раза по сравнению со здоровыми некурящими и «злостными курильщиками» во II стадию, в 2 и 2,4 раза по сравнению со здоровыми некурящими и «злостными курильщиками» в III стадию, в 1,7 и 2 раза в IV стадию.
Таким образом, у длительно курящих лиц - «злостных курильщиков» и при всех стадиях ХОБЛ через 4 часа после скарификации наблюдается повышенная концентрация нейтрофилов в отпечатке «кожного окна», а к 20-му часу асептического воспаления не происходит смены нейтрофильной фазы воспаления на макрофагальную.
При сравнении цитограмм индуцированной мокроты в зависимости от факта курения значимые различия были получены по процентному содержанию нейтрофилов и эозинофилов, которых оказалось больше у «злостных курильщиков», а также по процентному содержанию макрофагов, которых больше у здоровых некурящих (табл.11).
В группе «злостных курильщиков» количество эозинофилов выше в 12 раз (Р 0,007), а количество нейтрофилов выше в 2,2 раза (Р 0,02) по сравнению со здоровыми некурящими. Содержание макрофагов уменьшилось в 2,2 раза у «злостных курильщиков» по сравнению с группой здоровых некурящих (Р 0,004).
У больных ХОБЛ независимо от стадии количество эозинофилов выше, чем у здоровых некурящих (Р 0,05) и не отличается от «злостных ку рилыциков». Между стадиями ХОБЛ не выявлено значимых различий в количестве эозинофилов.
У больных ХОБЛ количество макрофагов продолжает снижаться. На II стадии меньше в 3 раза (Р 0,0001), на III стадии в 3,8 (Р 0,0001), на IV стадии в 4,4(Р 0,0001) раза по отношению к «злостным курильщикам». По отношению к здоровым некурящим в зависимости от стадии меньше в 1,6; 6,6; 8,3; 9,8 раз соответственно (Р 0,0001). Кроме того, у больных с I стадией ХОБЛ статистически больше макрофагов, чем со II,III,IV стадией (Р 0,001).
Содержание миелопероксидазы в нейтрофилах крови, мокроты, «кожного окна» у больных ХОБЛ после купирования обострения в сравнении с группой «злостных курильщиков»
Содержание миелопероксидазы в нейтрофилах крови на всех стадиях ХОБЛ после лечения не изменялась по отношению к аналогичному параметру при обострении заболевания (табл.19).
Однако на II и III стадии болезни значение данного показателя в ремиссию уже было выше группы здоровых некурящих в 1,5 и 1,6 раза соответственно. На IV стадии ХОБЛ содержание МП в крови после лечения не изменяется, и данный показатель в ремиссию по-прежнему не отличается от группы контроля и группы «злостных курильщиков».
Рг в сравнении с аналогичными показателями у здоровых некурящих Р2- в сравнении с аналогичными показателями у «злостных курильщиков» Р3 - в сравнении с аналогичными показателями у пациентов с ХОБЛ до лечения
Содержание миелопероксидазы в нейтрофилах индуцированной мокроты на всех стадиях ХОБЛ после лечения существенно не изменялась по отношению к аналогичному параметру при обострении заболевания (табл.20). На всех стадиях ХОБЛ количество МПО в нейтрофилах мокроты в период ремиссии, также как и в период обострения, оставалось ниже примерно в 1,8 раза значений группы «злостных курильщиков» и статистически не отличалось от группы здоровых некурящих. Рг в сравнении с аналогичными показателями у здоровых некурящих Р2- в сравнении с аналогичными показателями у «злостных курильщиков»
Содержание миелопероксидазы в нейтрофилах «кожного окна» на всех стадиях ХОБЛ после лечения существенно не изменялась по отношению к аналогичному параметру при обострении заболевания (табл.21).
Однако, у больных со II и III стадией содержание МЛО в нейтрофиле «кожного окна» через 4 часа после скарификации становится выше (в 3,4 и 2,7 раза соответственно) по сравнению с МПО в группе здоровых некурящих, что не наблюдается в период обострения. На IV стадии ХОБЛ содержание миелопероксидазы в нейтрофилах «кожного окна» через 4 часа скарификации в ремиссию уже не отличается от группы «злостных курильщиков».
Таким образом, изучая содержание миелопероксидазы в нейтрофилах «кожного окна», крови, индуцированной мокроты на всех стадиях ХОБЛ после лечения, мы не выявили динамики этого показателя по отношению к аналогичному параметру при обострении заболевания.
На II и III стадии ХОБЛ содержание МПО в нейтрофилах мокроты после лечения оставалась ниже показателей группы «злостных курильщиков», а в крови и «кожном окне» (МПО в клетке через 4 часа после скарификации) в период ремиссии эти показатели были уже выше по сравнению с группой здоровых некурящих.
На IV стадии ХОБЛ содержание МПО в нейтрофилах мокроты после лечения оставалась ниже показателей группы «злостных курильщиков», в крови содержание этого показателя, как в ремиссию, так и в обострение, вообще не отличалась от группы контроля и «злостных курильщиков». В нейтрофилах «кожного окна» через 4 часа скарификации после лечения этот показатель уже не отличается от группы «злостных курильщиков».
