Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Аминокислоты, их биологическая ценность и физиологическая роль (обзор литературы) 12
1.1. Трофологический статус, его недостаточность, оценка у детей и подростков 12
1.2. Особенности азотистого обмена у детей и подростков . 19
1.3. Метаболизм аминокислот при различных патологических со стояниях 26
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 34
2.1. Характеристика детей, подростков здоровых, с трофологически-ми нарушениями, больных туберкулёзом 34
2.2. Клинические методы исследования 37
2.3. Лабораторные методы исследования 38
2.4. Методы статистического исследования 41
2.5. Дизайн исследования, критерии включения и исключения 43
ГЛАВА III. Результаты собственных исследований 45
3.1. Состояние питания детей и подростков здоровых, с трофологиче-скими нарушениями 45
3.2. Клиническая характеристика детей, больных туберкулёзом, подростков здоровых, с недостаточностью питания 54
3.3. Анализ содержания свободных аминокислот в сыворотке крови у детей, подростков здоровых, имеющих недостаточность питания, больных туберкулёзом 62
3.4. Многофакторный анализ изучаемых признаков у детей и подростков исследуемых групп 71
Заключение 93 Выводы 105
Практические рекомендации 106
Литература
- Особенности азотистого обмена у детей и подростков
- Метаболизм аминокислот при различных патологических со стояниях
- Лабораторные методы исследования
- Клиническая характеристика детей, больных туберкулёзом, подростков здоровых, с недостаточностью питания
Особенности азотистого обмена у детей и подростков
Общеизвестно, как велико значение питания для жизни и здоровья человека. Питание по праву считается одним из важнейших факторов тесной связи всего живого на Земле с окружающей средой, которая воздействует на организм человека с момента его рождения [3, 65].
Под питанием (nutricio лат.) понимается процесс поступления, переваривания, всасывания, усвоения в организме веществ, необходимых для покрытия его энергетических затрат, регенерации тканей и регуляции функций организма. Состояние фактического питания предопределяет рост и развитие организма, структуру и функцию органов и систем, наличие адаптационных резервов, физическую и умственную работоспособность и т. д. От полноценности питания зависит качество жизни человека, а также его способность переносить критические ситуации (заболевания, травмы, операции, экстремальные нагрузки) [21, 87].
Считается, что трофика (питание) организма обеспечивается четырьмя взаимосвязанными между собой процессами: - пищеварительным гидролизом, всасыванием и доставкой питательных ве ществ к клеткам организма; - усвоением доставленных нутриентов клетками; - соотношением процессов ассимиляции и диссимиляции (синтеза и распада); - выведением из организма конечных продуктов метаболизма [52, 53, 54]. То есть трофика организма обусловлена комплексом биохимических и связанных с ними энергетических процессов, лежащих в основе жизнедеятельности всех живых организмов - процессов обмена веществ и энергии [9, 10, 11, 28]. В настоящее время при оценке состояния питания используется различная терминология: статус питания, алиментарный, пищевой, нутрицион-ный, метаболический статус [71, 141].
Нередко состояние организма, связанное с питанием, трактуется как обеспеченность организма пищей или как процесс потребления пищи. С 1992 года предложено ввести в медицинскую практику понятие «трофологический статус», характеризующее состояние здоровья и физического развития организма, непосредственно связанное с процессом его питания [52, 53]. В. М. Луфт [52, 53, 54, 55] предложил определение трофологического статуса здорового и больного человека, им разработаны методы и критерии его оценки.
Трофологический статус – это обусловленная конституцией, полом, возрастом человека совокупность метаболических процессов организма, обеспечивающих адекватное функционирование его структуры с целью поддержания устойчивого гомеостаза и широких адаптационных резервов, которые зависят от предшествующего фактического питания, условий жизни, а для больного человека - еще и болезни [53].
Оценка состояния питания - яркого морфофункционального показателя организма играет немаловажную роль в суждении о росте и развитии детей и подростков [13, 14, 46, 87, 90].
Трофологический статус должен оцениваться у любого ребёнка, независимо от того, наблюдается он амбулаторно или лечится в стационаре [41]. Различные клинические ситуации могут определять значимость оценки трофологического статуса: - подтверждение нормального физического развития. Нарушение развития может быть симптомом определенного заболевания. Поэтому, казалось бы, у внешне здорового ребенка неадекватные весовые прибавки и (или) низкая скорость роста должны рассматриваться как ранние симптомы болезни; - в случае доказанной болезни (мальабсорбции, воспалительных заболеваний, хирургической патологии) трофологический статус может определять выбор и тактику терапии; - все хронические болезни с вовлечением или отсутствием вовлечения ЖКТ имеют риск развития белково-калорийной недостаточности из-за таких фак торов как воспаление, метаболические расстройства, дефицит каких-либо элементов или воздействие лекарств; - регулярная оценка трофологического статуса может выявить негативные или позитивные изменения в процессе лечения независимо от способа нут риционной поддержки. Комплексная оценка трофологического статуса включает клинический, антропометрический и лабораторный методы. К наиболее часто используемым методам оценки состояния питания можно отнести клинический и антропометрический [41].
Клинический метод базируется на анамнезе, в том числе на диетологическом, объективном исследовании. Собирая анамнез, можно проанализировать начало отставания темпов роста, предшествующие заболевания, специфическую терапию и имеющиеся пищевые ограничения. Учитываются национальные и социальные особенности, а также культура питания [6, 8, 9, 42, 71].
Диетологический анамнез позволяет оценить реальное суточное потребление калорий, белков, жиров, витаминов, микроэлементов.
Объективное исследование помогает обнаружить причины отставания в развитии, выявляет признаки хронической патологии.
Антропометрические (соматометрические) методы наиболее доступны, неинвазивны, обладают достаточной точностью и легки в использовании. Поэтому начинать проведение оценки состояния питания детей и подростков целесообразно с выполнения соматометрических исследований (масса тела, рост, толщина кожно-жировых складок) [5, 52, 68, 98, 102, 126].
Результаты антропометрии выявляют индивидуальные особенности физического развития и расстройства питания. Отмечено, что длительный период неадекватного питания влияет на физическое развитие ребёнка и вызывает выраженные расстройства питания [8, 79, 99, 116, 126]. Выявляется зависимость между состоянием питания и течением заболевания [11, 42, 97, 135, 152]. Показатели массы тела и роста ребёнка во многом зависят от различных факторов: возраста, конституции, наследственности, сопутствующих заболеваний, предшествующего питания, условий жизни ребёнка, социального статуса родителей [5, 8, 22, 46, 127, 150; 153].
Невозможность характеризовать состояние питания по какому-либо одному антропометрическому показателю привела к использованию в этих целях формул и индексов [56, 112]. При этом линейный рост помогает дифференцировать острые и долгосрочные нарушения трофологического статуса. Острые изменения в трофологическом статусе могут не отразиться на этом параметре. Отставание в росте наблюдается при хронической белково-калорийной недостаточности.
Масса тела - достаточно чувствительный маркёр в оценке пищевых дефицитов (исключение составляют дети с отёками, асцитом, дегидратацией, большими опухолями). Простое отклонение массы от средних возрастных значений может отражать степень острой белково-калорийной недостаточности. Учёт только весовых показателей недостаточно объективен - дети одинаковой массы, но разного роста имеют разную степень белково-калорийной недостаточности. Поэтому взаимодействие массы и роста наиболее обьек-тивно отражает нарушения трофологического статуса [21, 41].
Метаболизм аминокислот при различных патологических со стояниях
У всех детей и подростков проводили изучение анамнеза и объективный осмотр. Из анамнестических сведений представляли интерес факторы риска развития отклонений в состоянии питания: экстрагенитальная патология у матери, гестозы беременных, гипотрофия в раннем возрасте, частота острых заболеваний в год и др. При физикальном осмотре оценивали следующие клинические признаки: пропорциональность телосложения, эластичность кожи, симптомы витаминной недостаточности (сухость и шелушение кожных покровов, хейлит, стоматит). Каждый признак содержал две вариации оценки: наблюдается, не наблюдается.
Состояние питания детей и подростков оценивали по международным стандартам, определяли массо-ростовой показатель - индекс Кетле по формуле: ИМТ = М/Р2, где ИМТ - индекс Кетле, М - масса тела в килограммах, Р - рост в метрах.
Массу тела у детей и подростков определяли в нижнем белье на медицинских весах типа «Фербенкс» с точностью до 50 граммов. Длину тела измеряли медицинским ростомером с точностью до 0,5 сантиметра после снятия обуви в положении «стоя», причём пятки, ягодицы и плечи касались измерительного столба.
Заключение о состоянии питания по индексу Кетле выносили аналогично общим подходам непараметрического метода, которые базируются на определении индекса массы тела (индекса Кетле) в зависимости от возраста.
Достаточное питание констатировали при определении индекса массы тела в зоне от 25 до 75 центиля (4 коридор - свойственно 50 % здоровых детей). Нахождение индекса Кетле в зоне ниже 10 (3) центиля свидетельствовало о низком (очень низком) состоянии питания, при высоком (очень высоком) состоянии питания показатель находился в зоне выше 90 (97) центиля -соответственно 2, 1, 6, 7 центильные коридоры. При величинах индекса массы тела, соответствующих 3-му (от 25 до 10 центиля) или 5-му (от 50 до 75 центиля) коридору, состояние питания считали пограничным (ниже или выше среднего).
Учитывая, что индекс массы тела может отражать недостаточность трофологического статуса, степень белково-калорийной недостаточности при определении процента отклонения фактической массы тела от рекомендуемой определяли: 1 степень белково-калорийной недостаточности - при снижении индекса массы тела до 80-90%, 2 степень - 70-80%, менее 70% - 3 степень.
С целью оценки спектра свободных аминокислот сыворотки крови у обследуемых детей и подростков осуществляли забор крови в одно и то же время суток - с 8 до 9 часов, последний приём пищи был в 19 часов (13-14 часов до исследования), что исключало влияние экзогенных аминокислот на аминокислотный пул сыворотки крови. Для определения аминокислот исследовали венозную кровь в количестве 5 мл путём пункции периферических вен.
Определение качественного и количественного содержания свободных аминокислот в сыворотке крови проводили с помощью метода жидкостной (элютивной ионообменной) хроматографии на аминокислотном анализаторе AMINO ACID AVALYZER T 339 (Чехия) по стандартной методике с применением буферной Na-цитратной системы.
Определение аминокислот данным методом основано на способности аминокислот в области низкой или высокой рН существовать в растворе как смесь трёх типов ионов (катиона, диполярного иона и аниона). Основой этого вида хроматографии является притяжение противоположных частиц, содержащих свободные к ионизации группы, от которых зависит суммарный заряд соединения - положительный или отрицательный. Величину этого заряда обусловливает рН буферного раствора. Ионообменной смолой заполняют ко 39 лонку, туда же вводят исследуемый материал. Чтобы разделить аминокислоты, проводят элюцию, пропуская через колонку буферы различной ионной силы с постепенно возрастающими значениями рН. Сильнокислая катионо-обменная смола при нужных значениях рН связывает положительно заряженные молекулы. При увеличении рН пропускаемых растворов ослабляется связь смола - аминокислота и, в конечном итоге, происходит элюирование молекул аминокислоты. Поскольку все аминокислоты обладают различной степенью кислотности, то происходит постепенное элюирование их с колонки.
Подготовку проб для исследования производили следующим образом: кровь центрифугировали и отделяли сыворотку, которую затем депротеини-зировали кислотным гидролизом, используя 6N соляную кислоту. Гидролиз проводили в сушильном шкафу при температуре 103-105С в течение 20-23 часов. Далее гидролизат выпаривали, растворяли в буфере с рН 2,2 и разбавляли буфером с рН 2,2 в соотношении 1:5. 1миллилитр свежеприготовленного гидролизата вводили на аналитическую колонку аминокислотного анализатора, запускали прибор по требованиям его эксплуатации.
Разделение аминокислот проводили в системе трех натрийцитратных буферных растворов: рН 3,5; рН 4,25 и рН 9,45. Данные буферные растворы подают в колонку по стандартной программе. На выходе из аналитической колонки разделенные аминокислоты смешивались в смесительном блоке с нингидриновым реактивом, полученные образцы непрерывно фотометриро-вались в кювете фотометра.
Качественный аминокислотный состав кислотного гидролизата определяли сравнением времени задерживания его отдельных пиков со временем задерживания компонентов стандартной смеси аминокислот.
Количественно содержание каждой аминокислоты, вымываемой из колонки, определялось измерением интенсивности окраски, возникающей при реакции аминокислоты с нингидрином, что автоматически записывалось в виде хроматограммы. Расшифровка хроматограмм с последующим расчётом количественного содержания аминокислот проводили вручную по окончании анализа.
Лабораторные методы исследования
В таблице 11 представлены данные, отражающие средние величины аминокислот в сыворотке крови мальчиков и девочек во всех группах. Как видно, различия групповых средних свободных аминокислот сыворотки крови обусловлены не полом детей и подростков, а принадлежностью к исследуемой группе (здоровые, больные туберкулёзом, имеющие недостаточность питания).
Таким образом, содержание свободных аминокислот в сыворотке крови было значительно ниже у больных туберкулёзом, чем у здоровых и имеющих недостаточность питания детей и подростков. У детей и подростков с недостаточностью питания I-II степеней в сравнении со здоровыми детьми и подростками не выявлено выраженных нарушений в аминокислотном спектре, однако отмечено увеличение суммарного содержания свободных аминокислот в сыворотке крови. Проведенный корреляционный анализ установил статистически значимые взаимосвязи количества свободных аминокислот сыворотки крови с общим количеством детей и подростков в группах, что дало возможность на следующем этапе исследования с использованием логистической регрессии провести определение возможных предикторов групп детей и подростков.
Для построения логистических уравнений использовались 40 предикторов в различных сочетаниях. Анализ результатов логистической регрессии по определению предикторов для зависимого признака «GRUPPA» с тремя градациями (больные туберкулёзом, имеющие недостаточность питания, здоровые дети и подростки) показал, что из всех независимых признаков, изученных на различных этапах наблюдения, более сильную связь с исследуемыми группами имели аминокислота лизин и индекс Кетле.
В таблице 12 представлены данные, отражающие оценку параметров уравнений логистической регрессии в зависимости от различных признаков и коэффициентов регрессии, статистики Вальда, Хи – квадрат, достигнутого уровня значимости, стандартизованных коэффициентов регрессии. Представленные фрагменты исследования демонстрируют лишь два итоговых варианта оценки уравнений логистической регрессии с высокими значениями показателя конкордации (C% = 99,9%, = 0,998 и C% = 99,6%, = 0,993).
Процент конкордации 99,6%. Коэффициент D – Зомера = 0,993 Как видно, полученные уравнения логистической регрессии содержали несколько отличающиеся наборы предикторов: рост, индекс Кетле, глутами-новая кислота, лизин и возраст, индекс Кетле, лейцин, лизин. Однако оценка уравнений логистической регрессии показала, что среди предикторов обязательно присутствовали, доминировали аминокислота лизин и индекс Кетле. Для лизина и индекса Кетле в первом варианте представленных уравнений (СК = - 7,1799, р = 0,0459 и СК = 8,6116, р = 0,0279) и во втором варианте (СК = - 4,1633, р = 0,0031 и СК = 4,8058, р = 0,016) стандартизованные коэффициенты регрессии были близки.
В то же время при использовании пошаговой процедуры первым в уравнение логистической регрессии в качестве предиктора был отобран лизин, а индекс Кетле - вторым. Этот выбор был обусловлен максимальным для лизина значением Хи - квадрат, равным 65,5677, р 0,0001, что указывало на статистически значимую взаимосвязь лизина с тремя градациями признака «GRUPPA». Так, исследуемые группы детей и подростков существенно различались по среднему содержанию лизина в сыворотке крови. У больных туберкулёзом среднее содержание лизина (6,75 мг/л) было в 2,3 раза ниже, чем у здоровых (15,3 мг/л) и имеющих недостаточность питания (15,5 мг/л) детей и подростков. В уравнении логистической регрессии только один лизин обеспечивал 85,1% конкордации ( = 0,706), а индекс Кетле вносил лишь 12% верного предсказания. То есть из определённых предикторов лизин являлся признаком, максимально различающим группы детей и подростков, что можно считать вполне закономерным, поскольку лизин является незаменимой аминокислотой, к недостатку которой особенно чувствительны дети и подростки. Дефицит лизина ведёт к замедлению роста и прибавки массы тела у детей и подростков.
Таким образом, метод логистической регрессии из всех изучаемых количественных и качественных признаков выделил незаменимую аминокислоту лизин и индекс Кетле. Из них максимальное влияние при распределении детей и подростков на группы здоровых, с недостаточностью питания и больных туберкулёзом оказывал лизин.
В целях обнаружения общих скрытых факторов, позволяющих проанализировать структуру взаимосвязей обследуемых объектов (дети и подростки) с количественными признаками (масса тела, рост, индекс Кетле, показатели свободных аминокислот, общего белка, альбуминов и глобулинов в сыворотке крови), был проведен факторный анализ.
В качестве метода факторизации корреляционной матрицы использовали метод анализа главных компонент.
Количество общих факторов, выделенных в пространстве использованных показателей, определялось собственными значениями каждого фактора, превышающими 1 (критерий Кайзера), при этом общая доля дисперсии, объясняемая общими факторами, была более 70%.
Клиническая характеристика детей, больных туберкулёзом, подростков здоровых, с недостаточностью питания
По количественному содержанию свободных аминокислот в сыворотке крови группы исследования имели некоторые особенности. Так, по нашим данным, суммарное содержание свободных аминокислот в сыворотке крови в группе с недостаточностью питания было в 1,2 раза больше, а у больных туберкулёзом в 2 раза меньше, чем у здоровых детей и подростков. Как видно, недостаточность питания у детей и подростков сопровождалась увеличением, а туберкулёз - снижением общего уровня свободных аминокислот сыворотки крови.
Сравнение исследуемых групп детей и подростков показало статистически значимое различие групповых средних свободных аминокислот сыворотки крови. Это различие было вызвано группой больных туберкулёзом детей и подростков. Нами обнаружено, что общий средний уровень свободных аминокислот сыворотки крови, таких как: валин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, треонин, фенилаланин, аспарагиновая кислота, серин, глутамино-вая кислота, глицин, аланин, тирозин, гистидин, аргинин у всех больных туберкулёзом был в 2 раза ниже, чем у здоровых и имеющих недостаточность питания детей и подростков.
Выявленное существенное снижение концентрации свободных аминокислот в сыворотке крови у детей и подростков, больных туберкулёзом, возможно, являлось особенностью метаболического ответа на туберкулёзную инфекцию, так как считается, что для метаболического ответа на агрессию любой этиологии, в том числе и на тяжёлое инфекционное заболевание, характерна катаболическая направленность обменных нарушений и как следствие - гипераминоацидемия [30; 32; 57].
Полученные нами результаты совпадали с уже опубликованными данными, по которым туберкулёз действительно вызывал значительное снижение аминокислотного спектра сыворотки крови, что объяснялось нарушением нейроэндокринной регуляции, гиповитаминозом, поражением печени, а также снижением активности некоторых ферментов аминокислотного обмена в 60-е годы при туберкулёзе у взрослых [35; 67; 75; 84].
В литературных источниках нам не встретились данные относительно содержания свободных аминокислот в сыворотке крови у детей и подростков с недостаточностью питания. Нами не было обнаружено статистически значимых различий группы детей и подростков с недостаточностью питания от группы здоровых по среднему уровню свободных аминокислот в сыворотке крови. Видимо, недостаточность питания I и II степеней у детей и подростков не сопровождалась нарушением в аминокислотном спектре. Увеличение суммарного содержания свободных аминокислот в сыворотке крови, полученное нами при недостаточности питания, можно объяснить возможным повышением метаболической активности, а также частичным использованием белков в качестве энергетического субстрата при низкой массе тела [28]. На возможность увеличения количества аминокислот в сыворотке крови при недостаточности питания указывала отрицательная корреляция индекса Кетле и свободных аминокислот сыворотки крови.
С целью рассмотрения взаимодействия аминокислот в аминокислотном спектре сыворотки крови были изучены корреляционные связи пар аминокислот в каждой из исследуемых групп детей и подростков.
Корреляционный анализ выявил у здоровых детей и подростков и, имеющих недостаточность питания меньшее, а у больных туберкулёзом -большее число статистически значимых пар взаимосвязанных аминокислот сыворотки крови.
Поскольку пул свободных аминокислот сыворотки крови характеризует обменные процессы, скорость протекания различных биохимических процессов [16; 59; 60; 86], выявленное нами число пар взаимосвязанных аминокислот, вероятно, отражало мобильность обменных процессов. Меньшее число корреляционных связей в аминокислотном спектре могло быть обусловлено большей «степенью свободы» возможных химических превращений и большей мобильностью обменных процессов. Большее число пар взаимосвязанных аминокислот могло быть проявлением уменьшения «степени свободы» и более жёсткого управления обмена веществ в условиях тяжёлой инфекционной патологии. При этом выявленное различное количество пар взаимосвязанных аминокислот указывало на специфичность аминокислотного обмена в группах исследования.
При корреляционном анализе в исследуемых группах детей и подростков нами также выявлено качественное совпадение пар взаимосвязанных аминокислот. Между аминокислотами прослеживались и были общими 19 пар значимых корреляций: АСП - ТРЕ, АСП - ВАЛ, АСП - ФАЛА, ТРЕ -ГЛИ, ТРЕ - ВАЛ, ТРЕ - ИЗО, ТРЕ - ЛЕЙ, ТРЕ - ФАЛА, СЕР - ИЗО, ГЛУ -ФАЛА, ГЛИ - ИЗО, ГЛИ - ФАЛА, АЛА - ТИР, АЛА - ФАЛА, АЛА - ЛИЗ, ВАЛ - ИЗО, ИЗО - АРГ, ЛЕЙ - ФАЛА, ЛЕЙ - АРГ, что подчёркивало общность функциональных взаимоотношений в сообществе аминокислот.
Между аминокислотами в сыворотке крови исследуемых групп детей и подростков существовала слабая, средняя и сильная корреляция. Так как все аминокислоты, входящие в состав белков, циркулируют в сыворотке крови, то, видимо, корреляционные связи между аминокислотами возникали и распадались в зависимости от фазы межуточного обмена самих аминокислот.
В совместной группе детей и подростков между аминокислотами нами были обнаружены тесные корреляции, что, вероятно, было следствием интенсивных, связанных с биосинтезом белка обменных процессов и подтверждало необходимость одновременного присутствия в организме всех изучаемых аминокислот, входящих в состав белков.
