Введение к работе
Актуальность исследования. Микрофлора желудочно-кишечного тракта играет чрезвычайно важную роль в поддержании здоровья ребенка. Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) является средой обитания для многочисленного и разнообразного сообщества микроорганизмов. Количество бактерий только в одном грамме содержимого толстой кишки достигает 1012 микробных клеток. Важно отметить, что даже незначительные изменения микробиоценоза кишечника у детей раннего возраста, особенно в период новорожденности, могут явиться причиной патологического процесса. (Кафарская Л.И., Ефимов Б.А., Постникова Е.А., Донских Е.Е., Детские инфекции 2006, 1: 6-11.; Lindberg E., Nowrouzian F., Adlerberth I., Wold A.E., Pediatric. research. 2000, 48: 741-747).
Исследования последнего времени показывают, что, колонизируя кишечник, аутохтонные бактерии участвуют в метаболизме сложных полисахаридов, модулируют местный иммунный ответ и препятствуют заселению кишечника патогенными микроорганизмами, что особенно важно на первом месяце жизни ребенка.
До недавнего времени современные представления о качественном и количественном составе микрофлоры, особенностях формирования биоценоза кишечника в неонатальном периоде основывались на использовании исключительно культуральных методов исследования.
Активное внедрение молекулярно-генетических методов в практику микробиологических исследований позволило получить новую информацию о составе и свойствах микроорганизмов, колонизирующих различные анатомические области тела человека (Eckburg P.B. и соавт., 2005, Tringe S.G. и соавт., 2008, Woo P.C. и соавт., 2008, Karlsson F.H. и соавт., 2011). Так, в последние годы была разработана целая палитра методов, основанных на сравнительном анализе видоспецифических нуклеотидных последовательностей геномной ДНК бактерий, позволяющих быстро и достоверно определять таксономическую принадлежность выделяемых микроорганизмов (Olsen G.J. и соавт., 1993, Stubbs S.L. и соавт., 2000, Deng W. и соавт., 2007).
Преобладающие в количественном отношении в этой экосистеме бактерии принадлежат к порядкам Bacteroidales (тип Bacteroidetes, класс Bacteroidia), Clostridiales (тип Firmicutes, класс Clostridia) и Bifidobacteriales (тип Actinobacteria, класс Actinobacteria) (Hayashi H. и соавт., 2002, Qin J., 2010).
Однако, несмотря на доминирующее положение, занимаемое бактериями порядка Bifidobacteriales в кишечнике детей раннего возраста, наши представления об их видовом составе остаются ограниченными. Это, в свою очередь, связано с недостаточной информативностью используемых для решения этой задачи конвенциональных микробиологических методов, которые основаны, прежде всего, на изучении относительно небольшого спектра фенотипических свойств бактериальных штаммов, изолируемых из биологического материала.
Бифидобактерии колонизируют желудочно-кишечный тракт, вскоре после рождения ребенка и присутствуют в нем в высоких концентрациях на протяжении всей жизни.
У здоровых грудных детей с 6-7 дня жизни бифидобактерии являются основой микробного пейзажа кишечника (85-98% всей кишечной микрофлоры), и содержание их достигает 1010-1011 в 1 грамме фекалий (Гончарова Г.И., 1986; Tannock G.W., 1994; Reuter G., 2001; Shanahan F., 2002; Tapianinen T. et al, 2006; Gronlund M.M. et al, 2007).
В этой связи, очевидна актуальность привлечения методов молекулярно-генетической идентификации для выяснения таксономической принадлежности бактерии порядка Bifidobacteriales кишечного происхождения.
Новым направлением в изучении пробиотического эффекта штаммов бифидобактерий является поиск и изучение свойств штаммов, продуцентов конъюгированной линолевой кислоты (КЛК).
КЛК обладает иммуномодулирующим эффектом, является ингибитором остеокластогенеза, обладает выраженным метаболическим потенциалом, влияет на липидный обмен, а также является одним из регуляторов апоптоза и обладает противовоспалительным и антиканцерогенным эффектом.
Таким образом, изучение микробиоценоза у новорожденных детей с использованием культуральных и молекулярно-генетических методов является актуальным, имеющим как научное, так и практическое значение.
Цель исследования: изучение особенностей формирования микрофлоры у детей раннего возраста с использованием классических и молекулярно-генетических методов и способности к продукции КЛК у штаммов бифидобактерий, выделенных из кишечника детей раннего возраста.
Задачи исследования:
1. Изучить особенности формирования микрофлоры у детей первых месяцев жизни с использованием классических бактериологических методов.
2. Подобрать нуклеотидные последовательности праймеров для детекции представителей рода Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacteroidales, Clostridium leptum и C. coccoides, Prevotella и Atopobium.
3. Используя молекулярно-генетические методы установить особенности формирования микрофлоры кишечника у детей первых месяцев жизни.
4. Провести сравнительный анализ информативности качественной и количественной детекции возбудителей в содержимом толстой кишки у детей раннего возраста.
5. Выделить и провести видовую идентификацию штаммов бифидобактерий колонизирующих кишечник доношенного новорожденного с помощью молекулярно-генетических методов.
6. Изучить способности выделенных штаммов к продукции КЛК.
Научная новизна
Подобраны нуклеотидные последовательности праймеров для детекции микроорганизмов в ПЦР-РВ, представителей рода Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacteroidales, Clostridium leptum и C. coccoides, Prevotella и Atopobium, что дало возможность быстро и эффективно детектировать труднокультивируемые и некльтивируемые группы микроорганизмов у детей раннего возраста.
Впервые проведен сравнительный мониторинг становления микрофлоры толстой кишки у новорожденных с помощью классических и молекулярно-генетических методов, который показал более высокую чувствительность эффективность метода ПЦР-РВ по сравнению с классическим бактериологическим методом
Впервые в ходе выполнения настоящей работы проведен анализ видового состава бифидофлоры с помощью ПЦР-РВ у доношенных новорожденных, выявлены доминирующие виды микроорганизмов порядка Bifidobacteriales у детей разного возраста (3-7 сутки жизни; 12-15 сутки жизни, 30-40 сутки жизни): B. bifidum, B. longum и B. breve.
Впервые выделен штамм бифидобактерий (B. breve), обладающий способностью к изомеризации КЛК осуществляет пробиотический эффект.
Практическая значимость
Получены новые данные о доминирующих видах состава бактерий порядка Bifidobacteriales у новорожденных детей при помощи ПЦР в реальном времени (B. bifidum, B. longum и B. breve), что необходимо учитывать при назначении пробиотических препаратов.
Новые пробиотические штаммы бифидобактерий, продуцента КЛК, могут служить в качестве перспективного штамма для создания нового пробиотического препарата.
Положения, выносимые на защиту
1. Микробиоценоз толстой кишки у клинически здоровых детей периода новорожденности характеризуется высокой концентрацией и частотой встречаемости, как облигатно анаэробных микроорганизмов, среди которых абсолютно доминирующими являются Bifidobacterium (100%), так и аллохтонных микроорганизмов относящиеся к роду: Klebsiella, Staphylococcus aureus, Clostridium leptum и C. сoccoides.
2. Исследование, проведенное с помощью ПЦР-РВ, позволяет с большей эффективностью детектировать микроорганизмы представителей рода Bifidobacterium, Bacteroides, Lactobacillus, а также труднокультивируемые группы C. leptum и C. coccoides, род Prevotella и кластер Atopobium.
3. Получены новые данные о доминирующих видах бактерий порядка Bifidobacteriales у новорожденных детей при помощи ПЦР в реальном времени. Доминирующими видами в микрофлоре кишечника детей первых месяцев жизни, находящихся на естественном вскармливании, являются B. bifidum, B. longum и B. breve.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследования включены в материалы лекционного курса и практических занятий для студентов 2-3 курсов лечебного и педиатрического факультетов на кафедре микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России.
Штаммы, выделенные в ходе настоящей работы, используются сотрудниками кафедры микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России для изучения биологических свойств бактерий порядка Bifidobacteriales.
Апробация работы
Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на VII Ежегодном Конгрессе специалистов перинатальной медицины «Современная перинатология: организация, технологии и качество» (Москва, 24-25 сентября 2012 г.), на XI Всемирном конгрессе по перинатальной медицине «Глобальные изменения в заботе о здоровье матери и ребенка: применение на практике достижений доказательной медицины для улучшения качества оказываемой помощи» (Москва, 19-22 июня 2013 г.), на VIII Ежегодном Конгрессе специалистов перинатальной медицины «Современная перинатология: организация, технологии, качество» (Москва, 23-24 сентября 2013 г.). Апробация работы проведена на совместной научно-практической конференции кафедры неонатологии ФУВ, кафедры микробиологии и вирусологии ФУВ ГБОУ ВПО РНИМУ Минздрава России (15 ноября 2012 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах, 1 руководство для врачей.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 97 страницах машинописного текста, и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, 4-х глав с изложением результатов собственных наблюдений и их обсуждением, заключение, выводы, практические рекомендации и приложения. Библиография включает 43 источника отечественной, и 148 зарубежной литературы. Работа иллюстрирована 11 таблицами, 23 рисунками и диаграммами.
