Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ .5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
Список сокращений
ГЛАВА I. СУЩЕСТВУЮВДЕ МЕТОДИКИ ОТБОРА ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ СРЕДСТВ
1.1. Методики первичного отбора противоопухолевых препаратов на плотных опухолях ^ ^
1.2. Отбор противоопухолевых веществ в опытах на культуре опухолевых клеток in Vitro ^.-
Исследование активности на неопухолевых объектах л г-
ГЛАВА И. МЕХАНИЗМЫ РАСЩЕПЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ КОМПЛЕКСАМИ, СОДЕРЖАЩИМИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ АНТИБИОТИКИ
2.1. История исследований расщепления нуклеиновых кислот * q
2.2. Расщепление ДНК блеоницином „
2.2.1. Комплексы блеомицина с металлами ««
2.2.2. Комплексы блеомицина с Fe(II) р,-
2.2.3. Предполагаемый механизм образования продуктов расщепления ДНК блеомицином р>,
2.3. Расщепление ДНК 1-10 фенантролином 29
2.3.1. Роль С\1 и Н^ 0^33
2.3.2. Модель присоединения комплекса 1-10 фенантролин--CU+ к ДНК 33
2.3.3. Продукты реакции «,,
2.4. Расщепление ДНК в присутствии других противоопухо левых антибиотиков «о
2.4.1. Метидиупропил-ЭДТА оо
2.4.2. Облучение гелий-неоновым лазером
2.4.3. Адриамицин Стр. 40
2.4.4. Митомицин С лі 42
2.4.5. Неокарциностатин
ГЛАВА 3.. ИССЛЕДОВАНИЕ КОВАЛЕНТНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ БЕЛКОВ С ДНК В ПРИСУТСВИИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ АНТИБИОТИКОВ II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 51
'4.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЯДЕР по
4.1.1. Выделения ядер из эритроцитов кур со
4.1.2. Выделение ядер из клеток асцитной карциномы Эрлиха
4.1.3. Выделения ядер из печени и тимуса телят 60
4.2. ВЫДЕЛЕНИЕ ОСНОВНЫХ БЕЛКОВ ХРОМАТИНА
4.3. ЗАВИСИМОСТЬ СВЯЗЫВАНИЯ ДНК, РНК И БЕЛКОВ ХРОМАТИНА С РАЗЛИЧНЫМ КОЛИЧЕСТВОМ ОКСИАПАТИТА
4.4. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ БЕЛКОВ ХРОМАТИНА НА ОКСИАПАТИТЕ
4.5. КОВАЛЕНТНАЯ СШИВКА.ГИСТ0Н0В С ДНК. ИНДУЦИРОВАННАЯ ПРИ ПОМОЩИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ АНТИБИОТИКОВ IN VITRO И IN VIVO
4.5.1. Общие закономерности сшивки белков с ДНК в . ПРИСУТСТВИИ ПрОТИВООПуХОЛеВЫХ аНТИбИОТИКОВ grj
4.5.2. Сшивка с помощью системы 1,5 ШМ OP/0,15 ГПМ CuSO / : ютмн2о2. 61
4.5.3. Сшивка с помощью системы 100 .М BLM/100 MFe(III)/ ^, .: 62
.4.5.4. Сшивка с помощью системы 2,5 ШМ CU(II)/25 mM AsA/ -1 тмн2°2 63
4.5.5. Сшивка с помощью систем 10 ШМ Fe(H)/l mM Н^О^ и fi~ 10 mM Fe(III)/lmM Нг02 63
4.5.6. Пришивка с помощью гелий-неонового лазера 64
4.6. ВОССТАНОВЛЕНИЕ ПРИШИТОГО КОМПЛЕКСА 65
4.7. ОБОГАЩЕНИЕ И ОЧИСТКА ДНК-БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ 66
4.7.1. Депротеинизация в градиенте плотности CsCl 66
4.7.2. Удаление непришитых белков с помощью цетавлона 67
4.7.3. Удаление непришитой ДНК с помощью экстракции смесью фенол-хлороформ 67
4.8. РАЗДЕЛЕНИЕ СШИТЫХ КОМПЛЕКСОВ С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
4.8.1. Двумерный аналитический электрофорез по Лэммли 69
4.8.2. Электрофорез ДНК в денатурирующих условиях 70
4.8.3. ДНП - электрофорез 71
4.8.4. Белковый электрофорез в присутствии тритона DF-16 71
4.9. ЭЛЕКТРОПЕРЕНОС ФРАГМЕНТОВ ДНК НА МЕМБРАНЫ 72
4.10. БЛОТГИБРИДИЗАЦИЯ СШИТЫХ КОМПЛЕКСОВ С АНТИТЕЛАМИ к BrdU, МЕЧЕННЫМИ 12^ 73
ГЛАВА 5. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
5.1. РАЗРАБОТКА МЕТОДИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 75
5.2. КОВАЛЕНТНОЕ СВЯЗЫВАНИЕ БЕЛКОВ С ДНК С ПОМОЩЬЮ СИСТЕМ. СОДЕРЖАЩИХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ АНТИБИОТИКИ
5.3. ПРИШИВКА БЕЛКОВ К ДНК С ПОМОЩЬЮ СИСТЕМЫ 1-Ю ФЕНАНТРОЛИН/GUSO^ /^( IN VIVO И ДРУГИХ СИСТЕМ 39
5.4. ИССЛЕДОВАНИЕ НАКОПЛЕНИЯ ДНК-БЕЛКОВЫХ СШИВОК ПРИ СТАРЕНИИ С ПОМОЩЬЮ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ ОСНОВНЫХ -БЕЛКОВ ХРОМАТИНА НА ОКСИАПАТИТЕ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА
Введение к работе
Проблема онкологических заболеваний,, несмотря на значительные успехи в области изучения опухолевого процесса, разработки методов профилактики, диагностики и лечения, до настоящего времени является одной из важнейших проблем современной биологии и медицины. В высокоразвитых странах смертность от злокачественных новообразований занимает второе место, после смертности от болезней сердца. Несмотря на значительные успехи в диагностике, профилактике и лечении многих опухолей, количество заболевших людей все время растет. ,
Одним из важнейших путей борьбы с онкологическими заболеваниями является-создание эффективных противоопухолевых средств, так какч не всегда можно достичь желаемого результата с помощью методов хирургического и лекарственного лечения. Лечение с помощью, известных противоопухолевых средств значительно расширило возможности лечения многих опухолевых заболеваний, однако большая часть из І этих средств обладает важными недостатками, к примеру токсичностью, узкостью терапевтического действия, быстрым возникновением устойчивости к ним и др. Несмотря на значительные усилия лабораторий всего мира по изысканию новых высокоэффективных и малотоксичнеых противоопухолевых средств с минимальными недостатками, реальные успехи в создании надежной системы для их отбора оказались значительно ниже ожидаемых. Возможно, это связано с тем, что масштаб эмпирических работ по выяснению противоопухолевой активности различных препаратов в настоящее время намного,превышает объем таких поисков на основе рациональных принципов . Понятно, что эмпирический путь может привести к успеху лишь в случае случайной находки. Поэтому разработка любого разумного предложения, с помощью которого стало бы возможным проводить хотя бы первичый отбор противоопухолевых средств из массы существуеющих является очень важной задачей онкологии, имеющей огромное теоретическое и прикладное значение.
Это и явилось одной из причин, побудивших нас создать новый метод для первичного скрининга таких веществ на одном из рациональных принципов - с помощью изучения ковалентного связывания белков с ДНК на основе противоопухолевых антибиотиков.
При старении организмов также накапливаются подобные ДНК-белковые сшивки. Поэтону нами было показано также,, что более целесообразно проводить скрининг противоопухолевых антибиотиков на молодых тканях, так как возникновение таких сшивок в старости может искажать картину, и вести к возникновению определенных ошибок при скрининге. В связи с этим мы считали важным также исследовать степень ДНК-белкового связывания в процессе старения организмов, а также возможные механизмы такого связывания.
Цель и задачи исследования :
Целью исследования явилась разработка нового метода ковалентного связывания белков с ДНК ІП VitFO и ІП ViVO С помощью радикал-продуцирующих систем на основе противоопухолевых антибиотиков, а также выяснение процесса накопления таких сшивок при старении с целью созщдания нового эффективного метода, позволяющего первично проводить скрининг новых противоопухолевых антибиотиков. Задачами исследования явились :
1. Разработка новых методов ковалентного связывания белков с ДНК in Vitro и ІП ViVo при анаэробных и аэробных условиях с . помощью радикал-продуцирующих систем на основе противоопухолевых антибиотиков таких, как блеомицин, 1-10 фенантролин, .неокарциностатин и др. для первичного скрининга эффективных противоопухолевых средств. 2. Исследование расщепления ДНК и белков вследствие подобных сшивок и установление их молекулярного механизма. 3.: Применение разработанного метода для выяснения новых ..противоопухолевых антибиотиков среди веществ, обуславливающих ДНК-белковые сшивки а также исследование взаимодействия гистонов на ДНК ІП ViVO после репликации ДНК. • - 4. Исследование накопления ДНК-белковых сшивок в печени коров при старении и сравнение их количество с таковыми у молодых животных.
Научная новизна результатов исследования :
Впервые доказана возможность получения ДНК-белковой сшивки ІП Vitro и ІП ViVO с помощью.радикал-продуцирующих систем на основе противоопухолевых антибиотиков и показана возможность первичного отбора эффективных противоопухолевых средств с помощью этого метода на клетках асцитной карциномы Эрлиха, хроматине эритроцитов кур, и дрозофилы. Установлено слабое расщепление ДНК при таких - сшивках, и нерасщепление белков. Показано наличие гистона HI в течении 3-х минут после начала ее репликации. Методами электрофореза получены новые данные, показывающие накопление сшивок белков с ДНК при старении организмов. Теоретическое и практическое значение работы:
В работе впервые разработаны новые методы связывания белков с ДНК ІП Vitro и iV ViVO с помощью радикал-продуцирующих систем на основе противоопухолевых антибиотиков и показана возможность с помощью этого метода создания надежной системы для отбора противоопухолевых средств. При этом отмечается, что такие системы способны слабо расщеплять ДНК, и не работают в присутствии гасителей гидроксильных радикалов. Механизмы такого взаимодействия скорее всего объясняются образованием оснований Шиффа. Это доказывается тем, что можно достичь расшивки при слабо-кислой обработке сшитого ДНК-белкового комплекса при рН 3.0. Разработанные методы позволили изучить более глубоко взаимодействие гистонов с ДНК. ДНК клеток асцитной карциномы Эрлиха уже ассоциирована с гистоном НІ уже через 3 минуты после начала ее репликации. При старении также накапливаются подобные ДНК-белковые сшивки, поэтому более целесообразно проводить . скрининг противоопухолевых антибиотиков на молодых тканях.
Имеющиеся результаты вносят вклад . в систему представлений о ковалентних взаимодействиях белков с ДНК при старении, конкурирующих со сшивками с помощью противоопухолевых средств, и могут являться основой для создания экспериментальных подходов к поиску новых противоопухолевых антибиотиков на молодых тканях. . .. Полученные данные способствуют более полному пониманию ДНК-белковых взаимодействий, как в молодых, так и в старых тканях.
}
Основные положения, выносящиеся на защиту :
1. Радикал-продуцирующие системы на основе противоопухолевых антибиотиков способны вызывать ковалентное связывание белков с ДНК ІП Vitro и ІП ViVO.
2. Разработанный метод связывания может быть использован для первичного отбора эффективных противоопухолевых антибиотиков.
3. При связывании с помощью противоопухолевых антибиотиков не происходит деградации или модификации белков хроматина, однако происходит незначительное расщепление ДНК. Такое связывание лучше проходит в безкислородной среде.
4. Гистон HI присутствует на ДНК клеток асцитной карциномы Эрлиха уже через 3 минуты после начала ее репликации..
5. При старении происходит некоторое увеличение содержания гистона HI, однако не происходит качественных изменений гистонов нуклеосомного кора.
