Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 11
1.1. Биологические особенности собаки 11
1.2. Морфогенез множественной молочной железы хищных, всеядных животных и грызунов 13
1.2.1. Пренатальный период развития 13
1.2.2. Морфофункциональная характеристика молочной железы постнатального периода 15
1.2.2.1. Морфология молочной железы хищных, всеядных животных и грызунов в пре- и пубертатном периодах 15
1.2.2.2. Внутриорганная васкуляризация молочной железы 22
1.2.2.3. Роль нейрогормональной регуляции в морфогенезе молочной железы 24
1.2.2.4. Гистогенез молочной железы при смене физиологических состояний 27
1.2.2.5. Метаболическая активность тканей молочной железы в период функциональной нагрузки 33
1.2.2.6. Постлактационная и возрастная инволюция молочной железы 35
2. Результаты собственных исследований 39
2.1. Материалы и методы исследования 39
2.1.1. Анатомические исследования 42
2.1.2. Цито- и гистологические исследования 43
2.2. Молочная железа собаки в пренатальном периоде онтогенеза 47
2.3. Морфология молочной железы собаки в постнатальном периоде онтогенеза 52
2.3.1. Абсолютный и относительный рост массы молочной железы собаки 54
2.3.2. Интраорганная васкуляризация молочной железы собаки 58
2.4. Гистогенез молочной железы собаки в постнатальном периоде 61
2.4.1. Гистогенез молочной железы щенков в период молочного вскармливания 62
2.4.2. Динамика клеточных и тканевых структур молочной железы щенков в период полового созревания 77
2.4.3. Динамика клеточных и тканевых структур молочной железы впериодс 12 до 24 месяцев 90
2.4.4. Возрастная динамика и морфологические корреляты метаболической активности структур молочной железы собаки в постнатальном онтогенезе 99
2.5. Гистогенез структур альвеолярного отдела молочной железы собаки при смене физиологического состояния 106
2.5.1. Цитология и гистология структур молочной железы месячных сук в первую, во вторую половину беременности, в период лактации и инволюции 106
2.5.2. Динамика морфометрических показателей структур молочной железы собаки при смене физиологического состояния 125
2.5.3. Динамика и морфологические корреляты метаболической активности структур молочной железы собаки при смене физиологических состояний 137
Обсуждение 144
Выводы 172
Рекомендации к использованию научных положений 176
Список литературы
- Морфогенез множественной молочной железы хищных, всеядных животных и грызунов
- Морфология молочной железы хищных, всеядных животных и грызунов в пре- и пубертатном периодах
- Молочная железа собаки в пренатальном периоде онтогенеза
- Динамика клеточных и тканевых структур молочной железы впериодс 12 до 24 месяцев
Введение к работе
Актуальность проблемы. Молочная железа собаки является уникальным органом, продуцирующим молоко - естественную пищу, наиболее полно удовлетворяющую потребность новорожденных щенков в материале для постройки тела и покрытия расходов энергии, связанных с жизненными функциями. Поэтому раскрытие закономерностей структурной организации молочной железы собаки как сложной мультикомпонентной органоспецифической системы, в возрастной динамике, анализ адаптационных её перестроек является актуальной проблемой фундаментальной и прикладной биологии. У породистых собак в процессе многолетней селекции, а у беспородных - в результате прогрессирующей урбанизации городов, «сближения жизненных пространств» собаки и человека, глобального изменения климата и ухудшения экологической ситуации - лактационная функция эволюционировала, параллельно видоизменялась макро- и микроструктура органа. В работах И.Д. Рихтера (1939); Г.Г. Тинякова (1956); М.Г. Закса (1964); Н.М. Плужник (1964); Ю.Т. Техвера (1968); В.П. Чумакова (1975); З.П. Андреевой, Г.Н. Тарнавич, Р.Е. Овчинниковой и др. (1976); Р.Е. Овчинниковой (1975,1977); Л.В. Курбатовой (1975); СЕ. Хохлова (1981); С.Г. Сайко (1988,1990); Л.И. Дроздовой (1997); А.Ф. Колчиной (1997); Л.Л. Абрамовой (1998, 2000), R.I. Jr. Garver, D. М. Radford, Н. Donis-Keller, at all. (1994); P.J. Selman, E. van Garderen, J.A. Мої, T.S. van den Ingh (1995); A. P. Brown, R.L. Morrissey, J. Crowell at all. (1999) и многих других отечественных и зарубежных авторов освещены некоторые аспекты морфологии молочной железы хищных и других многоплодных животных, включая, как общебиологические, так и специфические для собак.
Тем не менее прогресс биологической науки и потребности ветеринарной практики, в том числе в связи с увеличением числа оперативных вмешательств по поводу онкологических заболеваний молочной железы у собак, ставят перед исследователями новые вопросы, на которые можно ответить только при более глубоком изучении структурных компонентов железы и их взаимодействия, в том числе на субмикроскопическом уровне с использованием современных методов исследования.
До сего времени нет полного представления о гистофизиологии молочной железы собаки на всех последовательных этапах онтогенеза и особенно в периоды, имеющие критическое значение для последующей лактации.
Существенное значение здесь имеет исследование структуры маммогематического барьера, в значительной степени определяющейся строением и функциональным состоянием органа, претерпевающим изменения под циклическим воздействием гормонов.
Диссертационная тема является самостоятельным разделом плана научно-исследовательской работы кафедры анатомии, патанатомии и гистологии факультета ветеринарной медицины и биотехнологии при ФГОУ ВПО «Оренбургский ГАУ».
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состоит в изучении особенностей морфологии, в раскрытии закономерностей роста, развития, динамики морфологических коррелятов метаболической активности структур молочной железы собаки на разных этапах онтогенеза. Для реализации данной цели поставлены следующие задачи:
1. определить сроки закладки молочной железы у плодов собак, изучить основные этапы её развития в утробном периоде онтогенеза, составить периодизацию развития органа;
2. изучить макроархитектонику артерий и вен, обеспечивающих васкуляризацию молочной железы, динамику абсолютного и относительного роста массы молочных холмов, выявить степень их корреляции с массой животного в связи с возрастом и в периоды беременности и лактации у собак;
3. выявить гистотипические потенции мио- и эпителиоцитов
альвеолярного отдела, основных структурных элементов паренхиматозно-стромального компонента и сосудов ГМЦР, а также степень их корреляции в постнатальном периоде морфогенеза;
4. дать оценку метаболической и адаптационной пластичности структурных элементов молочной железы собаки в критические периоды онтогенеза и при смене физиологических состояний (половозрелость, беременность, лактация, постлактационная инволюция) на фоне динамики концентрации в сыворотке крови сук лютеинизирующего (ЛГ), фолликулостимулирующего (ФСГ) гормонов, пролактина и прогестерона.
Научная новизна и ценность полученных результатов заключается в том, что:
• Впервые проведено комплексное морфологическое исследование молочной железы собаки, позволившее получить новые данные об особенностях морфогенетических этапов её формирования, роста и развития, выявить ряд новых закономерностей в структурно-функциональной дифференциации тканей.
• Вновь уточнены сроки и источники закладки структурных элементов молочной железы собаки и особенности их поэтапного формирования в пренатальном периоде онтогенеза. Разработана периодизация морфогенеза молочной железы собаки.
• Представлены новые сведения о динамике абсолютного и относительного роста массы органа и их взаимоотношениях в динамике возраста и функции, макроархитектонике артерий и вен молочной железы собаки.
• Получены новые данные по этапам постнатального гистогенеза молочной железы собаки и возрастной динамике ее тканевых компонентов, выявлены морфологические корреляты метаболической активности ее структур. • Впервые представлен морфофункциональный анализ адаптационной пластичности элементов молочной железы собаки как мультикомпонентной системы при различных функциональных состояниях животных на фоне динамики концентрации в крови лютеинизирующего гормона (ЛГ), фолликулостимулирующего (ФСГ) гормона, пролактина и прогестерона . Теоретическая и практическая значимость работы. Выявленные закономерности структурно-функциональной организации молочной железы беспородных собак в возрастной динамике, анализ адаптационных перестроек её как мультикомпонентной системы расширяют, обобщают и дополняют отдельные положения теории индивидуального развития систем органов и организма в целом и открывают новые перспективы применения их на практике.
Некоторые положения диссертации относятся к фундаментальным и представляют интерес для сравнительной, функциональной и клинической морфологии, акушерства и гинекологии. Они могут быть использованы в учебном процессе на ветеринарных, зооинженерных и других биологических факультетах, на курсах повышения квалификации, а также при написании учебников, учебных пособий и монографий. Кроме того, материалы диссертации предназначены для научных сотрудников НИИ, занимающихся проблемами экспериментальной и функциональной морфологии желёз. Положения, выносимые на защиту:
1. Сроки закладки эпителиального зачатка молочной железы, источники и последовательность формирования соска, молочных ходов, долевых протоков. Периодизация развития молочной железы собаки.
2. Абсолютный и относительный рост массы органа и молочных холмов, динамика степени их корреляции на разных этапах онтогенеза и в связи со сменой функционального состояния. Архитектоника артерий и вен, обеспечивающих васкуляризацию молочной железы собаки.
3. Закономерности морфофункциональной дифференциации клеток и тканей молочной железы собаки в постнатальном онтогенезе в связи с возрастом и сменой функционального состояния.
4. Возрастные и функциональные изменения микроструктур молочной железы собаки на фоне динамики концентрации в крови пролактина, прогестерона, лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов и их детерминированные органо- и гистотипические свойства.
Реализация результатов исследований. Внедрение материалов диссертационной работы в учебный процесс осуществлялось в форме выпуска информационных листков, карт обратной связи, а именно:
• в научных и учебных целях на кафедрах анатомии Московской государственной Академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К. И. Скрябина; Санкт-Петербургской, Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Э.Баумана; Хакасского, Бурятского государственных университетов; Омского, Красноярского, Оренбургского, Ставропольского, Дальневосточного, Кубанского, Алтайского государственных аграрных университетов; Брянской, Самарской, Смоленской, Уральской, Ульяновской, Нижегородской, Белгородской, Рязанской государственных сельскохозяйственных академий.
Апробация работы. Основные материалы НИР доложены, обсуждены и одобрены на: научно-теоретических конференциях профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов Оренбургского государственного аграрного университета (Оренбург, 2002, 2003, 2004 гг.); на научно-практических конференциях преподавателей Оренбургского государственного педагогического университета (Оренбург, 2001, 2002, 2003, 2004 гг.); на международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и биологии» (Оренбург, 2003 г.); на Всероссийской научной конференции «Реактивность и пластичность гистологических структур в нормальных, экспериментальных и патологических условиях», посвященной памяти члена - корреспондента АМН СССР Ф. М. Лазаренко (Оренбург, 2003 г.); на VII Конгрессе Международной Ассоциации морфологов (Казань, 2004 г.); на расширенном заседании кафедры анатомии, патанатомии и гистологии факультета ветеринарной медицины и биотехнологии ФГОУ ВПО Оренбургского ГАУ (Оренбург, 2004 г.).
Публикации, Основные научные положения, выводы и разработки диссертации изложены в 9 научных работах, две из которых опубликованы в центральном научном журнале «Морфология», семь — в материалах российских и международных конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 196 страницах компьютерного набора и состоит из оглавления, перечня условных обозначений, введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, научных и практических рекомендаций и списка использованной литературы. Список использованной литературы включает 307 наименований работ, из них 118 зарубежных авторов. Материалы диссертации иллюстрированы 52 макро- и микрофотографиями с объектов, 16 графиками, 45 таблицами и одной схемой.
Морфогенез множественной молочной железы хищных, всеядных животных и грызунов
По данным С.Г. Сайко (1988); F. Kukla (1974); Р.Е. Овчинниковой (1975 ); Н.М. Плужник (1964); A. Iokogama et al. (1980); Л.В. Курбатовой, В.М. Курбатовой (1988), у разных представителей млекопитающих: норок, песцов, лис, кошек, свиней, крыс, землероек, ежей, кротов, белок, кроликов и др.-закладка и формирование эпителиального элемента молочной железы в общих чертах происходят одинаково.
У норок молочная железа представлена одной парой паховых и двумя-четырьмя парами брюшных холмов (Сайко С.Г., 1988). Количество сосков может быть как четным, так и нечетным.
У свиней во внутриутробном периоде каждый молочный холм развивается преимущественно из двух эпителиальных зачатков (Овчинникова Р.Е., 1975).
У крольчих число сосков сильно варьирует в зависимости от породы (Курбатова Л.В., 1975; Курбатова Л.В., Курбатова В.М., 1988). Их обычно бывает четыре-пять пар, иногда до шести, реже три пары. Первая пара сосков грудная, а остальные относятся к брюшным. Соски короткие, цилиндрической формы с округлой верхушкой, скрыты в густом пуху. У лактирующих крольчих молочные холмы хорошо различимы, а в остальное время они сильно уменьшены в размерах, и об их количестве можно судить только по соскам. На каждом соске открывается от 2 до 14 молочных ходов (Грачев И.И., Алексеев Н.П., 1980).
Закладка молочной железы у всех многоплодных животных начинается с формирования млечных линий, располагающихся параллельно друг другу по бокам брюшной стенки зародыша. Лежащая под эпителием мезенхима имеет синцитиальный вид (Тиняков Г. Г., 1957; Cowie А.Т.,1974).
В мезенхиме происходит формирование мелких кровяных островков, появляются первые кровеносные сосуды (Чумаков В. П., 1973). G. Mayer, М. Klein (1961), N. К. Wessels (1967), С. Е. Левин (1974), И. Я. Шихов (1974), Т. Sakakura, J. Nishizuki, С. Dowe (1976) считают, что в регуляции развития эпителиального зачатка молочной железы важную роль играет подлежащая мезенхима.
Среди клеток мезенхимы появляются тонкие нервные волокна, идущие к эпителиальному зачатку молочной железы (Пучковская Н. А., 1960; Грачев И. И., Алексеев Н. П., 1980). В процессе пренатального онтогенеза по мере формирования сосудистой системы у плодов Б. П. Шевченко (1982, 1999) отмечал преобладающий рост артерий над венами. В результате этого в участках тела плода остаётся определённое количество транссудата, создающего внутреннюю среду и «поле» для роста ткани.
В. П. Чумаков, Г. Г. Тиняков (1975), Р. Е. Овчинникова (1977), Л.Л. Абрамова (1999), G. Ailhand, Е. Amri, R. Barbaras (1985) отмечают, что в становлении соединительнотканной основы и жировой ткани железы большую роль играют малодифференцированные клетки мезенхимы, впоследствии превращающиеся в ретикулоциты и адвентициальные клетки. Незрелые
жировые клетки обладают короткоотростчатой формой и содержат в цитоплазме довольно крупные жировые гранулы и гликоген, ядро расположено в центре клетки. Л. Н. Коршунова (1977) отмечает, что у двухмесячных плодов-самцов закладка жировых островков в это время отсутствует.
Таким образом, закладка молочной железы у свиней, крольчих, норок и других многоплодных животных происходит в конце эмбрионального периода, в последующем осуществляется формирование синуса и крупных сосковых и долевых протоков выводной системы. Одновременно в зачатке молочной железы развивается внутриорганное сосудистое русло и элементы автономной нервной системы.
По данным С.Г. Сайко (1988), у норок после рождения отмечается активное ветвление и погружение молочных протоков в виде эпителиальных тяжей в подлежащую рыхлую соединительную ткань. Молочные протоки в основном ветвятся по магистральному типу. Боковые протоки часто погружаются в более глубокие соединительные слои, в результате чего протоковая система железы имеет многоярусное строение.
У свиней в постнатальный период наблюдается активный рост и развитие протоковой системы молочной железы. В два месяца у самок по ходу основных молочных протоков отмечается формирование первых молочных долек (Овчинникова Р.Е., 1975).
У новорожденных крольчих молочная железа имеет форму эпителиального выроста, выстланного плоским эпителием с четырьмя-пятью ответвлениями (Курбатова Л.В., Курбатова В.М.,1988). У двухмесячных крольчих на месте эпителиального выроста начинает формироваться сосок, а молочная железа представлена молочными протоками с альвеолоподобными образованиями на их концах. Размеры и количество протоков молочной железы увеличивается с возрастом. У половозрелых крольчих орган приобретает форму стелющейся тонким слоем железы.
Молочная железа собак - множественная. В каждом из пяти пар молочных холмов гистологически различают соединительнотканную строму и железистую ткань - паренхиму. Под кожей каждого молочного холма находится соединительнотканная фасция, состоящая из плотно прилегающих друг к другу коллагеновых волокон и небольшого количества эластических. Поверхностная фасция без резких границ переходит в глубокую, формирующую многочисленные перегородки, которые делят паренхиму на дольки (Плужник Н.М., 1964; Беляева В. Д., Иванова В. И., 1988).
Паренхима железы представлена большим количеством секреторных долек (Студенцов А. П., 1952; Морозов М., 1954; Михайлюк П. М., 1972). Первичной долькой молочной железы принято считать группу альвеол с межальвеолярными протоками, которые открываются в общий внутридольковый проток (Грачев И. И., 1953 ; Бунак В. В., 1965 ; Елисеев А. П., 1971 ; Курбатова Л. В. 1975 ; Хрусталева Г. И., Треус М. Ю., 1982 ; Мамедова Н. О., 1985 ; Чекиров Г. С, Скопичев В. Г., 1988).
Морфология молочной железы хищных, всеядных животных и грызунов в пре- и пубертатном периодах
В. П. Чумаков (1973); Graham J.C., Myers R. К. (1999) отмечают, что с момента формирования железистых долек начинается дифференцировка терминального сосудистого русла. Приносящие артериолы древовидно ветвятся до прекапилляров, а те, в свою очередь, до капилляров. Последние без границ переходят в посткапиллярные, а далее в собирательные и мышечные венулы. С помощью световой микроскопии был определен следующий схематический план строения кровеносных капилляров. Капилляр диаметром 2-7 мкм принимается за артериальный, а в 7-12 мкм - за венозный. В. А. Шахламов (1971) обращает внимание на то, что ядра эндотелиальных клеток венозного отдела ориентируются преимущественно поперек длинной оси сосуда; ядра клеток в артериальном отделе - вдоль.
От артериол вглубь дольки отходят капиллярные петли, которые огибают каждую отдельную альвеолу (Скопичев В. Г., Гайдуков С. Н., 1990; Гуляева О. Г., Дроздова Л. И., Тулакина Л. Г., 1998). Размеры и формы капиллярных петель вариабельны и зависят, в первую очередь, от полового созревания и физиологического состояния железы. В стадии покоя последней кровеносные сосуды подходят только к главным её протокам (Архангельская Т. Н., 1986; Волченко Н.Н., Завалишина Л.Э., Петров А.Н. и др., 1999). Основная функция капиллярного русла — обменные процессы. Термин «функциональный капилляр» наиболее применим к капиллярам диаметром от 2 до 12-14 мкм (Червова И. А., Караганов Я. Л., 1973; Куприянов В. В., Караганов Я. Л., Козлов В. И., 1975; Шошенко К. А., Голубь А. С, Брод В. И., 1982; Скопичев В. Г., Гайдуков С. Н., 1990). В период установившейся секреторной деятельности протяженность капиллярного русла многократно увеличивается (Vao W, CaruoloE.V., 1973).
По данным Е. Н. Никифоровой (1967), в молочной железе крыс капилляры на всем протяжении связаны поперечными анастомозами. Электронно-микроскопическими исследованиями установлено, что уплощенные эндотелиальные клетки гемокапилляров формируют монослой, их высота в местах расположения ядра не превышает 3-4,5 мкм, длина эндотелиоцитов 25-30 мкм, ширина 8-10 мкм (Караганов Я. И., Миронов А. А., Миронов В. А., 1986). И. К. Медведев, Г. Г. Черепанов, Г. И. Хрусталёва (2000) отмечают, что между эндотелиальными клетками кровеносных капилляров отдельных паренхиматозных органов имеются щелевидные пространства диаметром 3-15 нм.
По мнению И. И. Грачева, С. М. Попова, В. Г. Скопичева (1976), R. М. Marks, W. R. Roche, М. Czrniecri et al. (1986), ультраструктура базальной мембраны гемокапилляров не отличается постоянством, и до сих пор не ясен механизм ее избирательной проницаемости. По В. А. Шахламову (1971), рабочая поверхность эндотелиоцита, обращенная в просвет капилляра, имеет микроворсинки, очевидно, способные притормаживать ток крови, обеспечивая более полный обмен кислорода, веществ-предшественников секрета и т. д. В конце лактационного периода капиллярное звено уменьшается более чем в два раза (Хрусталёва Г. И., 1980).
К. А. Шошенко (1975) отмечала, что в тесном соприкосновении с эндотелиальными клетками находятся перициты, имеющие сходство как с эндотелиоцитом, так и с миоцитом. Нервные терминали часто оканчиваются на поверхности тела или в углублениях поверхностной мембраны перицитов. В. А. Шахламов (1971) и В. П. Чумаков (1973) предполагают, что регуляция деятельности мелких сосудов обеспечивается при их посредничестве.
На ранних стадиях развития дифференцировка молочных желёз протекает без участия гормонов, а на более поздних стадиях эмбриогенеза она уже регулируется ими, как отмечают К. Остин, Р. Шорт (1987), В. И. Георгиевский, И. К. Медведев, В. Н. Булачёв и др. (1988), Т. Oka, М. Yoshima, S. Lavandero (1991). К концу утробного развития молочная железа плода (самки) приобретает способность отвечать на гормоны, перешедшие из материнской крови через плацентарный барьер в кровь плода, о чём свидетельствует появление провизорной секреции, продолжающейся до трех недель (Шманенкова Н. А., 1978).
Впервые представление о нейрогормональной регуляции лактации было сформулировано И. П. Павловым в 1894 году. В настоящее время нейрогормональная теория регуляции развития и функциональной деятельности молочной железы ни у кого не вызывает сомнения (Угрюмов М. В., 1989; Акмаев И, Г., 1992; Абельсон Ю. О., 1994; Поленов А. Л., Константинова М. С, Гарлов П. Е., 1994; Стадников А. А., Поленов А. Л., 1997; Стадников А. А., 1999).
Механизм регуляции развития молочной железы в онтогенезе до сих пор остается мало изученным. А. Е. Конкабаева (1982); С. Н. Савченко, Г. К. Рыжова, Г. С. Степанов и др. (1987); Чумаченко П. А., Хмельницкий O.K., Шлыков И. П. (1987); R. Buttyan, Z. Zaheri, R. Lockshin et al. (1988); T. B. Mc Fadden, T. E. Daniel, R. M. Akers (1990); I. Politis, E. Bloock, J. D. Turner (1990) считают, что развитие молочной железы в постнатальном периоде контролируется гормонами, секретируемыми передней долей гипофиза (пролактин), щитовидной железы (тироксин), надпочечников (адреналин), а с момента наступления половой зрелости самки — эстрогеном и прогестероном яичников. Если эстроген активизирует рост протоков, то прогестерон -развитие альвеол (Шманенкова Н. А., 1978; Lee С. S., 1979).
Молочная железа собаки в пренатальном периоде онтогенеза
В гистологических исследованиях у плодов безпородных сук использовали весь кожный лоскут с зачатками молочной железы целиком. Материалом для исследования служили гистопробы молочной железы (1 см3) от неполовозрелых самок, половозрелых небеременных самок, а, начиная с 24 месяцев, пробы гистоматериала брали от сук, находящихся в разных функциональных состояниях: небеременные, беременные (в разные сроки) и лактирующие, включая 36-60 месяцев. В каждой возрастной группе постнатальной жизни материал брали не менее чем от трех животных. В целом в опыте использовано 86 животных.
Гистологический материал фиксировали в 10% водном нейтральном формалине. После стандартной гистологической обработки кусочки заливали в целлоидин-парафин. Парафиновые срезы толщиной 5-6 мкм окрашивали с использованием тривиальных методов: гематоксилином Майера - эозином, пикрофуксином по ван Гизон. Сосуды ГМЦР выявляли импрегнацией нитратом серебра по Билыповскому-Грос в модификации Б. И. Лаврентьева (1946) с последующей докраской ядер кармином и по методу Глиса (Glees Р., 1954).
Выявление суммарного содержания ДНК и РНК проводили галлоцианин-хромовыми квасцами по Эйнарсону (Einarson L., 1951) (Лилли Р., 1969), РНК выявляли по Браше. В качестве контроля использовали препараты, предварительно обработанные рибонуклеазой поджелудочной железы (Киссели Д., 1962; Луппа X., 1980). Липиды в тканях молочной железы окрашивали Суданом III по Кею и Уайхэду (Key W., Whitehead R., 1941), с последующей докраской гематоксилином. Для дифференциальной характеристики углеводов использовали следующие методы: PAS-реакцию по Хочкису (Hotchkiss R. D., 1948) в сочетании с энзиматическим контролем (инкубация срезов в растворе амилазы слюны при плюс 37С в течение одного часа по А. И. Кононскому (1974), реакцию с альциановым синим при рН 1,0 и при рН 2,7 по Стидмену (Steedman Н. F., 1950), при этом контрольные срезы подвергали мягкому (4 часа при температуре плюс 37С) и жёсткому метилированию (Lev R., Spiser S. S., 1964).
Идентификация компонентов углеводсодержащих биополимеров проводилась по схеме М. Г. Шубича, Г. М. Могильной (1979). За гликоген принимали PAS-позитивные субстраты, ферментирующиеся амилазой слюны. PAS-позитивный материал устойчивый к амилазе слюны, относили к нейтральным ГП. Углеводсодержащие биополимеры, окраска которых альциановым синим (рН 1,0) исчезала после мягкого метилирования считали сульфатированными или кислыми ГП. После метилирования, PAS-отрицательные альцианофильные вещества дифференцировали путем обработки срезов стрептококковой гиалуронидазой. Если после ферментативной обработки интенсивность окраски веществ не изменялась, их считали - сульфатированными ПГ, а если снижалась или исчезала полностью - их считали гиалуроновой кислотой. Углеводсодержащие биополимеры, интенсивность окраски которых альциановым синим (рН 2,7) снижалась или исчезала после метилирования, считали сиаловыми кислотами, а если не изменялась- сульфатированными ГП.
При проведении гистохимических реакций нами применена следующая методика: на одно предметное стекло наклеивали серию парафин-целлоидиновых срезов образцов ткани железы, взятых от животных разного возраста и функционального состояния и одномоментно, в соответствии с методикой стёкла погружались в растворы.
На втором этапе исследования, на базе Самарского государственного университета, на аппарате ЛЮМАМ-ИЗ с люминесцентной фотометрической насадкой ФМЭЛ-1 проводили цитоспектрофотометрический анализ содержания продукта реакций в тканях молочной железы. Эмпирическим путем для всех проб материала была выбрана длина волны измерения, составившая 580 нм. Оптическая плотность продукта реакций в исследуемых объектах измерялась в условных единицах.
Для изучения архитектоники молочной железы готовили серийные гистологические срезы в проекциях перпендикулярно к коже через сосок и параллельно коже.
Количественную информацию о размерах ядер и самих лактоцитов, миоэпителиоцитов альвеол, диаметре альвеол, межальвеолярных, внутридольковых протоках, наружных диаметрах микрососудов, пучков нервных волокон, а также о соотношении площадей эпителиальных и соединительнотканных компонентов получали в ходе морфометрических исследований при использовании винтового окуляр-микрометра МОВ-1-15 (ГОСТ 15150-69). В отдельном образце ткани измерение каждого показателя осуществлялось не менее чем в 15 полях зрения каждого объекта.
Электронные версии презентативного материала с микроанатомических объектов получали при помощи микроскопа Micros MSD 500 (Австрия) с цифровой видеокамерой, а с макроанатомических объектов с использованием цветного планшетного сканера Mikrotek Scan Maker-3700. Для электронной микроскопии кусочки материала фиксировали в охлажденном 2,5% растворе глютарового альдегида на фосфатном буфере (рН 7,4), с последующей дофиксацией в 1% растворе четырехокиси осмия, приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,4. После общепринятой подготовки в дегидратации материал заключали в смесь эпон - аралдит. На базе лаборатории экспериментальной патологии клетки ГУ НИИ «Морфологии человека» АМН РФ (Москва) с блоков для электронной микроскопии на ультратоме LKB V (Швеция) изготавливали срезы (полутонкие, ультратонкие). Полутонкие срезы окрашивали раствором толуидинового синего. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по Е.С. Рейнольдсу, просматривали в электронном микроскопе JEM - 7А (Япония) при различных увеличениях и изготавливали фотоснимки. В процессе гистостереометрических исследований оценивали размеры и удельную площадь гистологических структур с помощью окулярных вставок: измерительных линеек, контрольных площадей для подсчёта объектов, сеток контрольных точек для работы по исчислению объёма структур (Автандилов Г. Г., 1990).
Динамика клеточных и тканевых структур молочной железы впериодс 12 до 24 месяцев
Митохондрии удлиненной формы, часто изогнутые с электронноплотным матриксом и укороченными кристами. Из-за плотного матрикса контуры крист в большинстве митохондрий едва различимы. Плазмалемма клеток волнообразная, на латеральных участках имеются несложные замковые структуры. Для данного типа клеток характерно отсутствие четкой ориентации и полярности в расположении органелл. Оптическую плотность гиалоплазмы клеток повышают микротрубочки и микрофиламенты, пересекающие тело клетки в разном направлении.
В дольках смешанного типа, где определенная часть площади занята адипоцитами, участки альвеол образованы низкопризматическими альвеолоцитами с ядерно-цитоплазменным отношением 1:1. Ядра клеток полигональной формы с преобладанием гранулярного хроматина. Вблизи ядер концентрируются элементы пластинчатого комплекса, единичные канальцы ЭПР, митохондрии с плотным матриксом, преобладают свободные рибосомы. Плазмалемма клеток волнообразная с небольшими неправильной формы выступами в межклеточное пространство.
В этот период рост молочной железы определяется увеличением объема жировой ткани. По мере дифференциации адипоцитов в гиалоплазме накапливаются липидные глобулы округлой формы. Более крупные глобулы концентрируются в надъядерной зоне, оттесняя ядро к клеточной мембране. Участки гиалоплазмы между глобулами уплотнены, варьируют по объему и содержат свободные рибосомы, мелкие липидные глобулы, а также оптически светлые вакуоли типа пиноцитозных пузырьков.
В утолщенных участках гиалоплазмы адипоцитов располагаются пикнотические ядра, митохондрии с плотным матриксом, разрозненные рибосомы и короткие цепочки ЭПР. Хроматин ядер в основном конденсированной формы, мембраны ядер уплотнены, перинуклеарное пространство сужено и не имеет четких границ.
В основном, завершение становления гистофизиологии молочной железы у собак происходит к 12 месяцам.
При рассмотрении всех показателей гистоструктур молочной железы сук в возрасте 12 месяцев (табл. 23) видно, что величина As была в 70,6% случаев отрицательной и колебалась от -1,69 до 1,85, а уровень Ех в 64,7% случаев был отрицательным и колебался от -2,88 до 3,50. Это свидетельствует о близости показателей гистоструктур к нормальному распределению.
Диаметр альвеол составил 13,05±0,21 мкм, диаметр дольковых протоков -29,58±2,37, то есть больше в 2,27 раза (р 0,05), S железистой дольки составила 2,6±0,21 мм2, диаметр артерий составил 43,63±2,09 мкм, диаметр артериол -24,55+0,67, что меньше в 1,78 раза (р 0,01), диаметр прекапилляров составил 14,63±0,57, то есть в 1,68 раза меньше (р 0,01), диаметр капилляров -6,11 ±0,34 (в 2,39 раза меньше (р 0,05), диаметр посткапиллярных венул -13,45±0,63, что уже в 2,2 раза больше (р 0,01), диаметр собирательных венул - 27,88±1,03 (в 2,07 раза больше (р 0,05) и мышечных венул - 49,63± 1,32 мкм, то есть был уже больше в 1,78 раза (р 0,05), диаметр пучка нервных волокон составил 51,02±2,90 мкм, диаметр цитоплазмы эпителиоцита -5,09±0,21 мкм, диаметр ядра эпителиоцита составил - 3,16±0,23 мкм, то есть в 1,61 раза меньше (р 0,05), объем ядра эпителиоцита - 17,80±2,78 мкм3, диаметр цитоплазмы миоэпителиоцита составил 8,78±1,09 мкм, диаметр ядра миоэпителиоцита - 5,83± 0,75, что в 1,51 раза меньше (р 0,05), объем ядра миоэпителиоцита составил 68,86± 15,04 мкм3.
Показатели вариабельности (Cv %) результатов колебались в пределах от 3,88 до 43,68%, при этом они минимальны для диаметра альвеол, а максимальны - для объема ядра миоэпителиоцита. Коэффициент точности (Cs%) колебался от 1,58 до 21,84%, что говорит о средней точности определения средних величин.
В табл. 24 отражены коэффициенты корреляции между структурами молочной железы собаки в возрасте 12 месяцев.
Установлено, что у сук в возрасте 12 месяцев взаимосвязь между структурами молочной железы находилась в пределах от - 0.87 до + 0.97. Она преимущественно отрицательна (55,4%) и несущественна (88,4%). Максимальная достоверность корреляции с другими структурами характерна для диаметра посткапиллярной венулы и капилляра (97,8 %), она минимальна для диаметра альвеол с диаметром капсулы нервного окончания (0,02%). Наибольший уровень отрицательных связей типичен для диаметра собирательной венулы и артериолы (87,8%), минимальный - для диаметра прекапилляра с диаметром альвеол (0,11 %).
В табл. 25 представлены различия (t-критерий) между гистоструктурами альвеолярного отдела молочной железы собак в постнатальном онтогенезе. Как видно из таблицы, изменения гистоструктур в анализируемый период равномерны и существенны, но наибольшая степень различия (t-критерий) присуща: S дольки, диаметру артерий, посткапиллярных и собирательных венул и диаметру интраорганного нервного ствола. При этом для диаметра альвеол наибольшие изменения отмечаются в период с одного до двух и с шести до девяти месяцев, для диаметра дольковых протоков - с шести до девяти месяцев, для S дольки - с трех до девяти месяцев, для диаметра артерий с двух до трех и с шести до девяти месяцев, для
Различие между гистоструктурами альвеолярного отдела молочной железы собак в постнатальном онтогенезе (t —критерий) диаметра артериол с одного до двух месяцев, для диаметра прекапилляров с трех до девяти месяцев, для диаметра капилляров с 9 до 12 месяцев, для диаметра посткапиллярных венул с трех до девяти месяцев, для диаметра собирательных венул с 6 до 9 месяцев, для диаметра мышечных венул с одного до двух и с трех до шести месяцев и для диаметра интраорганного нервного ствола с 6 до 9 месяцев. В динамике возраста значимые различия гистоструктур составляют 76,4%, в том числе, с одного до шести месяцев - 63,6%, а с 6 до 12 месяцев-95,4%.
