Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8
1.1 История изучения криптобий и систематическое положение 8
1.2 Морфология и физиология криптобий 11
1.3 Жизненный цикл и особенности биологии криптобий 14
1.4 Патогенность криптобий и их эпизоотическое значение (на примере Cryptobia salmositica) 18
1.5 Исследование иммунитета рыб при криптобиозе 22
1.6 Современные способы выявления и идентификации кровепаразитов 25
1.7 Меры борьбы с криптобиозом рыб 27
ГЛАВА 2. Материалы и методы 30
2.1 Место сбора материала и количество обследованных рыб 30
2.2 Биологическая характеристика каспийского лосося и особенности его воспроизводства на Ардонском лососевом рыбоводном заводе 35
2.3 Условия постановки экспериментов 39
2.4 Камеральная обработка собранного материала 41
ГЛАВА 3. Морфологическая характеристика, возрастная и гостальная изменчивость cryptobia salmositica 44
ГЛАВА 4. Особенности эпизоотологии криптобиоза 55
4.1 Течение криптобиоза у каспийского лосося на АЛРЗ 55
4.2 Оценка восприимчивости радужной форели (Oncorhynchus mykiss Walbaum) к С. salmositica 60
4.3 Оценка путей, механизмов и факторов передачи Cryptobia salmositica на Ардонском лососевом рыбоводном заводе (АЛРЗ) 62
ГЛАВА 5. Выявление природного очага криптобиоза в бассейне реки терек 66
ГЛАВА 6. Экспериментальная оценка действия лекарственых средств для борьбы с криптобиозом каспийского лосося 69
Заключение 74
Выводы 80
Практические рекомендации 82
Рекомендации по использованию научных выводов 83
Список литературы 84
Приложение 105
- Морфология и физиология криптобий
- Исследование иммунитета рыб при криптобиозе
- Биологическая характеристика каспийского лосося и особенности его воспроизводства на Ардонском лососевом рыбоводном заводе
- Оценка восприимчивости радужной форели (Oncorhynchus mykiss Walbaum) к С. salmositica
Введение к работе
Актуальность проблемы. Кровяные жгутиконосцы - малоизученная группа паразитических простейших рыб. В медицине и ветеринарии исследования заболеваний, возбудителями которых являются кровепаразиты (трипаносо-мы, лейшмании и др.), проводятся достаточно интенсивно (Дьяконов, 1969; Дьяконов и др., 1985; Крылов, 1994). Они выполнены на современном научно-методическом уровне и, в конечном итоге, направлены на профилактику этих опасных болезней человека и сельскохозяйственных животных (Степанова и др., 1982; Белова, 1984; Дьяконов и др., 1985; Заблоцкий, 1985; Меньшиков, 1999; Крылов, 1994 и др.).
Несравнимо меньше уделяется внимание кровепаразитам рыб. Вместе с тем, они являются весьма патогенными, и многие исследователи приводят конкретные случаи массовых заболеваний различных видов рыб (Никитин, 1929; Залевская-Шаповал, 1954; Хайбулаев, Гусейнов, 1985, Lorn, 1979 и др.).
Только во второй половине прошлого века в связи с выявлением крипто-биоза в Северной Америке у радужной форели (Woo, 1978; Woo, Wehnert, 1986 и др.), дальневосточных лососевых (Becker, Katz, 1965а, 1965b; Becker, 1977; Bower, Margolis, 1984a и др.) и камбаловых рыб (Laird, Bullock, 1969; Becker, Overstreet, 1979 и др.) началось целенаправленное изучение морфологии возбудителей, их жизненных циклов, специфичности, распространения и других вопросов, имеющих фундаментальное и практическое значение (Lorn, 1979; Bower, Woo, 1981; Woo, 1987a; Woo, 1995 и др.).
За рубежом работы последних лет направлены на изучение биохимической структуры криптобий, в частности их нуклеиновых кислот (р-РНК, м-ЗНК, н-ДНК, к-ДНК). На основе этих данных решаются вопросы филогении и эволюции североамериканских видов этих паразитов рыб (Wright et al., 1999; Ardelli et al., 2000; Simpson et al., 2000; Lukes et al., 2002).
В России наиболее полными исследованиями паразитов крови рыб, в том числе и представителей ихтиофауны Каспийского моря, являются работы К.Х. Хайбулаева (1970a; 19706; 1971; 1984; Хайбулаев, Шульман, 1984; Хайбулаев, Гуссейнов, 1985).
Длительный застой в исследованиях кровепаразитов рыб в нашей стране связан с рядом факторов. Главными из них являются методические трудности в получении и взятии материала, то есть крови, у живой, только что пойманной рыбы, а также в слабой разработке критериев морфологической дифференциации. Из последних работ по кровепаразитам рыб выделяются исследования, проведенные на оз. Байкал. Работами Т.Р. Хамнуевой и Н.М. Пронина установлен видовой состав кровепаразитов байкальских рыб, особенности их экологии, гостальной изменчивости и пространственного распространения (Хамнуева 1997; 2000; 2001; Хамнуева, Пронин, 2001; 2003).
Вспышка криптобиоза у каспийского лосося на одном из лососевых ры-боразводных заводов России (Golovin, Golovina, 1993а, 1993b; Головин, 1996) показала необходимость проведения и у нас в стране как фундаментальных, так и прикладных исследований кровяных жгутиконосцев рыб. Были достаточно подробно исследованы вопросы патогенеза возбудителя, его влияния на картину крови, клеточные факторы иммунитета, отработан метод количественного учета паразитов, определены некоторые подходы к решению практических вопросов, связанных с профилактикой заболевания (Golovin, Golovina, 1993b; Golovin, Golovina, 1998; Golovin et al., 1998; Головина, Головин, 2002; Golovina, Golovin, 2001).
С учетом того, что каспийский лосось (Salmo trutta caspius Kessler) является эндемиком ихтиофауны Каспийского моря, и его численность в настоящее время поддерживается за счет искусственного разведения на рыбоводных заводах, возникновение вспышек любых заболеваний отражается на эффективности воспроизводства. В связи с этим, возникла необходимость комплексного исследования криптобиоза - одного из опасных для данного вида рыб заболевания.
Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении морфологической изменчивости возбудителя, эпизоотологических особен ностей возникновения и течения криптобиоза, в разработке эффективных методов борьбы с заболеванием.
В связи с этим решали следующие задачи:
1. изучить возрастную и гостальную изменчивость Cryptobia salmositica - возбудителя криптобиоза каспийского лосося;
2. определить специфичность возбудителя и возрастную восприимчивость к криптобиозу лососевых рыб;
3. выяснить основные пути проникновения возбудителя на Ардонский лососевый рыбоводный завод (АЛРЗ);
4. исследовать туводные виды рыб в бассейне р. Терек и определить наличие природного очага заболевания;
5. усовершенствовать методы борьбы с криптобиозом каспийского лосося в условиях АЛРЗ.
Научная новизна. Впервые в России в бассейне р.Терек выявлен природный очаг криптобиоза, изучена возрастная и гостальная изменчивость возбудителя болезни - С. salmositica. Установлено, что резервуарным хозяином возбудителя в природе является ручьевая форель (Salmo trutta morpha fario Linne). Определяющим фактором заражения каспийского лосося является не возраст, а размерно-физиологическое состояние, характеризующее стадию постсмолта.
Практическая значимость работы. Данные по гостальной и возрастной морфологической изменчивости С. salmositica подтверждают большую вариабельность этих признаков и ставят под сомнение их использование для видовой идентификации криптобий. Впервые определены основные пути проникновения возбудителя на рыбоводный завод. Для разработки комплекса мер борьбы с криптобиозом определен ряд эффективных медикаментозных средств. Предложен способ профилактики заболевания, исключающий попадание возбудителя с водой из водоисточника, что позволяет получать на Ардонском лососевом ры боводном заводе здоровую молодь. Полученные данные могут служить основой для разработки мероприятий по борьбе с криптобиозом рыб. Основные положения, выносимые на защиту.
1. Возрастная и гостальная морфологическая изменчивость С. salmositica как форма существования вида.
2. Эпизоотологические особенности криптобиоза каспийского лосося.
3. Система мероприятий для борьбы с криптобиозом лососевых рыб на рыбоводных заводах.
Апробация работы. Материалы были представлены на конференции Всероссийского гельминтологического общества (Москва, 2003), Памятных научных чтениях, посвященных 85-летию проф. В.А. Мусселиус-Богоявленской (Московская обл., п. Рыбное, 2003 г.), Международной конференции, посвященной 125-летию К.И. Скрябина и 60-летию основания Лаборатории гельминтологии АН СССР - Института паразитологии РАН (Москва, 2004 г.), коллоквиумах лаборатории ихтиопатологии ФГУП ВНИИПРХ и ежегодных отчетах аспирантов ФГОУ ВПО МГАВМиБ.
Публикации. По материалам исследований опубликовано 4 статьи и 2 сданы в печать. В них изложены основные положения работы.
Благодарности. Выражаю искреннюю благодарность моим научным руководителям — докт. биол. наук, профессору Головиной Нине Александровне и Заслуженному деятелю науки РФ, докт. вет. наук, профессору Акбаеву Магомету Шогаибовичу за внимание к данной работе. Особую признательность выражаю канд. биол. наук, зав. лабораторией ихтиопатологии ФГУП ВНИИПРХ Головину Павлу Петровичу за возможность использования коллекционных материалов, организацию и проведение полевых исследований, подробные консультации при анализе полученных данных. Благодарю сотрудников лаборатории ихтиопатологии ФГУП ВНИИПРХ и кафедры паразитологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ, специалистов Запкаспрыбвода и АЛРЗ за практическую помощь и моральную поддержку при выполнении данной работы.
Морфология и физиология криптобий
Большинство видов гематозойных криптобий рыб под световым микроскопом имеют удлиненное тело (от овальной формы, как у С. catostomi, до длинной лентообразной, как у С. beckeri) с округлым передним и более острым задним концом. Два жгутика находятся на переднем конце; передний жгутик свободен, в то время как второй жгутик прилегает к телу свободно, не касаясь его. Выступающий кинетопласт, от овальной до удлиненной формы, находится впереди или сбоку от круглого ядра (Woo, Poynton, 1995). Для морфологической характеристики паразита было принято определять такие его признаки, как ширина и длина тела, длина и ширина кинетопласта, длина жгутиков, отношение длины переднего и заднего жгутиков к длине тела (Katz, 1951). К.Х. Хайбулаев и С.С. Шульман (1984) впервые составили политомическую таблицу для определения кровепаразитов, включив в нее и такие признаки, как размеры ядра, расстояние от кинетопласта до переднего и заднегХардацеригагика ультраструктуры С. salmositica приводится в ряде публикаций (Vickerman, 1971; Brugerolle et al., 1979; Paterson, Woo, 1983; Nochynkova, 1984). Авторы показывают, что ультраструктура паразита, в основном типична для представителей рода.
Сканирующая электронная микроскопия показала, что С salmositica име-ет цитостому и два жгутика, отходящие от жгутикового кармашка (Paterson, Woo, 1983). Противоположный жгутик прилегает к поверхности тела, и когда он движется (трепещет), то вырисовывает тонкую пленку-пелликулу, создавая впечатление наличия волнообразной мембраны.
С. Бовер и П. By (Bower, Woo, 1977а) после тщательного прикладногоизучения С. catostomi, а также литературных данных по морфологии кровепара-зита пришли к выводу, что многие из морфометрических признаков, в том числе ее размеры, длина жгутиков, цитоплазматические органеллы, не достаточно информативны для идентификации видов. Оказалось, что размеры паразитов непатогенного культивированного штамма С. salmositica меньше вирулентных криптобий (Woo, Thomas, 1991). Вирулентными для рыб являются закругленные тонкие эктопаразитарные формы паразита (Woo, Wehnert, 1983). Поскольку многие виды криптобий (в том числе С. salmositica, С. bullocki) не специфичны к определенному хозяину, высказана необходимость проведения специальных исследований по влиянию хозяина на морфологические признаки жгутиконосцев.
Из литературы известна подобная проблема при идентификации трипаносом. Морфология и морфометрические признаки многих видов трипаносом считаются недостаточными для идентификации вида. Некоторые трипаносомы амфибий (Woo, Bogart, 1984, 1986), птиц (Woo, Barlett, 1982) и млекопитающих (Woo et al., 1980) предложено идентифицировать временно, пока не будут выяснены другие, в том числе биологические свойства паразитов. В ряде экспериментальных исследований (Woo, Black, 1984) было показано, что рыба-хозяин изменяет морфометрические признаки Trypanosoma danilewshyi.
П. By и Г. Блэк (Woo, Black, 1984) рекомендовали включить биологические признаки (в том числе результаты опытов по экспериментальному перекрестному заражению) в описание видов кровепаразитов, так как существуют морфологически сходные кровепаразиты, которые физиологически являются разными видами. При одинаковых условиях проведения эксперимента можно было бы установить различия с помощью перекрестного заражения паразитом (Bower, Woo, 1981), а также по различию антигенов (Bower, Woo, 1982), профилю полипептидов (Taylor et al., 1982), плавучей плотности ядра и дезоксири-бонуклеиновой кислоты (ДНК) кинетопласта (Woo et al., 1985).
Таким образом, в изучении кровепаразитов рода Cryptobia в настоящеевремя не рекомендуется руководствоваться только принципом сходства, так как могут встречаться физиологически отдаленные виды, выделенные при тщательных исследованиях в перекрестной передаче паразита, но имеющие мор-фометрическое сходство, а также виды, морфология и морфологические признаки которых изменены хозяином.
Результаты изучения особенностей физиологии криптобий, и в частности митохондриального дыхания и гликолиза, отражены в ряде публикаций (Opperdoes, Borst, 1977; Opperdoes, 1988; Li, Woo, 1991a; Thomas et al., 1992; Opperdoes, 1995; Ardelli, Woo, 1993; Ardelli et al., 2000).
Было установлено свойство паразита снижать свою активность и интенсивность потребления кислорода при длительном нахождении в растворе ацетата натрия, который обычно убивает аэробные организмы при экспозиции в одну минуту. При этом криптобий не погибают (Thomas et al., 1992). Авторы высказывают предположение, что паразит выживает в подобных условиях благодаря возможности перехода с аэробного (митохондриального) дыхания на анаэробный гликолиз (Ardelli et al., 2000). Этот переход возможен отчасти благодаря обособленности процесса гликолиза в отдельной органелле — гликосоме. Изменение характера дыхания криптобий может встречаться в пиявках-переносчиках (в условиях гипоксии) или после воздействия некоторых химио-терапевтических препаратов, повреждающих митохондрии паразитарной клетки (Ardelli, Woo, 1993).
Было показано, что гликосома является специфической органеллой представителей отряда Kinetoplastida. Она окружена мембраной и содержит семь гликолитических энзимов, которые у других одноклеточных организмов растворены в цитоплазме (Opperdoes, Borst, 1977). Гликосомы могут также содержать ферменты перекисного метаболизма (Opperdoes, 1988). Это предполагает чрезвычайно высокую активность происходящего в одной органелле гликолиза, что особенно характерно для кровепаразитов (Opperdoes, 1995).
Исследование иммунитета рыб при криптобиозе
Рыбы имеют хорошо развитую иммунную систему (Woo, Jones, 1989). Установлено, что криптобии приводят к угнетению иммунной системы рыб (Jones et al., 1986; Sin, Woo, 1993) и снижению активности гемолизина (Thomas, Woo, 1989). Анорексия также приводит к иммунодепрессии (Thomas, Woo, 1992). Несколько исследований показали, что свежая плазма крови рыб, извест ных как резистентных или не проявляющих смертности при заражении С. sal mositica, обладала выраженной литической активностью (Bower, Woo, 1977b; Wehnert, Woo, 1980; Bower, Evelyn, 1988). По данным А. Эллиса и других авто ров, механизм иммунного ответа (направленного против С. salmositica), прояв ляющийся в резистентности популяции кижуча (О. kisutch), в настоящее время не выяснен, и, вероятно, в большей степени определяется клеточным ответом (Ellis, 1977; McKinney et al., 1977) или иными реакциями (Ingram, 1980; Fletcher, 1981). Различия в резистентности могут быть связаны с эволюцией лососей, в которой отражена возможность контакта данного вида рыб с возбудителем (Bower, Evelyn, 1988; Bower, Margolis, 1984c). Многие криптобии считаются не специфичными к хозяину. С. Венерт и П. By (Wehnert, Woo, 1980) показали, что С. salmositica более специфична по отношению к форели, чем об этом сообщалось ранее. Плазма крови рыб с по Ф стинвазионным иммунитетом лизировала криптобии, и титр колебался от 1:4 до 1:8. Не разведенная свежая плазма при 4С лизировала около 500 паразитов за 30-60 мин., но лизиса не наблюдалось, если плазму подогревали, то есть при высокой температуре она инактивирововалась. Колебания численности паразитов у форели в ходе заражения С. salmositica (Woo, 1979) позволили предположить наличие антител, иммунного лизиса, фагоцитоза или и того и другого. Форель, которая выздоровела после « предшествующего 4-х месячного заражения, была резистентна к гомологичному повторному заражению (Wehnert, Woo, 1981). Защитные антитела у нее были обнаружены через 56 дней после повторного заражения. С. Джонс и П. By (Jones, Woo, 1987) в последующих исследованиях подтвердили наличие иммунитета у выздоравливающей форели. Они же предположили, что он был не стерильным. Агглютинацию и нейтрализацию антител обнаруживали в течение последующих 4 месяцев. Комплемент фиксирующие антитела были выявлены и у выздоравливающей форели. Зараженные рыбы после внутрибрюшинной инъекции кортизола с кокосовым маслом имели значительно более высокую интенсивность инвазии С. salmositica (Woo et al., 1987). Это подтверждает известное иммунодепрессивное действие кортизола. Показано, что гуморальные антитела играли важную роль в защитных реакциях. У форели, инъецированной кортизолом, латентный период заболевания был короче, интенсивность инвазии и смертность была выше, чем в контрольной группе, и у рыб, которым вводили только кокосовое масло. Возбудитель С. salmositica является одним из немногих паразитов рыб, которые вызывают депрессию иммунной системы (Woo, 1987а; 1992). У зараженной криптобиями форели (О. mykiss) наблюдалось угнетение выработки антител на эритроциты барана и бактерию Yersinia rucheri (Wehnert, Woo, 1981; Jones et al., 1986; Sin, Woo, 1993). Инфицированные криптобиями рыбы, подвергнутые действию бактерий Y. гискегі, проявляли более высокую смертность (Jones etal., 1986).
Уровень гемолитической активности комплемента у зараженной форели составляет около 20% от первоначального и сохраняет столь низкие значения на протяжении всего периода заболевания (Thomas, Woo, 1989). Такой уровень комплемента снижает фагоцитарную активность и функцию антигенного распознавания макрофагов и, как следствие, может способствовать развитию им-мунодепрессии.
Было показано, что биология вида и возраст (в частности, у молоди)влияют на формирование приобретенного иммунитета рыб (Healey, 1991; San-dercock, 1991). Механизм резистентности, вероятно, не основывается на классической иммунной реакции, характерной для других видов рыб (Woo, 1992). Среди выращенных в лабораторных условиях чувствительных к С. sal-mositica гольцов {Salvelinus spp.) оказалось несколько экземпляров, устойчивых к экспериментальному заражению (Forward et al., 1993). Плазма крови невосприимчивых экземпляров лизировала паразита. Авторы сделали вывод, что резистентность является наследуемым свойством и, очевидно, контролируется простым доминантным геном. Переболевшие рыбы устойчивы к повторному заражению. Зараженные и переболевшие рыбы имеют комплемент образующие и нейтрализующие антитела (Wehnert, Woo, 1981; Jones, Woo, 1987). Пассивный перенос лимфоцитов и плазмы от иммунных рыб обеспечивает неполную защиту форели (О. mykiss) при последующем заражении (Jones, Woo, 1987). Приобретенные гуморальные и клеточные иммунные реакции у рыб удается обнаружить спустя две недели после заражения криптобиями (Thomas, Woo, 1990а; Woo, 1990). Несмотря на имеющиеся описания основных факторов (Trust, 1986; Jurd, 1987; Pasquier, 1989), в целом клеточные иммунные реакции рыб на паразитов изучены недостаточно (Woo, 1995). В условиях in vitro замедление реакции макрофагов является единственной методом обнаружения клеточного иммунного ответа. Он был использован для определения клеточной иммунной реакции зараженной форели (О. mykiss) и подтверждения депрессивного действия неполноценных диет (по пантотеновой кислоте и протеину) на клеточный иммунитет при криптобиозе (Thomas, Woo, 1990b). П.П. Головин и др. (Golovin et al., 1998) показали, что присутствие крип-тобий в крови кумжи вызывает активный иммунный ответ. Антигенным раздражителем может являться как сам активный паразит, так и продукты его жизнедеятельности. Появление в кровяном русле у зараженных рыб плазматиче ских и ретикулярных клеток, макрофагов, активация фагоцитарной функции моноцитов и нейтрофилов, указывает на участие в защитном механизме клеточного звена иммунитета. Вероятно, поэтому у части рыб с высоким иммуно-физиологическим статусом даже при вспышке заболевания не возникает сильного заражения криптобиями.
Процесс идентификации кровяных жгутиконосцев включает исследования морфологии и биологии паразита, перекрестное заражение хозяев и переносчиков, антигенных (с помощью моноклональных антител) и молекулярных (используя пробы ДНК- или РНК-содержащих органелл) его свойств (Woo, 1995).
При высоких уровнях заражения жгутиконосцев рода Cryptobia можно обнаружить с помощью микроскопии нативных препаратов крови и асцитной жидкости. Низкие уровни инвазии проще всего выявить, концентрируя паразитов центрифугированием (Woo, 1969) или с помощью коагуляции (Strout, 1962).
Техника гематокритного центрифугирования является более чувствительной, чем простое исследование нативных препаратов крови. Отработка этого метода диагностики показала, что его чувствительность повышалась, если проводить центрифугирование при 1-10С, так как С. salmositica погибает при температуре выше 20С. Метод позволяет обнаружить паразитов, даже если их содержится около 75 экз. в 1 мл крови (Woo, Wehnert, 1983; Bower, Margolis, 1984c).
Многие исследователи утверждают, что для подтверждения видовой идентификации криптобий необходимы результаты перекрестного экспериментального заражения (Woo, 1995). Одним из элементов этого метода является культивирование паразитических жгутиконосцев. Техника культивирования криптобий изучена достаточно подробно (Woo, 1979; Woo, Li, 1990). Она по
Биологическая характеристика каспийского лосося и особенности его воспроизводства на Ардонском лососевом рыбоводном заводе
Каспийский лосось, имеющий зоологическое название вида каспийская кумжа {Salmo trutta caspius Kessler), - один из самых крупных представителей рода Salmo. Отдельные особи куринского стада достигают массы 51 кг. Генетически каспийская кумжа, несомненно, связана с обыкновенной кумжей {Salmo trutta trutta Linneus), а не с лососем {Salmo salar Linneus). В пользу этого говорят как характер эмбрионального развития, так и кариотипа (Медников и др., 1999).
В настоящее время каспийская кумжа в своём распространении приурочена, главным образом, к юго-западному и южному побережью Каспия, откуда заходит в реки, текущие с Кавказского хребта (Кура, Терек, Самур и другие более мелкие реки на территории Ирана). Однако еще в 17 веке кумжа в довольно значительном количестве заходила и в Волгу (Никольский, 1971).
Биологически каспийская кумжа весьма разнородна. Имеется несколько нерестовых стад. Терский лосось достигает массы 7,5 кг при средней длине тела 82,5 см. Наиболее крупные рыбы нерестуют один раз в жизни в возрасте от 5 до 9 лет. Плодовитость терской кумжи — 16-30 тыс. икринок. В р. Терек лохи (самцы) идут только осенью с сентября по декабрь, а лососи-самки осенью и весной. Основная часть самок (вместе с самцами) заходит в Терек осенью (рис.
Икрометание терского лосося происходит с третьей декады октября повторую декаду января при температуре воды от 13,9 до 0С (Казаков, 1982).
Покатной стадии (smolt) часть молоди достигает в Тереке уже в течение первого года, но основная масса скатывается по реке к морю в возрасте двух лет. Имеются у каспийской кумжи и карликовые самцы («пестрятки»), которые называются ручьевой форелью, созревающие в реке и не выходящие в море. ряда сохраняются всю жизнь. Боковая линия содержит 115-132 чешуек. Этарыба обитает в ручьях и горных речках, растет сравнительно медленно и в возрасте 4 лет не превышает 18-19 см. Оптимальная температура для обитания ручьевой форели 13-18С. Созревает ручьевая форель на 3-4 году жизни (Козлов, 1998).
Нерест происходит с сентября по март, преимущественно в октябре-ноябре, при температуре воды не ниже 6-8С на мелководных участках с быстрым течением и каменисто-галечным грунтом, в который самки закапывают икру. Форель часто поднимается для нереста в верховья речек и ручьев. Плодовитость небольшая, в среднем 600-2500 икринок. Икра оранжевого цвета, диаметр икринки 4-6,5 мм. Развитие икры длится от 2 до 5 месяцев и более. Вылупившиеся личинки имеют длину 2-2,5 см, снабжены большим желточным мешком, который рассасывается в течение 20 суток (Титарев, 2003).
Молодь питается мелкими ракообразными и личинками насекомых. Взрослые рыбы - личинками насекомых (подёнок, стрекоз, комаров), гаммару-сами, мелкими моллюсками, падающими в воду насекомыми, икрой (часто собственной), рыбой (бычками-подкаменщиками, гольяном), головастиками, лягушками и даже мелкими млекопитающими (грызунами) (Титарев, 2003).
К биологическим особенностям вида можно отнести то обстоятельство, что вследствие сбалансированного соотношения в популяции самцов и самок ручьевая форель обладает возможностью естественного воспроизводства, тогда как проходная кумжа, представленная в основном самками (90% и более), лишена подобных функций. Именно карликовые самцы ручьевой форели преобладают на нерестилищах и, в сравнении с крупными самцами проходной кумжи, играют первостепенную роль в естественном воспроизводстве вида. Высокая значимость популяции ручьевой форели в биологии проходной кумжи, особенно при рассмотрении этих двух морфологических форм в качестве единого зоологического вида, имела место при естественном нересте терской кумжи. В настоящее время контакт этих двух форм осуществляется в водных участках после выпуска молоди кумжи с рыбоводных заводов. Это ообенно важно вэпизоотическом аспекте, так как молодь лососевых рыб более восприимчива к заболеваниям, чем рыбы старших возрастов.
После зарегулирования стока р. Терек (ввода в эксплуатацию Каргалин-ской оросительной системы) для сохранения терской кумжи возникла необходимость в её искусственном воспроизводстве, которое обеспечило бы доста т точное пополнение популяции и компенсировало потерю естественных нерес тилищ этого вида (Никольский, 1971).
Терская кумжа — высокоценная промысловая рыба. Ее жирность у озимых особей превышает 24%. Средний вес одной рыбы — 3,6 кг, средняя плодовитость — 4-5 тыс. икринок, средний диаметр икринки — 4,9 мм (Казанчеев, 1981; Никольский, 1971). В настоящее время отлов производителей терской кумжи для рыбовод ных заводов ведут ставными и плавными сетями в нижнем бьефе Терско Кумской плотины (г. Моздок), куда производители доходят в процессе мигра ции вверх по реке. На пункте отлова производителей лосося выдерживают в ре ечных садках, устанавливаемых на участке реки с несильным течением (0,2-0,5 м/с) и удобном для производственных манипуляций. Транспортировку рыбы на АЛРЗ осуществляют в живорыбной машине. Дальнейшее выдерживание рыбы проводят в стационарных русловых садках на ручье Мельничный, у места водо забора завода. Самцов и самок, близких к созреванию, держат раздельно, сам (jt цов - выше по течению, самок - ниже (Инструкция ..., 1995). Созревание производителей и сбор икры у терской кумжи растянуты с конца октября до середины января. Пик приходится на период с 15 ноября по 20 декабря. Икра от 2-3-х самок сходных размеров собирается в один таз. Обычно практикуемая норма по массе икры 2-2,5 кг. Необходимо, чтобы самки были одинаковой сезонной формы. Для осеменения партии икры от 2-3 средних по массе самок (3-3,5 кг) достаточно спермы от 2-3 проходных самцов. Из-за малочисленности часть икры осеменяют спермой заводских самцов. Осемене
Оценка восприимчивости радужной форели (Oncorhynchus mykiss Walbaum) к С. salmositica
Особенностью криптобиоза на АЛРЗ являлось его развитие исключительно у каспийского лосося (S. trutta caspius) на фоне его отсутствия у радужной форели (О. mykiss). Однако по литературным данным радужная форель является восприимчивым видом к С. salmositica (Woo, 1995). Это обстоятельство позволило предположить наличие у обнаруженного возбудителя узкой специфичности по отношению к каспийскому лососю. Для подтверждения данного предположения было поставлено три модельных эксперимента.
В первом опыте в рыбоводный лоток ИЦА-2, куда поступала вода из водоисточника завода (ручья Мельничный), было посажено по 30 экз. радужной форели и зараженных криптобиями лососей массой 7—10 г. До начала эксперимента экстенсивность заражения лосося составляла 33,3 % при интенсивности инвазии 1-2 экз./1000 эр. После совместного выращивания в течение 60 дней было проведено исследование крови обоих видов рыб на наличие возбудителя. Удалось установить, что радужная форель осталась свободной от криптобий, в то время как экстенсивность инвазии лосося возросла до 100% при средней интенсивности зараженности в 2,3 экзЛООО эр. Полученные результаты также показали, что в созданных экспериментальных условиях интенсивность инвазии среди лососей возросла незначительно, тогда как экстенсивность их заражения увеличилась втрое.
Параллельно был поставлен второй опыт, в котором 25 экз. зараженного каспийского лосося и 10 экз. радужной форели поместили в небольшую емкость объемом около 100 л. с проточной артезианской водой (температура воды 11-13С). В ходе эксперимента (в течение 60 дней) отмечали значительное замедление темпа роста рыб по сравнению с таковыми в обычных производственных условиях. Результаты опыта показали, что радужная форель осталась свободной от криптобий, при этом экстенсивность инвазии лосося возросла с 33,3 до 78,0%, а интенсивности инвазии - с 1-2 до 5 экз./ЮОО эр. Таким обра зом, в обоих экспериментах при совместном содержании лосося и радужной форели происходило дальнейшее заражение криптобиями восприимчивого каспийского лосося, тогда как форель оставалась свободной от возбудителя.
В третьем эксперименте оценивали восприимчивость рыб к изучаемому паразиту при внутрибрюшинном заражении. Для этих целей с Майского ЛРЗ была доставлена молодь каспийского лосося, не имевшая контакта с криптобиями. Молодь завезенного лосося и радужной форели (по 10 экз. средней массой 10 г) была посажена в отдельные небольшие проточные емкости с артезианской водой (температура воды 12-13С). Каждой рыбе методом внутрибрю-шинной инъекции было введено по 0,1 мл крови от зараженного криптобиями двухлетка каспийского лосося. В конце эксперимента (через 45 дней) при микроскопии мазков крови криптобии были обнаружены только у молоди каспийского лосося (ЭИ - 23%, ИИ - 2,3 экз./ЮОО эр.), тогда как радужная форель снова оказалась свободной от возбудителя.
Полученные результаты показали, что изучаемая С. salmositica обладает строгой специфичностью по отношению к каспийскому лососю и не заражает радужную форель. Наши экспериментальные данные не согласуются со сведениями, имеющимися в литературе (Woo, 1978; 1995), которые говорят о патогенносте С. salmositica для лососевых рыб рода Oncorhynchus, в том числе и для радужной форели (Woo, 1995). В опытах П. By и С. Венерта (Woo, Wehnert, 1983) по совместному содержанию незараженной и зараженной криптобиями (С. salmositica) радужной форели удалось выяснить, что заражение ранее свободных от паразитов рыб произошло в разных вариантах опыта через 22-27 недель. Более того, в слизи с поверхности тела зараженных рыб были обнаружены криптобии, морфологически сходные с паразитами, обнаруженными в крови.
Динамика криптобиоза радужной форели характеризуется двумя пиками: первый появляется на 14-21 день после заражения, второй, более низкий, — на 42 день. Интенсивность заражения форели кровепаразитами был достаточно высока и достигала значений в 16565 экз. (Lowe-Jinde, 1980).
Таким образом, выявлена биологическая особенность изучаемого возбудителя, которая отличает его от описанного для Северной Америки вида С. salmositica. Учитывая этот факт, а также высокое морфологическое сходство с С. salmositica его можно предварительно отнести к географическому изоляту или аллопатрической популяции. Известно, что географические изоляты служат важнейшей единицей эволюции и им присуждают ранг подвида (Майр, 1971; Международный ..., 2004). Однако мы полагаем, что для присуждения изучаемому нами возбудителю этого ранга необходимо проведение дополнительных кариологических и биохимических исследований.
Из литературных данных известно два основных пути передачи кровепа-разитов рода Cryptobia: у большинства видов с помощью пиявок, а у некоторых еще и через воду (Woo, 1995). Характер заражения криптобиями отловленных в реке и завезенных на завод производителей (отсутствие заражения при завозе и значительные показатели инвазии через 2-3 недели содержания в русловом садке), а также периодическое наличие на рыбах большого количества пиявок Pis-cicola geometra косвенно свидетельствовали о роли последних в развитии заболевания. В то же время отсутствие пиявок в рыбоводных лотках и бассейнах с молодью лосося, быстрое распространение инвазии среди смолтифицирующих рыб возможно лишь при передаче паразита через воду. Для определения этого важного эпизоотического звена криптобиоза (в условиях АЛРЗ) были поставлены специальные эксперименты.
В первом опыте выясняли роль пиявки P. geometra в качестве механизма передачи возбудителя от зараженных рыб к незараженным. С этой целью в водоисточнике завода (ручье Мельничный) были отловлены зараженные производители каспийского лосося, с которых были сняты 13 экз. пиявок. Восемь пиявок немедленно исследовали на наличие криптобий. Однако ни нам, ни принимавшему в работе специалисту по кровепаразитам рыб К.Х. Хайбулаевукриптобий обнаружить не удалось. Оставшиеся пять экземпляров пиявок были помещены в лоток с проточной артезианской водой (температура воды 13С). После подсадки к ним 10 экз. зараженных годовиков каспийского лосося с клиническими признаками криптобиоза пиявки сразу напали на рыб и начали активно питаться. Затем этих же пиявок пересадили в другой лоток с 10 экз. неза-раженной молоди лосося. Вскрытие и микроскопию содержимого кишечника и хоботковой зоны пиявок проводили через 18 часов (у двух пиявок) и 10 дней (у трех пиявок), а рыб исследовали на наличие криптобий спустя 60 дней с начала опыта. При паразитологическом обследовании, как пиявок, так и крови рыб криптобий или стадии их развития обнаружить не удалось. Таким образом, участие пиявки P. geometra в качестве переносчика возбудителя не подтвердилось.
Из литературы известно, что P. geometra является типичным представителем гидрофауны Палеоарктики. За пределы этой области она была занесена с карпом достаточно недавно, в конце 19 века. Ставится под сомнение ее присутствие в Северной Америке (Лукин, 1976). В то же время пиявка P. salmositica, которую принято считать промежуточным хозяином С. salmositica, относится к типичным представителям Неарктической области, охватывающей Канаду и США. За ее пределами, в том числе и в России, данный вид пиявки ни разу не обнаруживали (Лукин, 1976; Woo, 1995; Ермоленко и др., 1998; Вялова, 2003). В связи с этим вполне логично, что P. geometra не является переносчиком С. salmositica. В то же время исключать наличие переносчика без исследований других видов пиявок, характерных для Волго-Каспийского региона, мы полагаем, не совсем корректно. На территории Волго-Каспийского региона распространены еще (кроме P. geometra) два вида пиявок, паразитирующих на лососе - P.fasciata и Caspiobdellafadejewi (Лукин, 1976).
Для выяснения возможности передачи возбудителя через воду был поставлен специальный эксперимент, для которого с Майского ЛРЗ, где криптобий ни разу не обнаруживали, были завезены годовики каспийского лосося. Ра боту проводили в производственных лотках ИЦА-2. В лоток № 1 были посажены 300 экз. молоди каспийского лосося с АЛРЗ. В лоток № 2 - 300 экз. рыб, завезенных с МЛРЗ, в лоток № 3 - 100 экз. молоди с МЛРЗ и 200 экз. местной молоди (с АЛРЗ). Водоподачу осуществляли из ручья Мельничный, при этом использовали фильтр для исключения попадания в лотки пиявок и других достаточно крупных гидробионтов. Результаты опыта оценивали через 45 дней. Полученные данные (табл. 5) показали, что криптобии распространяются через воду и сохраняют способность заражать каспийского лосося. Возбудитель попадает в лотки вместе с водой, подающейся из водоисточника завода - ручья Мельничный. Об этом свидетельствует заражение каспийского лосося, завезенного с Майского ЛРЗ (в лотки № 2 и № 3). Увеличение количества зараженных рыб (ЭИ) в лотках № 1 и № 3 говорит как о поступлении криптобии из водоисточника, возможной циркуляции возбудителя в экспериментальной емкости и о его передаче от зараженных рыб. Отличие в экстенсивности заражения рыб с МЛРЗ в лотках № 2 и № 3 подтверждает это предположение. Высокие плотности посадки и замкнутое пространство рыбоводных емкостей являются факторами, способствующими распространению возбудителя.
Результаты исследований факторов передачи возбудителя показали, что транспортировка рыб может способствовать распространению возбудителя. В 2003 г. среди 42 «диких» (отловленных у Моздокской плотины на р. Терек) производителей каспийского лосося, завезенных на АЛРЗ для проведения нерестовой компании, был обнаружен один экземпляр, зараженный криптобиями. Интенсивность инвазии составила 5 экз./1000 эр.
Таким образом, проведенные нами исследования позволили выяснить, что основным путем передачи возбудителя (С. salmositica) является водная среда. Способность обнаруженных криптобии заражать рыб через воду резко повышает их эпизоотический статус и позволяет возбудителю в условиях высоких плотностей содержания быстро заражать всю выращиваемую на заводе молодь.
