Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Биология вида 9-13
1.2. Состояние запасов и воспроизводства 13-16
1.3. Влияние некоторых токсических веществ на физиологическое состояние рыб
1.3.1 Действие фенола и его производных на физиологическое состояние рыб
1.3.2. Влияние тяжелых металлов на физиологическое состояние рыб
1.3.3. Влияние синтетических поверхностно-активных веществ (СПАВ) на физиологическое состояние рыб
1.4. Особенности поведенческих реакций рыб в онтогенезе 22-25
1.5. Применение гематологических исследований для оценки физиологического состояния рыб в экологических исследованиях
1.6. Морфофункциональное состояние некоторых органов и тканей рыб под влиянием токсикантов и применение гистологических методов в рыбохозяйственных исследованиях
1.7. Условия искусственного выращивания лососевых рыб на рыбоводных заводах, состояние их органов и тканей
1.7.1. Условия искусственного выращивания лососевых рыб на АПЭРЛЗ (Адлерском производственно-экспериментальном рыбоводном лососевом заводе)
Глава 2. Материал и методы
2.1. Структура и объем исследованного материала 45-47
2.2 Гистологические методы 47-48
2.3. Методики исследования клеточного состава крови 48-49
2.4 Методики проведения опытов по исследованию поведенческих реакций молоди рыб 49
2.5. Морфометрические и статистические методы исследования
Глава 3. Сравнительный анализ состояния жаберного аппарата, печени, почек черноморского лосося в норме и под влиянием токсикантов и солености
3.1. Анализ морфофункционального состояния жаберного аппарата под влиянием меди, фенола, детергента и солености 55
3.2. Анализ морфофункционального состояния печени под влиянием меди, фенола, детергента и солености
3.3 Анализ морфофункционального состояния почек под влиянием меди, фенола, детергента и солености
Глава 4. Состояние клеток крови рыб после опытных воздействий
4.1. Морфологический анализ клеток крови молоди черноморского лосося
Глава 5. Оценка поведенческих реакций рыб на фоне экспериментальных воздействий
5.1, Анализ поведения черноморского лосося 96
5.1.1. Оценка поведения черноморского лосося в тесте «открытое поле»
2. Выработка простых условных рефлексов двухстороннего избегания предпочитаемой освещенности у молоди черноморского лосося на фоне токсических воздействий
Заключение 108-115
Выводы 116-117
Список литературы 118-149
Приложение 1 150-165
Приложение 2 166-168
- Состояние запасов и воспроизводства
- Методики проведения опытов по исследованию поведенческих реакций молоди рыб
- Анализ морфофункционального состояния жаберного аппарата под влиянием меди, фенола, детергента и солености
Введение к работе
К настоящему времени в литературе имеется достаточно много сведений по влиянию различных токсикантов на позвоночных животных, в частности рыб. Черноморский лосось Salmo trutta labrax является одним из наиболее редких и ценных представителей ихтиофауны Черного моря. Этот вид занесен в Красную Книгу, промысел его запрещен, и вместе с тем именно по нему не достаточна информация о влиянии экзотоксикантов на органы и ткани в процессе онтогенеза, таким образом, не изучен гистогенез органов и тканей вида и их патология под влиянием среды обитания, отсутствует сопоставление нормы и патологии органов и тканей в раннем онтогенезе черноморского лосося.
Водоемы наиболее часто загрязнены токсикантами органического происхождения (фенолы и их соединения), тяжелыми металлами и СПАВ. Причем, еще в 1970 году (Лукьяненко, 1970) было показано, что тяжелые металлы наиболее остро и быстро воздействуют на молодь рыб, в то время как действие токсикантов органической природы (нефтепродукты, фенолы) усиливается по мере развития организма.
Любое изменение факторов внешней среды вызывает изменение в поведении животных. По этой причине нарушение поведенческих реакций после какого либо воздействия на животных совместно с данными гистологических, морфобиологических и других исследований помогают более точно выявить механизмы этого воздействия на организм (Лазарева, Алехин, 1985).
Система крови - одна из самых подвижных систем, быстро реагирующих на изменения гомеостаза организма вследствие химического повреждения. Список ядов, повреждающих систему крови, достаточно велик. К их числу относят соединения, вызывающие изменения гемопоэза (бензол, хлорбензол, ДДТ, пестициды, многие лекарственные препараты), нарушения син- теза порфирина и гема (ряд тяжелых металлов, среди которых особое место занимает свинец), изменения свойств гемоглобина и гемолиз. Тем не менее; избирательность действия яда в условиях хронического опыта подчас трудно доказать, поскольку изменения в крови протекают одновременно с нарушениями других функций и систем организма (Трахтенберг, 1987).
В случае воздействия токсических веществ, либо стрессорных реакций организм рыб обладает значительными компенсаторными возможностями. Эти возможности складываются из механизмов, осуществляющих адаптации и компенсаторные реакции на уровне целого организма, его органов, тканей, а так же на уровне отдельных клеток. В адаптационных процессах, возникающих в организме при воздействии неблагоприятных факторов среды, особо важную роль играет печень. В свою очередь функциональные свойства печени определяются метаболическими процессами, происходящими в гепа-тоцитах. Значение печени как центрального органа в обменных процессах, обусловливает особый интерес к структуре и функции этого органа в норме и патологии, о чем свидетельствует большое количество публикаций (Беспро-званный, 198; Вишневская, 1993; Иванова, 1983; Павлов, 1990; Трахтенберг, 1987).
Нарушение функции печени, как правило, проявляется при далеко зашедших морфологических изменениях органа, которые могут служить критерием в оценке степени развития патологических процессов (Корниенко, Кожин, Воловик, Макаров, 1998).
Жабры, являясь органом, непосредственно контактирующим с окружающей средой, первыми подвергаются губительному воздействию токсических веществ, в результате чего степень пораження этого органа бывает достаточно высока.
Почки костистых рыб в отличие от высших позвоночных состоят из . паренхиматозной и интерстициальной (лимфоидной) ткани. Знать последствия влияния токсических веществ на почки рыб чрезвычайно важно, вследст- виє того, что именно этот жизненно-важный орган несет ответственность за выведение токсикантов из организма. При этом наибольшую значимость имеют специфические проявления действия токсикантов на организм черноморского лосося.
Б качестве токсикантов были выбраны СПАВ, фенол и медь, так как именно эти вещества наиболее часто обнаруживаются в водоемах с превышением ПДК в целом.
Цель работы — провести сравнительный анализ строения органов и тканей молоди черноморского лосося в норме, и после воздействия экзоток-сикантов: сульфата меди, фенола, СПАВ и солености 5 %о_ Определить морфологические особенности влияния токсических веществ на внутренние органы черноморского лосося - жаберный аппарат, печень и почки. Показать возможности купирования негативных воздействий (соленость 5 %о).
Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:
На основе'гистологических методов анализа установить характер и степень патоморфологических нарушений в жаберном аппарате, печени и почках черноморского лосося после воздействия выбранных экзотокси-кантов и солености.
Вывить морфологические особенности действия сульфата меди, фенола, СПАВ и солености на жаберный аппарат, печень и почки молоди черноморского лосося.
Применив общепринятые гематологические методы, охарактеризовать морфологические особенности действия сульфата меди, фенола, СПАВ и солености на систему крови молоди черноморского лосося.
Используя полученные данные, выявить особенности действия сульфата меди, фенола, СПАВ и солености на клеточный состав крови молоди черноморского лосося.
С помощью теста «Открытое поле» и установки «Челночная камера» провести исследование поведенческих реакций у неполовозрелых особей черноморского лосося при воздействии выбранных токсикантов и выявить основные характерные черты в поведении молоди черноморского лосося после воздействия токсических веществ.
Научная новизна. В работе впервые проведено комплексное исследование некоторых органов и тканей черноморского лосося в раннем онтогенезе с применением трех классических методик - гистологической, гематологической и поведенческих реакций после воздействия токсических веществ. В качестве токсических веществ были выбраны наиболее распространенные в окружающей среде связанные с антропогенной деятельностью человека: тяжелые металлы (сульфат меди), фенол, СПАВ. Впервые предприняты исследования по выявлению особенностей воздействия токсических веществ на органы и ткани молоди черноморского лосося в раннем онтогенезе. В качестве органов-мишеней для исследования были выбраны жабры, печень и почки.
Научно-практическая значимость. Полученные данные могут быть использованы на рыбоводных лососевых заводах для предотвращения массового отхода рыб в процессе искусственного воспроизводства. Изучение поведенческих реакций и обучение молоди перед выпуском в реку может способствовать лучшей адаптации в естественных условиях и повысить про-мвозврат. В результате исследования выявлены основные характерные черты воздействия трех классов токсикантов на внутренние органы черноморского лосося, что дает основание использовать полученные данные на рыбоводных заводах.
Состояние запасов и воспроизводства
Среди представителей мировой ихтиофауны, насчитывающей около 20 тысяч видов рыб, лососевым рыбам принадлежит относительно скромное место. Однако в системе мировой аквакультуры они занимают особое положение, которое определяется в первую очередь, особенностью биологии и высокой рыбохозяйственной ценностью. Лососевым рыбам свойственны сложный жизненный цикл, резкие колебания численности, но вместе с тем высокая репродукционная способность, высокий темп роста и пластичность (Ка-нидьев, 1984).
Лососевые рыбы как источник высококачественной пищевой продукции являются традиционным объектом промысла. На мировом рынке эти рыбы пользуются неизменной популярностью, и, несмотря на высокую цену, спрос в полной мере не удовлетворяется. В современных мировых уловах, составляющих около 70 млн. т., лососевые составляют не более 0,6 млн. т., но эта относительно скромная часть, менее 1%, достигает 15% общей стоимости улова (Канидьев, 1984).
Основу мирового промысла лососевых рыб составляют два рода - тихоокеанские (p. Oncorhynchus) и атлантические (p.Salmo) лососи. Это, главным образом, проходные, моноцикличные и полицикличные рыбы, нагуливающиеся в море и нерестящиеся в пресноводных водоемах (Карпевич, 1970).
Представители родов Oncorhynchus и Salmo обитающие в пресных водах, по сравнению с проходными, занимают в промысле менее значительное место. Среди них можно назвать радужную форель (S. gairdnen Rich) как наиболее популярный и культивируемый вид. Общий мировой объем производства радужной форели составляет в настоящее время 70-80 тыс. т., то есть в 4-5 раз больше, чем объем промысла всех проходных лососей рода Salmo.
Сложный жизненный цикл лососей на протяжении всего онтогенеза способствует снижению сопротивляемости под влиянием естественных и антропогенных "факторов. Интенсивный промысел проходных лососевых рыб в последние десятилетия снизил численность их таким образом, что общий объем промысла проходных лососей p. Salmo в последние годы не превышает 15 тыс.т. (Канидьев, 1984).
С 1980-го по 1990 годы среднегодовой вылов всех лососевых видов в северной части Тихого океана составлял около 600 тыс. тонн всеми странами, а сейчас эта цифра достигает 900 тыс. тонн. Как сообщил директор СахНИРО Владимир Радченко (от 23.11. 2001), еще несколько лет назад в северной части Тихого океана рыбаки добывали около 1 млн. т. лососевых рыб в год. В 2000 году этот показатель упал до 820 тыс. тонн. Не оправдались прогнозы ихтиологов по заходу горбуши в реки восточного побережья Камчатки, резко сократились уловы нерки на Аляске (Новости Сахалина и Курил, www. salch.com/news).
По данным РосБизнесКонсалтинг, за 2001 год во Владивостоке объемы добываемой на Камчатке рыбы лососевых пород снизились с 3 тысяч до 1950 тонн в сутки. Из-за слабого подхода лосося закрыт промысел в Камчатском заливе. В главном промысловом районе, в Карагинской подзоне, у восточных берегов полуострова, работают 28 плавбаз., 92 производственных рефрижератора и 112 морских ставных неводов. Как сообщает агентство "Восток-Медиа", специалисты заявляют, что на западном побережье подходы ценной рыбы незначительны. Между тем, по прогнозам ученых, в 2003 году во время путины рыбаки могли рассчитывать на вылов более 100 тыс. тонн лосося, К настоящему моменту не добыто и половины прогнозировавшихся объемов. («Крестьянские ведомости» http: //www.k.- vedomosti.ru. 2003 г.).
Как сообщает Департамент правительственной информации (ДНИ) (от 14.05. 2002) в 2002 году общий допустимый улов тихоокеанских лососей в поверхностных водных объектах, во внутренних морских водах, в территориальном море и в исіоіючительной экономической зоне РФ утвержден в объеме 157 тыс. 775,6 тонны.
Методики проведения опытов по исследованию поведенческих реакций молоди рыб
Для проведения эксперимента было взято 5 емкостей по 10 л. В каждую емкость наливали 8 литров воды и помещали 15 рыб, на этот объем рассчитывали и разводили токсикант. Воду в емкостях меняли два раза в день -утром и вечером, при этом разводили свежий раствор токсиканта. Кроме того, черноморский лосось является весьма требовательной к кислороду рыбой, на каждую особь требуется 2 л проточной воды, дефицит кислорода может быть смертелен. В постановке экспериментов эту зависимость соблюдать было трудно, поэтому дефицит кислорода возмещали при помощи компрессоров Uni Star. На 5-й день эксперимента проводили тестирование по физиологическим и поведенческим реакциям молоди в тесте «открытое поле» и осуществляли выработку условного рефлекса предпочитаемой освещенности.
Был поставлен опыт в виде теста на выбор молодью черноморского лосося предпочитаемой солености. Опыт ставился в течение суток в бассейне с размерами: ширина - 40 см, длина - 300 см, до решетки - 250 см, высота - 60 см, высота НЮ - 14 см, средняя скорость движения воды - 1 м/мин. Концентрация соли была рассчитана так, чтобы вблизи решетки соленость была примерно 5 %о (наименьшая). Для этого в поток воды вливали раствор соли, рассчитанный следующим образом: 0,4 х 0,14 х 250 = 14 х 5 г = 70 г на бассейн. Соль вымывалась в среднем за 1 час. Кроме того, в работе регистрировались гидрохимические показатели воды: в момент закладки опыта и по его завершении. Соленость 5 %о была выбрана не случайно, т.к. именно этот раствор для молоди лососевых рыб является лечебным средством от эктопаразитов в летний период времени, и вместе с тем градиентом перехода как к пресной так и соленой среды обитания гидробионтов (Хлебович, 1974).
После этого рыб тестировали по физиологическим и поведенческим реакциям молоди: тест «Открытое поле» и выработка условного рефлекса предпочитаемой освещенности.
При оценке двигательной активности молоди в тесте «Открытое поле» использовали цилиндрическую емкость диаметром 60 см и высотой 40 см. На дно емкости была нанесена координатная сетка, слой воды составил 5 см, во избежание вертикальных перемещений рыб.
Смысл теста «Открытого поля» в данной работе состоял в том, чтобы охарактеризовать адекватность поведения молоди черноморского лосося в новой для нее ситуации и оценить ее реактивность на внешние раздражители, как нехарактерные для природных условий, так и близко отражающие ситуации, возникающие в естественных условиях жизни молоди.
Регистрировали двигательную активность молоди (количество пересеченных линий координатной сетки за каждые 30 секунд опыта, начиная с момента помещения ее в емкость). Длительность опыта составила 15 минут. За период опыта определяли ориентировочную двигательную активность молоди (ОА, ед./мин) - количество пересечений линий квадрата в течение первых 3 минут после помещения рыбы в новую для нее обстановку; фоновую двигательную активность (ФА, ед./мин - среднее количество пересечений с 4-й по 7-ю минуту после адаптации к экспериментальной обстановке. На 7-й минуте наносили слабый механический удар молоточком по стенке емкости, а через 1,5 минуты - сильный механический удар (виброакустический стимул, характеризующий чувствительность акустико-латеральной системы) и определяли количество пересечений за 30 секунд, следующие за ударами. Затем на 10-й минуте рыбе имитировали течение и определяли количество пересечений сторон квадратов молодью в последующие 30 секунд, а также способность рыбы держаться на течении, т. е. сохранять реореакцию. Двенадцатая минута сопровождалась воздействием макета хищника. На 13-й минуте включали свет и определяли количество пересечений за 30 секунд.
Выработку условного рефлекса двустороннего избегания света при механическом подкреплении у молоди проводили в челночной камере - прямоугольном пластмассовом бассейне 150 х 40 х 40 см.
Анализ морфофункционального состояния жаберного аппарата под влиянием меди, фенола, детергента и солености
Все эксперименты по влиянию токсикантов по продолжительности составляли 30 суток. Для постановки эксперимента использовали меди кристаллогидрат - C11SO4 х 5 Н20. Предварительно был произведен расчет для приготовления раствора токсиканта необходимой концентрации CuSCU х 5 НгО - 1 мг/л, причем осуществили пересчет на ион меди (Си +) (см. главу 2.).
Для проведения эксперимента брали емкость объемом 10 л. В емкость наливали 8 литров воды и помещали 15 рыб, на этот объем рассчитывали и разводили токсикант. Воду в емкости меняли два раза в день - утром и вечером, при этом разводили свежий раствор токсиканта. Кроме того, черноморский лосось является весьма требовательной к кислороду рыбой, на каждую особь требуется 2 л проточной воды, дефицит кислорода может быть смертелен. В постановке экспериментов эту зависимость соблюдать было трудно, поэтому дефицит кислорода возмещали при помощи компрессоров Uni Star. На 5-й день эксперимента проводили тестирование по физиологическим и поведенческим реаісциям молоди в тесте «открытое поле» и осуществляли выработку условного рефлекса предпочитаемой освещенности.
В жаберном аппарате черноморского лосося после воздействия меди (1 мг/л) наблюдались следующие патологические изменения:
- 1) все капилляры в ламеллах резко и неравномерно расширены, плотно заполнены эритроцитами, т.е. изменения носят дисциркуляторный характер.
- 2) в основании филамент отмечено разрастание многослойного неоро-говевающего эпителия.
- 3) часто наблюдался отек венозных сосудов. Некоторые венозные сосуды филамент были переполнены эритроцитами. В некоторых филаментах сосуды были расширены и не содержали форменных элементов крови (признаки гипоксии) (Приложение 1, фотої).
Для постановки эксперимента фенол был взят в концентрации 10 мг/л.
Для проведения эксперимента, как и в предыдущих случаях, брали емкость объемом 10 л. В емкость наливали 8 литров воды и помещали 15 рыб, ыа этот объем рассчитывали и разводили токсикант. Воду в емкости меняли два раза в день - утром и вечером, при этом разводили свежий раствор токсиканта. Тестирование по физиологическим и поведенческим реакциям молоди в тесте «открытое поле» проводили на 5-й день эксперимента и осуществляли выработку условного рефлекса предпочитаемой освещенности.
Анализ состояния жаберного аппарата черноморского лосося после воздействия фенола (10 мг/л) показал, что разрастание многослойного плоского неогроговевающего эпителия превратили жаберные филаменты в сплошные эпителиальные пластинки (Приложение 1, фото 2). В большинстве случаев, наблюдалось срастание филамент между собой верхушечными частями (Приложение 1, фото 3). Ламеллы были трудно различимы и имели вид прямоугольников, часто встречались деформированные ламеллы. Во многих случаях, видно разрушение дыхательного эпителия (Приложение 1, фото 4). В некоторых ламеллах капилляры были сильно расширены, на концах забиты эритроцитами. Венозные сосуды филамент также были переполнены эритроцитами. Часто встречались деформированные или безъядерные эритроциты с признаками гемолиза (Приложение 1, фото 5).
