Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11.
1.1. Антигены эхинококка и их характеристика 11.
1.2. Клеточная технология получения антигенов эхинококка 18.
1.3. Применение ELISA и dot-ELISA для диагностики гельминтозов 22.
2. Собственные исследования 38.
2.1. Материалы и методы 38.
2.1.1. Подготовка лабораторной посуды, инструментов и растворов для проведения культуральной работы 39.
2.1.2. Получение гельминтного материала для культивирования 40.
а) Приобретение цист E.granulosus от людей и
животных 40.
б) Заражение белых крыс протосколексами E.multilocularis, получение вторичных ларвоцист 40.
2.1.3. Приготовление первичной клеточной культуры E.granulosus и E.multilocularis и проверка ее жизнеспособности. Получение перевиваемой клеточной культуры 41.
2.1.4. Контроль клеточных метаболитов на стерильность, безвредность, определение содержания белка 42.
? 1.5. Проверка инвазивности клеточной культуры E.multilocularis 43.
2.1.6. Определение антигенной активности клеточных метаболитов E.granulosus и E.multilocularis 44.
2.1.7. Диагностическая эффективность метаболитов клеточных культур E.granulosus и E.multilocularis 45.
а) Сбор патологического материала от свиней 45.
б) Исследование сывороток крови свиней в реакции ELISA 46.
в) Исследование сывороток крови людей в реакции ELISA 47.
г) Исследование сывороток крови людей коммерческим тестом "Эхинококк IgG-стрип" 48.
2.1.8. Статистическая обработка результатов 48.
2.1.9. Разработка диагностической тест-системы на основе dot-ELISA 48.
2.1.10. Диагностическая эффективность dot-ELISA при цистном гидатидозе 50.
а) Исследование сывороток крови свиней 50.
б) Исследование сывороток крови людей 51.
2.2. Результаты исследований 52.
2.2.1. Анализ данных по культивированию протосколексов E.granulosus и вторичных ларвоцист E.multilocularis 52.
2.2.2. Характеристика и контроль метаболитов клеточных культур протосколексов E.granulosus и вторичных ларвоцист E.multilocularis 57.
2.2.3. Отбор и характеристика антигеноактивных метаболитов клеток протосколексов E.granulosus и вторичных ларвоцист E.multilocularis в иммуноферментной реакции 58.
2.2.4. Оценка диагностической эффективности антигенов -метаболитов клеточной культуры при цистном гидатидозе 60.
а) Диагностическая эффективность иммуноферментной реакции с антигенами клеточной культуры E.granulosus при цистном гидатидозе свиней 60.
б) Диагностическая эффективность иммуноферментной реакции с антигенами клеточной культуры E.multilocularis при цистном гидатидозе свиней 61.
в) Диагностическая эффективность антигенов клеточной культуры E.granulosus при цистном гидатидозе человека 62.
г) Диагностическая эффективность антигенов клеточной культуры E.multilocularis при цистном гидатидозе человека 68.
2.2.5. Исследование сывороток крови человека коммерческим тестом "Эхинококк IgG-стрип" 72.
2.2.6. Разработка диагностической тест-системы на основе dot-ELISA 73.
а) Диагностическая эффективность dot-ELISA с антигеном цистной жидкости при цистном гидатидозе человека 76.
б) Диагностическая эффективность dot-ELISA с антигеном клеточной культуры E.granulosus при цистном гидатидозе свиней 77 в) Диагностическая эффективность dot-ELISA с антигеном клеточной культуры E.multilocularis при цистном гидатидозе свиней 81.
г) Диагностическая эффективность dot-ELISA с антигеном клеточной культуры Е.granulosus при цистном гидатидозе человека 82.
д) Диагностическая эффективность dot-ELISA с антигеном клеточной культуры E.multilocularis при цистном гидатидозе человека 85.
2.2.7. Сравнение диагностической эффективности реакций ELISA, dot-ELISA и "Эхинококк IgG-стрип" при цистном гидатидозе 86.
2.2.8. Результаты заражения беспородных белых мышей клеточной культурой E.multilocularis 97.
3. Обсуждение полученных результатов 100.
4. Выводы 109.
5. Список использованной литературы 112.
Приложение
- Применение ELISA и dot-ELISA для диагностики гельминтозов
- Приготовление первичной клеточной культуры E.granulosus и E.multilocularis и проверка ее жизнеспособности. Получение перевиваемой клеточной культуры
- Разработка диагностической тест-системы на основе dot-ELISA
- Диагностическая эффективность антигенов клеточной культуры E.granulosus при цистном гидатидозе человека
Применение ELISA и dot-ELISA для диагностики гельминтозов
Источником антигенов при эхинококозах могут быть как онкосферальные антигенные детерминанты, так и антигены последующих стадий развития паразита, включая и цистную жидкость. Причем антигены, стимулирующие антителогенез, могут локализоваться в соматических тканях паразита и в экскреторно-секреторных продуктах. Значительной антигенной активностью по данным Bensfed Н. and Atkinson I. (1953), Hariri M.N. et al.(1965) обладает жидкость из фертильных цист, которая содержит более высокие концентрации антигена по сравнению со стерильными цистами. Тем не менее, жизнеспособные, но не фертильные цисты со здоровой герминативной оболочкой, содержат антигены, имеющие диагностическое значение, что свидетельствует об антигенности, не связанной исключительно с фертильностью эхинококковых цист Hariri M.N. et al.(1965). Дальнейшие исследования в этом направлении, проведенные с жидкостью эхинококковых цист и протосколексами паразита от разных хозяев, показали различия в антигенной активности. Было показано, что жидкость эхинококковых цист от человека и овец содержала более высокие концентрации паразитарных антигенов, чем аналогичный источник от крупного рогатого скота и свиней. Отличия в антигенной активности отмечены и в зависимости от органа поражения эхинококками: печеночные цисты были более антигеноактивными, чем легочные (Musiani P. et al.,1978). Аналогичные заключения сделали ранее Hariri M.N. et al. (1965), обнаружив высокую концентрацию гидатидного антигена в печеночной цисте овец, хотя подобные антигенные компоненты регистрировали в печеночных и легочных эхинококковых цистах от других видов животных.
В диагностических целях с различной степенью эффективности широко использовали также антигены, полученные из протосколексов и мембран эхинококковых цист (Kagan I. and Norman L., 1961; Hariri M.N. et al.,1965; Fischman A., 1968; Garabedian J.A., 1971; Dottorini S. and Tassi C, 1978; Craig P.S., Packard M.D., 1981 b). Полезным источником диагностического антигена, особенно на ранних стадиях инвазии, могут быть онкосферы. Онкосферальные антигены, по данным Rickard M.D., Williams J. (1982), обладают значительным протективным действием, они стимулируют выработку антител при цестодозах, что было установлено при исследовании сывороток животных, зараженных личинками тениид (Craig P.S., Rickard M.D., 1981а).
Привлекательным источником антигена в практическом плане является E.multilocularis, поскольку заражение этим паразитом лабораторных животных позволяет получить большое количество паразитарного материала, содержащего идентичные с E.granulosus антигены. Хотя, как отмечают Kagan I. and Norman L., (1961), содержание антигенов в цистах E.multilocularis значительно меньше, тем не менее они успешно были использованы для диагностики инвазии E.granulosus у людей (Leykina E.S. et al., 1981; Gottstein В. et al.,1983) и E.multilocularis у мышей (АН-Khan Z., 1974; Ali-Khan Z., Siboo R., 1982).
Как правило, все ткани и органы паразита, а также цистная жидкость, используемые в качестве источников антигенов, содержат в своем составе большое количество антигенных компонентов. Иммунохимический анализ с использованием сывороток иммунизированных кроликов позволил идентифицировать в цистной эхинококковой жидкости, в экстракте из мембраны и протосколексов паразита до 23 различных антигенных компонентов (Kagan I. and Norman L., 1961). Причем сравнение результатов, полученных реакцией иммунодиффузии паразитарных препаратов с сывороткой кроликов, иммунизированных сывороткой хозяев или тканевыми экстрактами органов, из которых были получены эхинококки, показало наличие нескольких антигенов, общих для хозяина и паразита (Kagan I. and Norman L., 1961; Norman L. et al., 1964; Chordi A., Kagan I., 1965; Capron A. et al., 1968; Varela-Diaz V. et al., 1974; Gomez-Garcia V. et al., 1980). Присутствие в антигенных препаратах эхинококков антигенов для хозяина и паразита существенно влияет на их диагностическую эффективность, и в большинстве случаев такие неочищенные препараты не могут дать объективную картину в иммунодиагностических исследованиях. Для характеристики специфических антигенов, являющихся стимуляторами антителогенеза у зараженных животных и имеющих диагностическое значение, использовались различные физико-химические и иммунохимические методы.
Исследование специфических антигенов эхинококков основывается на анализе синтезируемых в процессе заражения антител, поскольку не все антигенные компоненты, выявляемые в тканевых экстрактах или в жидкости цист с помощью гипериммунных сывороток, являются иммуногенными. Однако сыворотки иммунизированных животных не потеряли своего значения, они играют важную роль в характеристике эхинококковых антигенов и довольно часто используются при стандартизации серодиагностических тестов (Varela-Diaz V. and Coltorti E., 1976).
Используя сыворотки от зараженных животных в цистной жидкости и тканевых экстрактах E.granulosus и E.multilocularis было выявлено четыре паразитарных антигена (Kagan I., Norman L., 1963), причем наиболее часто регистрируемая линия преципитации в реакции иммунодиффузии, обозначенная Р, впоследствии была идентифицирована как фракция 5 или arc-5 (Capron A. et al.,1967, 1970). Хроматографическое разделение антигенов цистной жидкости E.granulosus, проведенное Pozzuoli R. et al. (1972), снова продемонстрировало два основных антигена, которые авторы идентифицировали как антигены 4 и 5 по Chordi A., Kagan I. (1965). Хроматографическое распределение этих двух антигенных компонентов было идентично таковому, описанному Oriol R. et al. (1971) для антигенов А и В.
Дальнейшие исследования показали, что компонент 4 (АГ 4) имел самую высокую реактивность; все сыворотки от больных цистным гидатидозом имели антитела к этому антигену, однако он также давал ложноположительную реакцию с сыворотками пациентов, свободных от гидатидной инвазии. Большинство сывороток от больных цистным гидатидозом имели также антитела к антигенному компоненту 5 (АГ 5), причем было установлено, что АГ 4 является термолабильным, а АГ5-термостабильным.
Приготовление первичной клеточной культуры E.granulosus и E.multilocularis и проверка ее жизнеспособности. Получение перевиваемой клеточной культуры
Работу выполняли в стерильном боксе в ламинаре. Ларвоцисты E.multilocularis, полученные от зараженных беспородных белых крыс, измельчали ножницами и пропускали полученную массу через мельничный газ с диаметром ячеек 1,0 мм. Выделенные из цист E.granulosus и вторичных ларвоцист E.multilocularis протосколексы отмывали 3-5 раз стерильным физиологическим раствором с антибиотиками из расчета 2000 ЕД/мл пенициллина и 1 мг/мл стрептомицина. Отмытый материал подвергали измельчению в ручном гомогенизаторе с добавлением 0,5-1,0 мл раствора Хэнкса до получения однородной массы. Затем в полученную массу добавляли 1-3 мл раствора. Надосадок собирали в центрифужные пробирки и осаждали центрифугированием при 1000-1200 об./мин. в течение 7-10 минут. Осадок ресуспензировали и промывали 3-5 раз. Жизнеспособность клеток определяли в камере Горяева после окрашивания 0,4% раствором трипанового синего при увеличении микроскопа 20x10 общепринятым методом. Культуры, содержащие не менее 85-87% жизнеспособных клеток, использовались в дальнейшей работе.
Суспензию клеток протосколексов промывали стерильным физиологическим раствором с антибиотиками посредством 5-7-кратного центрифугирования при 1000-1200 об./мин. в течение 7-10 минут. Концентрацию клеток в суспензии доводили до 600-800 тыс/мл и вносили в ростовые среды (ДМЕМ, RPMI-1640 и ИглаМЕМ) с добавлением 7-10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, сыворотки крови лошади или без сыворотки. Клеточную культуру выращивали в С02-инкубаторе при температуре +37С, влажности 70% и содержании С02 - 5%. Процесс роста и пролиферации клеток в питательных средах контролировали под микроскопом.
В процессе культивирования с периодичностью 7-10 дней проводили отбор метаболитов клеток и проверяли их в иммуноферментной реакции с положительными и отрицательными контрольными сыворотками для определения антигеноактивных серий клеточных метаболитов.
Контроль на стерильность. Для обнаружения контаминации бактериями, грибами и микоплазмами пробу метаболитов клеточных культур высевали на МПА, МПБ и МППБ по одной пробирке. На грибковую контаминацию пробу метаболитов высевали на агар Сабуро в две пробирки. На микоплазменную контаминацию пробу метаболитов высевали на полужидкий агар (0,3%), приготовленный на ферментативном переваре бычьего сердца с добавлением 10% сыворотки крови лошади, 10% дрожжевого экстракта и 100 ЕД/мл пенициллина в две пробирки. Контроль вели в течение трех пассажей на этой же среде. Посевы на МП А, МПБ и МППБ выдерживали в течение 10 суток при +37С, посевы на полужидком агаре - 14 дней при +37 С и на среде Сабуро - 15 дней при комнатной температуре. При обнаружении хотя бы одного из контаминантов партию считали не стерильной, и в дальнейшей работе не использовали.
Контроль на безвредность. Испытания проводили на 10 беспородных белых мышах, не использовавшихся ранее в экспериментах. Каждому животному внутримышечно вводили по 0,5 мл метаболитов клеточных культур и вели наблюдение в течение 28 суток. Метаболиты считали безвредными в том случае, если на протяжении всего срока наблюдения животные оставались клинически здоровыми.
Определение содержания белка. Концентрацию белка в метаболитах клеточных культур определяли на спектрофотометре СФ-26, ЛОМО при длине волны 280 нм. В качестве контроля использовали питательную среду для культивирования и дистиллированную воду.
В процессе работы была поставлена задача выяснить способность перевиваемой клеточной культуры из вторичных ларвоцист E.multilocularis вызывать инвазию у промежуточных хозяев. Исследования проводили на 9 беспородных белых мышах массой 18-20г, распределенных на две группы по 3 и 6 особей. Первую группу заражали первичной культурой клеток E.multilocularis, а вторую - перевиваемой культурой клеток E.multilocularis (после образования монослоя). Заражение проводили внутрибрюшинно в дозе 25-30 тыс. клеток на каждое животное иглой с диаметром 0,4 мм с соблюдением правил асептики и антисептики. Содержание и кормление зараженных мышей было обычным. Убой проводили через четыре месяца после заражения. При вскрытии отмечали наличие или отсутствие альвеококковых цист.
Наличие специфических антигенных компонентов в метаболитах клеточных культур исследуемых паразитов устанавливали с помощью иммуноферментной реакции типа ELISA (Voller A. et al., 1974) с некоторыми модификациями. Реакцию проводили в полистероловых планшетах отечественного производства. Положительным контролем в реакции при отборе антигеноактивных серий метаболитов клеток служили сыворотки свиней, спонтанно инвазированных E.granulosus, и сыворотки людей, зараженных E.granulosus и E.multilocularis, а отрицательным - сыворотки свиней, у которых при вскрытии гельминтной инвазии не обнаружили, и здоровых людей - доноров.
Антиген использовали в титре 1/2 и 1/4. Разведение осуществляли карбонатно-бикарбонатным буфером (БКБ), рН 9,6. Сенсибилизацию планшета проводили при +4С в течение 18-20 часов с последующим отмыванием не связавшихся с полистеролом белков 0,05% раствором Tween-20 на дистиллированной воде три раза по 3-5 минут после каждого этапа реакции. Сыворотки крови разводили 1:100 в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ), рН 7,2, с добавлением 0,05% Tween-20 и 0,05%) бычьего сывороточного альбумина (БСА). В качестве конъюгата использовали антитела диагностические против IgG сыворотки крови человека, а также антитела диагностические против IgG сыворотки крови свиньи, меченые пероксидазой. Разведение конъюгата проводили тем же буфером, что и сыворотки, увеличив концентрацию БСА в 10 раз. Планшеты с сывороткой и конъюгатом инкубировали при +37С в течение одного часа. В качестве субстрата применяли ортофенилендиамин на цитратном буфере, рН 4,7, с добавлением стабилизированной перекиси водорода. Реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 50% серной кислоты. Оптимальные разведения всех компонентов (антиген, сыворотка и конъюгат), используемых в реакции, устанавливали опытным путем на основе максимальной разницы в оптической плотности между отрицательной и положительной контрольными сыворотками.
Учет реакции проводили на автоматическом анализаторе колориметрическом иммуноферментном 340/АТС фирмы SLT-labsistems (Австрия) при длине волны 492 нм. Пробу считали положительной, если ее оптическая плотность превосходила значение оптической плотности отрицательного контроля в два и более раза. Оценку результатов проводили только в том случае, если в лунках с отрицательной контрольной сывороткой и без сыворотки (контроль конъюгата) окраска была слабо-розовая или отсутствовала. Серии метаболитов клеточных культур, показавших хорошую антигенную активность с контрольными сыворотками, использовали в дальнейшей работе.
Разработка диагностической тест-системы на основе dot-ELISA
Одним из основных условий в получении полноценной клеточной культуры является подбор гельминтного материала, качество которого во многом определяется жизнеспособностью выделенных из него клеток и их способностью к росту и размножению в искусственных питательных средах. В связи с этим для получения первичной культуры клеток E.granulosus мы отбирали неповрежденные цисты из внутренних органов (печень, легкие) естественно инвазированных животных, по возможности от взрослых, у которых чаще регистрируются зрелые цисты. Транспортировали и хранили цисты при температуре +4-6С в стерильном физиологическом растворе не более 5 дней после убоя. Содержащаяся в эхинококковых пузырях жидкость должна быть прозрачной, без признаков нагноения или петрификации. Зрелая циста содержит развитые протосколексы с хорошо выраженной двигательной активностью и полноценной короной крючьев. Культуру клеток готовили также из личинок E.granulosus, полученных от оперированного человека. Однако в этом случае необходимо учитывать, что протосколексы паразита могут быть ослабленными в результате предоперационного лечения. На протяжении периода работы нами были использованы эхинококковые цисты от 13 животных и 1 от человека, отвечающих требованиям приготовления клеточной культуры.
Вторичные ларвоцисты E.multilocularis получали от экспериментально зараженного донора - хлопковой крысы. Цисты многокамерного эхинококка, в большом количестве содержащиеся в брюшной полости животного, использовали как для получения клеточной культуры, так и для заражения белых лабораторных крыс. Через четыре месяца у зараженных крыс отмечали развитие многокамерных пузырей, содержащих зрелые протосколексы, что свидетельствует о высокой степени инвазионности гельминтного материала.
Успех культуральной работы во многом зависел от качества первичной культуры клеток, получение которой осуществлялось различными способами. Чаще всего для извлечения клеток из тканей используют различные ферменты (трипсин, коллагеназу, папаин, гиалуронидазу и др.). Однако во многих случаях рекомендуется избегать обработку ферментами, что обеспечивает получение более жизнеспособной культуры клеток.
В своих исследованиях приготовление первичной культуры клеток из протосколексов E.granulosus и вторичных ларвоцист E.multilocularis мы осуществляли, используя метод нежной гомогенизации в ручном гомогенизаторе, позволяющий довести выход жизнеспособных клеток не менее 85-87%.
Для культивирования выделенных клеток эхинококков мы испытали искусственные питательные среды Игла MEM, ДМЕМ и RPMI-1640. Эти среды хотя и отличаются по составу, успешно использовались в культуральной работе.
В вышеперечисленных средах клетки гельминтов длительное время сохраняли жизнеспособность, а в условиях СОг - инкубатора при температуре 37С, влажности 70% и составе газовой среды 5% СО? росли и размножались, образуя монослой. С целью усиления интенсивности пролиферации клеток в культуре в питательные среды добавляли 10% сыворотку крови плода крупного рогатого скота или сыворотку крови лошади. В этом случае размножение клеток в культуре становилось более активным, но, как показали последующие
Перевиваемая культура клеток E.multilocularis исследования, добавление сыворотки несколько отрицательно влияло на результаты иммуноферментного анализа. Результаты нашего исследования показали, что наиболее подходящими для культивирования клеток с целью получения экскреторно-секреторного антигена для проведения иммунодиагностических исследований оказались среды Игла MEM и RPMI-1640 без добавления сыворотки. В этих питательных средах клетки достаточно активно пролиферировали и образовывали монослой в течение 10-14 дней. Способность к пролиферации клеток сохранялась также и после многократных пересевов, то есть была получена перевиваемая культура. Отбор ростовой среды, в которой клетки росли и размножались, проводили в момент пересевов с периодичностью 7-10 дней. Отобранные клеточные метаболиты хранили при -12С, проверяли на стерильность и безвредность, оценивали их антигенную активность и в дальнейших исследованиях использовали только антигеноактивные серии.
Характеристика и контроль метаболитов клеточных культур протосколексов E.granulosus и вторичных ларвоцист E.multilocularis Каждую новую серию метаболитов клеточных культур перед началом исследований на антигенную активность проверяли на стерильность и безвредность. Контроль на стерильность. Для обнаружения бактериальной загрязненности проводили посевы метаболитов клеточных культур на МПА, МПБ и МППБ. Результаты этого анализа показали, что полученные нами в процессе культивирования метаболиты клеток оставались стерильными в течение всего периода наблюдения. Посевы метаболитов на среду Сабуро для контроля грибковой контаминации в период исследования также дали отрицательный результат.
Контроль на безвредность. Испытания по определению безвредности полученных серий клеточных метаболитов, проводимые на беспородных белых мышах при внутримышечном введении, показали, что подопытные животные оставались клинически здоровыми на протяжении всего периода наблюдений (28 дней). Признаков воспаления на месте введения не обнаруживали.
Определение содержания белка. Содержание белка в метаболитах протосколексов Е. granulosus и вторичных ларвоцист Е. multilocularis, определенное на спектрофотометре СФ-26 ЛОМО составило 7,28-12,48 в питательной среде без добавления сыворотки и 22,2-29,6 мг/мл - с добавлением сыворотки.
Диагностическая эффективность антигенов клеточной культуры E.granulosus при цистном гидатидозе человека
Специфичность реакции dot-ELISA с антигеном клеточной культуры протосколексов E.granulosus при цистном гидатидозе человека составила, таким образом, 89,4% (табл.9, диаграмма 6). д) Диагностическая эффективность dot-ELISA с антигеном клеточной культуры Е.multiloculans при цистном гидатидозе человека В качестве антигена использовали метаболиты клеточной культуры вторичных ларвоцист Е. multiloculans (плотность по белку -4,52 мкг/мл), концентрированные Ул. Реакцию осуществляли на мембранах Immobilon-P по описанной выше методике.
Как показали проведенные исследования, из 55 проб сывороток крови больных цистным гидатидозом положительно реагировали с антигеном Е. multiloculans - 39 и 16 сывороток - отрицательно. Из 6 сывороток крови больных альвеолярной формой гидатидоза все показали положительную реакцию.
Таким образом, чувствительность реакции dot-ELISA с антигеном клеточной культуры E.multilocularis при цистном гидатидозе человека составила 70,9%, а при альвеолярной форме гидатидоза достигла 100%. Что касается гетерологичной инвазии, то все сыворотки крови больных цистицеркозом и трихинеллезом (2 и 5 соответственно) реагировали отрицательно, в то время как из 5 проб сывороток крови больных, страдающих висцеральным токсокарозом, 1 показала слабоположительную реакцию.
Из 74 проб сывороток крови клинически здоровых пациентов 10 реагировали положительно и 64 - отрицательно, причем аналогичные результаты реакции эти же сыворотки давали в иммуноферментной реакции с экскреторно-секреторными антигенами эхинококков.
Таким образом, специфичность реакции dot-ELISA с антигеном клеточной культуры E.multilocularis составила 88,2% (табл.10, диаграмма 7).
Проводили сравнение чувствительности и специфичности использовавшихся для диагностики цистного гидатидоза человека и животных иммунотестов.
Результаты проведенного анализа показали, что в диагностике цистного гидатидоза животных наилучшие результаты по чувствительности показал тест ИФР с антигенами клеточной культуры E.multilocularis (75,6%), чуть ниже этот показатель был в ИФР с «клеточным» антигеном Е. granulosus (73,3%). Чувствительность теста dot-ELISA с обоими антигенами не превышала 71,1%. Наиболее высокий показатель специфичности был достигнут в реакции тест ИФР с Е. multilocularis 6 6 (100%) 0 (0%) Т. spiralis 5 0 (0%) 5 (100%) Т. canis 5 1 (20%) 4 (80%) С. cellulosae 2 0 (0%) 2 (100%) Клинически здоровые 74 9 (12,2%) 65 (87,8%) Всего 147 Диаграмма 6. Оценка диагностической эффективности dot-ELISA с антигенами клеточной культуры протосколексов Е.granulosus при цистном гидатидозе человека 100
Р 0,0001 Данные статистически достоверны. антигенами клеточной культуры - 71,3%. В целом же специфичность иммунотестов при диагностике цистного гидатидоза животных оказалась невысокой, что связано с наличием большого числа ложноположительных реакций с сыворотками зараженных другими ларвальными цестодозами и нематодозами свиней (диаграмма 8). Реакция dot-ELISA с антигеном цистной жидкости для работы с материалом от свиней не показала конкретных результатов.
При работе с сыворотками крови людей показатели чувствительности при проведении реакций ИФР с антигенами клеточной культуры E.granulosus и коммерческого теста были одинаковыми и составили 87,3%. Чувствительность dot-ELISA была одинаковой со всеми антигенами и не превышала 72,4%. Наиболее высокий показатель специфичности наблюдали в реакции dot-ELISA с антигеном клеточной культуры протосколексов E.granulosus (89,4%). Ложноположительные реакции отмечали во всех иммунотестах. Также во всех диагностичских реакциях отмечали положительную реакцию антигена E.granulosus с сыворотками больных альвеолярным гидатидозом. В то же время при использовании экскреторно- секреторного антигена клеточной культуры вторичных ларвоцист E.multilocularis выявляли 83,6% больных цистным гидатидозом (диаграмма 9).
Таким образом, анализируя полученные данные, можно сделать вывод о том, что ИФР типа ELISA обладает более высокой чувствительностью, тогда как более высокая специфичность отмечается в реакции dot-ELISA (табл. 11).
Антигены клеточных культур подходят для диагностических исследований и не уступают по своей эффективности антигенам, приготовленным другими способами.
