Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 11
1.1 Биология клетки: основные понятия, функции клетки, механизмы, контролирующие рост клеток 11
1.2 Методы клеточной технологии 18
1.3 Характеристика ларвоцисты эхинококка 24
1.4 Антигены Echinococcus multiloculans и их эффективность в иммунодиагностике эхинококкозов 29
II. Собственные исследования 39
2.1 Материалы и методы 39
2.1.1 Правила работы в лаборатории с клеточными культурами (в боксе) 39
2.1.2 Подготовка к опытам лабораторной посуды, резиновых изделий, различных материалов и инструментов 40
2.1.3 Получение инвазивного материала Echinococcus multiloculans, заражение белых крыс 42
2.1.4 Методика получения вторичных ларвоцист Е. multilocularis, приготовление первичной клеточной культуры протосколексов, культивирование клеток протосколексов в синтетической питательной среде 42
2.1.5 Получение клеточных метаболитов протосколексов Echinococcus multilocularis, выделение антигеноактивных серий иммуноферментной реакцией (ИФР) 45
2.1.6 Исследование антигеноактивных серий клеточных метаболитов («клеточных» антигенов) реакцией иммунодиффузии 49
2.1.7 Методы цитологических исследований, типирование культивируемых клеток протосколексов 50
2.1.7.1 Фиксация 50
2.1.7.2 Методы окрашивания для определения типа клеток в культуре 51
2.1.7.3 Типы клеток в неактивных и антигеноактивных сериях клеточных метаболитов протосколексов Е. multilocularis 53
2.1.8 Диагностическая эффективность «клеточных»
антигенов протосколексов Echinococcus multilocularis в ИФР при эхинококкозах в зависимости от типа клеток в культуре 54
2.1.8.1 с сыворотками крови людей 55
2.1.8.2 с сыворотками крови свиней 55
2.1.9 Статистическая обработка полученных результатов 56
III. Результаты исследований 57
3.1 Цитологическая характеристика клеток первичной клеточной культуры 57
3.2 Анализ данных по культивированию типов клеток протосколексов Echinococcus multilocularis, получение антигеноактивных клеточных метаболитов (клеточных» антигенов) 64
3.3 Иммунохимическая характеристика клеточных антигенов протосколексов Е. multilocularis 78
3.4 Сравнительная оценка диагностической эффективности клеточных антигенов протосколексов Echinococcus multilocularis в зависимости от типа клеток в культуре 84
Обсуждение полученных результатов 92
Выводы 103
Список использованной литературы 105
- Методы клеточной технологии
- Подготовка к опытам лабораторной посуды, резиновых изделий, различных материалов и инструментов
- Получение клеточных метаболитов протосколексов Echinococcus multilocularis, выделение антигеноактивных серий иммуноферментной реакцией (ИФР)
- Иммунохимическая характеристика клеточных антигенов протосколексов Е. multilocularis
Введение к работе
Культуры клеток животных стали неотъемлемой частью биотехнологии, они используются для решения научных проблем общей биологии, цитологии, генетики, вирусологии, иммунологии и инфекционной патологии. Одной из причин такого интереса специалистов к культивированию клеток из различных органов и тканей животных, человека и растений является возможность использования культуры клеток для диагностики и лечения наследственных заболеваний, в качестве тест-объектов при испытании новых фармакологических веществ, для сохранения генофонда исчезающих видов животных и растений.
Всемирная организация здравоохранения придает большое значение разработке более совершенных методов культивирования возбудителей зоонозов, к числу которых относятся и эхинококкозы, с целью изучения особенностей развития и роста in vitro, для диагностики, а также для использования их в качестве рациональных моделей испытания новых средств против различных болезней. Клеточная технология может с успехом использоваться также для получения биологически активных веществ со свойствами антигенов, имеющих иммунодиагностическое и иммунопрофилактическое значение. Изучение антигенных свойств гельминтов на разных стадиях развития и их экскреторно- секреторных продуктов - одна из важнейших задач современной иммунологии. Создание оптимальных условий жизнедеятельности клеток вне организма, выделение продуктов метаболизма гельминтов в чистом виде, свободными от микроорганизмов и антигенов хозяина — насущная проблема современной биотехнологии в гельминтологии, может осуществляться благодаря методам культивирования гельминтов для получения специфических антигенов (Тараканов, 1985).
Преимущества клеточной технологии в получении антигенов гельминтов и других биологических объектов сводятся к тому, что клеточные культуры можно приготовить из различных антигеноактивных субстанций паразитов и длительное время сохранять в функциональном состоянии в синтетических питательных средах путем их многократного пассирования. Однако необходимо при этом учитывать, что антигенность используемых для культивирования органов и тканей паразитов находится в связи с их систематическим положением. Так, у нематод наибольшую антигенную активность проявляют личинки, особенно в период линьки, что связано с выделением большого количества секретов (Soulsby, 1961; Silverman et al., 1962). В то же время у цестод антигеноактивные субстанции находятся в субтегументальной области пузыря, на присосках вблизи экскреторного отверстия протосколексов, а в онкосферах — под мембраной крючьев и в клетках гексакантных эмбрионов (Machnicka, 1974; Алферова, 1978).
Исходя из вышесказанного для культуральной работы, направленной на получение специфических антигенов цестод, можно использовать два объекта — протосколексы из цисты и яйца, содержащие инвазионные онкосферы. Однако в целях безопасности и с учетом обеспечения необходимой стерильности использование протосколексов или герминативных оболочек является более предпочтительным.
Яйца же с инвазионными онкосферами, хотя и обладают значительной антигенной активностью, для культуры клеток менее применимы. Помимо того, что они небезопасны для исследователей, загрязненность их микрофлорой кишечника хозяина требует более тщательной и длительной стерилизации, что также может отразиться на жизнеспособности клеток в культуре.
Протосколексы, как источник получения первичной клеточной культуры, являются сложным биологическим объектом, состоящим из клеток различных типов и назначения. Неоднородность первичной клеточной культуры влияет на процесс культивирования и на свойства получаемых метаболитов. Как правило, в процессе длительного культивирования одни типы клеток могут расти и активно пролиферировать однако, получаемые при этом клеточные метаболиты не всегда могут соответствовать требованиям, предъявляемым им как антигенным препаратам. С этих позиций возникает необходимость как в научном, так и в практическом плане, установления типов клеток, обеспечивающих в процессе культивирования выделение в среду обитания антигеноактивных метаболитов иммунодиагностической и иммунопрофилактической направленности.
Исходя из вышеизложенного, считаем целесообразной и актуальной работу по сравнительной оценке диагностической эффективности клеточных метаболитов протосколексов Е. multilocularis в зависимости от типа клеток в культуре.
Цели и задачи исследований Основной целью наших исследований было провести культивирование клеток протосколексов Е. multilocularis, получить антигеноактивные клеточные метаболиты с последующим определением типа клеток в культуре и одновременной оценкой их диагностической эффективности.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Получить вторичные ларвоцисты Е. multilocularis, выделить клетки протосколексов, приготовить первичную клеточную культуру и подобрать оптимальные условия их культивирования в синтетических питательных средах для получения клеточных метаболитов.
2. Провести отбор антигеноактивных серий клеточных метаболитов иммуноферментной реакцией (ИФР).
3. Реакцией иммунодиффузии в агаровом геле установить наличие антигенов паразита в выделенных ИФР сериях клеточных метаболитов.
4. Подобрать оптимальный режим фиксации и окраски культивируемых клеток протосколексов Е. multiloculans, определить типы клеток в культуре.
5. Собрать банк сывороток от животных и людей, инвазированных эхинококками, другими гельминтами и клинически здоровых.
6. Провести сравнительную оценку диагностической эффективности клеточных метаболитов с различной степенью антигенной активности при эхинококкозах в соответствии с типом клеток в культуре.
Научная новизна Впервые проведена цитологическая характеристика культуры клеток протосколексов, выделенных из вторичных ларвоцист Е. multiloculans, в процессе культивирования в синтетической питательной среде с последующей сравнительной оценкой диагностической эффективности полученных клеточных метаболитов при цистном и альвеолярном эхинококкозе.
Иммунохимическим анализом установлено наличие в клеточных метаболитах протосколексов антигеноактивных компонентов идентичных антигенам соматического экстракта протосколексов Е. multilocularis.
Впервые установлена зависимость антигенной активности метаболитов культивируемых клеток протосколексов паразита от типа клеток в культуре: наибольшую активность в ИФР (ОП с сыворотками зараженных Е. multilocularis и Е. granulosus соответственно 1,236 - 1,320) регистрировали в клеточных культурах с преобладанием клеток многогранной формы (клетки типа - 4), наименьшую (ОП с теми же сыворотками в пределах 0,350) в клеточных культурах с преобладанием больших округлых клеток (клетки типа - 2 и 3).
Практическая значимость
Материалы диссертационной работы Далаевой И. Б. вошли в «Методику идентификации «клеточных» антигенов эхинококка», одобренную секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН и опубликованную в трудах ВИГИС за 2006., т. 42, с. 578- 585.
По результатам цитологических исследований диссертанта подготовлена «Методика фиксации и окрашивания клеток протосколексов Echinococcus multilocularis в культуре in vitro», одобренная секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины (сентябрь 2006 года).
Апробация работы
Материалы диссертационной работы представлены и обсуждены на:
1. Заседаниях Ученого совета ВИГИС (2003-2006гг).
2. Научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (2004-2006гг).
3. Секции «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2005-2006гг).
Основные положения, выносимые на защиту
• Культивирование клеток протосколексов из вторичных ларвоцист Е. multilocularis в синтетической питательной среде, получение клеточных метаболитов, их оценка ИФР и приготовление препаратов для цитологических исследований. • Цитологическая характеристика клеток протосколексов в культуре in vitro в процессе культивирования.
• Иммунохимический анализ антигеноактивных серий клеточных метаболитов протосколексов, полученных в процессе культивирования и выделенных ИФР.
• Сравнительная диагностическая эффективность при эхинококкозах клеточных метаболитов протосколексов Е. multilocularis различной степени антигенной активности в зависимости от типа клеток в культуре.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, 3 из них в рекомендуемых ВАК изданиях.
Объем и структура диссертации
Материалы диссертации изложены на 128 страницах машинописного текста. Состоят из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, включающего: материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложение. Список литературы включает 169 источников, в том числе 74 отечественных и 95 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 23 рисунками.
Методы клеточной технологии
Анализ работ по культивированию клеток и тканей позвоночных и некоторых беспозвоночных животных показывает, что в этой области достигнуты значительные успехи.
Пути становления современных методов культивирования клеток и тканей позвоночных бьши трудными и долгими. Первые попытки вырастить ткани in vitro предпринимались ещё в середине прошлого столетия французским анатомом Vulpian (1850) и немецким эмбриологом Born (1897). Исследователи культивировали небольшие кусочки ткани эмбрионов лягушек в простой воде и получали даже рост и дифференцировку клеток. Метод тканевых культур предложен Скворцовым (1885) и Гарисоном (1907) и введён в практику Каррелем (1910). Методологические подходы в изучении закономерностей и характера роста культур тканей обосновали Максимов (1916, 1925), Хлопин (1946) и др. И только в 50-х годах нашего столетия широкое распространение получили первичные, диплоидные, перевиваемые однослойные линии клеток тканей почек млекопитающих и некоторых других органов позвоночных животных. Методы их получения описаны в руководствах Сергеева (1966, 1976), Голубева и др. (1972), Анджапаридзе, Богомоловой (1974), Хандуева, Лукьяновой (1974), Осидзе (1975), Уосли (1976), Дьяконова и др. (1980, 1984), Адаме (1983).
В последние годы все интенсивнее ведутся работы, цель которых — получение животных со стабильной интеграцией и экспрессией экзогенной ДНК в геноме (трансгенные животные). Савченковой (1996) впервые суммированы и обобщены основные мировые достижения по получению и культивированию эмбриональных стволовых клеток, выделенных из эмбриобласта предимплантационных зародышей млекопитающих.
Подробно изложены некоторые методические приемы их культивирования и трансфекции. Рассматриваются попытки выделения эмбриональных стволовых клеток домашних животных и их значение для генной инженерии в животноводстве.
Культивирование клеток ларвоцист Е. multilocularis в искусственных питательных средах проводится сравнительно недавно.
Культивируемые in vitro клетки использовали в опытах по установлению скорости и продолжительности их роста, формы и числа хромосом (Sakamoto, 1978; Furuya et al., 1990; Adams, 1990; Lu et al., 1998 и др.), по криопрезервации клеток (Eckert, Ramp, 1985; Bretagne et al., 1990), развитию ларвоцист после инъекции клеток внутрибрюшинно мышам (Dieckmann, Frank, 1988; Furuya 1991) или выращиванию ларвоцист из клеток в диффузионных камерах, включенных в брюшную полость лабораторных животных (Sakamoto, 1995). Реже такие клетки использовали в опытах по скринингу антгельминтиков (Feng et al., 1993) и только в нескольких работах обращено внимание на присутствие в культуре антигеноактивных клеток (Dieckmann, Frank, 1988; Feng et al., 1992; Бережко, Бессонов, 1999). В двух последних работах показано наличие антигенов в составе растворимых белков культуральной жидкости (Fengetal., 1992; Бережко, Бессонов, 1999).
Жизнеспособные терминальные клетки из паренхимного слоя метацестоды Е. multilocularis выделили Dieckmann, Frank (1988). Жизнеспособность этих клеток была подтверждена пассажем в брюшную полость монгольских песчанок, у которых через 2 мес. развились ларвоцисты, содержащие инвазионные протосколексы. Авторы разработали методику разделения клеток посредством центрифугирования в градиенте плотности. Во втором слое содержалась чистая культура терминальных клеток.
Из ларвоцисты Е. multilocularis от человека выделена клеточная линия. Для получения отдельных клеток из фрагментов тканей использовали трипсин. Культивирование вели в среде RPMI-1640 с 10% фетальной сывороткой теленка в покрытых коллагеном пластиковых чашках или флаконах. При первых пассажах в культуре наблюдали веретеновидные, а в дальнейшем полигональные и звездчатые клетки. Число хромосом в клетках на 40 пассаже колебалось от 14 до 104 (доминировали клетки с 90-100 хромосомами). При заражении хлопковых крыс 107 клетками 57 пассажа в перитонеальной полости животных через 100 дней обнаружены паразитарные узлы, что свидетельствовало о присутствии терминальных клеток в культуре и их способности дифференцироваться в ларвоцисты в условиях in vitro (Furuya et ah, Furuya, 1991).
Бережко, Бессонов (1999) использовали клеточные метаболиты Е. multilocularis в качестве диагностических антигенов при эхинококкозе свиней. Yamashita et al., (1962) пытались культивировать протосколексы Е. multilocularis в среде, состоящей в основном из 0,5% лактальбумина в растворе Хэнкса с различными добавками (сыворотка, желчь и экстракт печени крупного рогатого скота). Авторы наблюдали везикуляцию протосколексов и развивающуюся параллельно их дегенерацию. В некоторых случаях отмечали скопления терминальных клеток, подобные ранней стадии формирования зародышевой капсулы, в других имели место разрывы протосколексов, вызванные увеличением внутреннего давления.
Как известно, постоянные клеточные линии человека и животных отличаются тем, что они состоят из клеток одного и того же тканевого типа — из рыхлой соединительной ткани (культура фибробластов), миобластов скелетных мышц, различного рода эпителиальных клеток и других (Трошин, 1984). Тканевая однородность создается, по- видимому, на самых ранних этапах культивирования, так как первичные культуры практически всегда состоят из клеток различного тканевого типа.
Подготовка к опытам лабораторной посуды, резиновых изделий, различных материалов и инструментов
Работу с инвазионным материалом Echinococcus multilocularis проводили в стерильном боксе в ламинаре с вытяжкой. Очищенные от тканей хозяина ларвоцисты измельчали ножницами до гомогенного состояния. Каждую порцию гомогената, полученную из ларвоцист эхинококка, промывали стерильным физиологическим раствором (0,9%) хлористого натрия над мельничным газом с диаметром ячеек 0,3 мм. Фильтрат распределяли в цилиндры с коническим дном и отстаивали в течение 15-20 минут. Затем надосадочную жидкость собирали резиновой грушей со вставленной в ее конец пастеровской пипеткой и заменяли свежим физиологическим раствором. Содержимое цилиндров взбалтывали путем пропускания воздуха из груши и после 10-15 минут отстаивания снова удаляли надосадочную жидкость и заменяли свежим физиологическим раствором. Эту операцию повторяли 5-7 раз, постепенно сокращая срок отстаивания, с целью очистки протосколексов (рис. 3) от обрывков выводковых капсул, а также от погибших протосколексов, которые осаждаются с меньшей скоростью, чем живые.
Для приготовления первичной клеточной культуры отмытые в физрастворе с антибиотиками (1000 ЕД/мл пенициллина и 0,3 мг/мл гентамицина) протосколексы заливали 0,25%-ным раствором трипсина и ставили на инкубацию в термостат при t+37C на 30 минут. Затем протосколексы разрушали в гомогенизаторе осторожными поворотами стержня, доливая раствор трипсина в количестве 2 мл. После процедуры гомогенизации в течение 2-5 минут дают осесть крупным кусочкам, крючьям и целым протосколексам.
Надосадок с взвесью клеток собирали в центрифужные пробирки и клетки осаждали центрифугированием при 1200 об/мин в течение 5-7 минут. Процедуру отмывания клеток повторяли не менее 5 раз с последующим ресуспендированием осадка и подсчета клеток. Концентрацию клеток определяли путем подсчета в камере Горяева. К 1 мл пробы суспензии клеток добавляли 1 мл раствора краски (0,1% раствор кристаллического фиолетового на 0,1 мл раствора лимонной кислоты). После перемешивания суспензии клеток с раствором красителя, окрашенную суспензию вносили в камеру (клетки окрашиваются в темный цвет). Жизнеспособность клеток определяли с помощью 0,4% водного раствора трипанового синего. Процент жизнеспособных клеток в суспензии определяли по формуле: Общее число клеток - число мертвых клеток хЮО Общее число клеток
Культуры, содержащие не менее 85-87% жизнеспособных клеток, использовали в работе. Выращивание клеточной культуры проводили в одноразовых стерильных пластиковых панелях для культивирования (24, 12, 6 — луночные). Посевная концентрация клеток составляла 600-800тыс./мл ростовой среды.
В качестве ростовой среды для культивирования клеток использовали синтетическую питательную среду постоянного состава RPMI-1640 с добавлением 2 мл глютамина, 8мг гентамицина (4%), 0,5мл амфотерицина В на 100 мл среды, пенициллина 100 ед./мл, стрептомицина в количестве 100 мкг/мл и 5-7% эмбриональной сыворотки плода крупного рогатого скота.
Клеточную культуру помещали в CCh-инкубатор с заданными параметрами температуры 37С и поступления газов (CCh - 5%), при влажности 70%. Процесс роста клеток в питательных средах контролировали под инвертированным микроскопом. Поскольку получение полноценной популяции возможно только от культуры, состоящей из жизнеспособных клеток, то перед каждым пассажем проводили просмотр и оценку качества клеток в монослое.
Отбор клеточных метаболитов производили на 7-10 день культивирования в период формирования монослоя с помощью автоматической пипетки, причем после каждой манипуляции проводили замену наконечника.
Субкультивирование клеток. По мере нарастания клетки рассевали на новые планшеты или чашки с коэффициентом рассева не более 1:3, т.к. первично - перевиваемые культуры обладают слабыми пролиферирующими свойствами. Для этого ростовую среду отбирали в чистые пенициллиновые флаконы, клетки промывали в ФСБ для полного удаления сыворотки, заливали смесью 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена, подогретой до 30-32С (в соотношении 1:9) на 5 минут до полного открепления клеток от субстрата. После тщательного пипетирования одну часть суспензии клеток оставляли для цитологического анализа, а другую использовали для дальнейшего культивирования клеток, получения клеточных метаболитов и оценки их диагностической эффективности.
Получение клеточных метаболитов протосколексов Echinococcus multilocularis, выделение антигеноактивных серий иммуноферментной реакцией (ИФР)
Фиксация Фиксация является самым первым и основным шагом при морфологическом изучении клеток. В качестве фиксаторов необходимо применять лишь вещества, не вызывающие грубых нарушений структуры клеток и несильно искажающие ее прижизненное состояние. При подборе фиксатора следует исходить из цели исследования и помнить, что, так называемых общих фиксирующих веществ очень мало (Кисели, 1962). Фиксаторы и фиксирующие смеси, используемые для фиксации культивируемых клеток протосколексов Е. multilocularis: 100спирт Метиловый спирт (метанол). Смесь Карнуа — состоит из 6 мл абсолютного спирта (100), 3 мл хлороформа и 1мл ледяной уксусной кислоты. Ее готовят только перед работой. Смесь Никифорова - 100 абсолютный спирт + хлороформ (1:1) в равных количествах. Ледяная уксусная кислота-спирт — состоит из 8 мл абсолютного спирта и 2 мл ледяной уксусной кислоты. Хорошо фиксирует ядра клеток, но плохо протоплазму.
Методы окрашивания для определения типа клеток в культуре В литературе описано множество методов окрашивания, пригодных для любых целей, однако в наших исследованиях наиболее информативными и простыми по технике выполнения оказались: Метод №1. Для изучения морфологии клеток в суспензии, полученной после трипсинизации ткани вторичных ларвоцист E.multilocularis и в процессе культивирования, применили методику и технику, используемую при исследовании крови. Клеточную взвесь наносили на сухое, обезжиренное предметное стекло, высушивали на воздухе и фиксировали любыми из ниже перечисленных фиксирующих средств (метанол, смесь Карнуа или смесь Никифорова). Затем ждали пока мазок не высохнет от фиксатора. Далее окрашивали в течение 15-30 минут азур II эозином по Романовскому-Гимза. Споласкивали мазки в дистиллированной воде, высушивали и заключали в канадский бальзам. Метод №2. Для изучения монослоя на покровных стеклах суспензию клеток высевали в чистые, стерильные пенициллиновые флаконы с покровными стеклышками. Концентрация клеток в суспензии не менее 600-800 тыс/мл, объем суспензии 1,5-2 мл. 1. Окраска гематоксилин-эозином. Через определенные промежутки времени (1, 2, 3 и т.д. сутки культивирования) вынимали покровные стекла тонким пинцетом за края, очень аккуратно промывали в теплом растворе Хенкса или физиологическом растворе (рН 7,0-7,2), подсушивали фильтровальной бумагой. a. Стекла с клетками фиксировали 15-30 минут в смеси Карну а (готовят смесь только перед работой). b. После фиксации стекла вновь промывали в растворе Хенкса или физиологическом растворе, подсушивали фильтровальной бумагой и красили гематоксилином по Маллори. Время окрашивания 20 минут. c. Затем промывали стекла в аммиачной воде 1-2 мин (к 200 мл дистиллированной воды добавить 1- 2 капли нашатырного спирта) и подсушивали фильтровальной бумагой. d. Препараты проводили по спиртам возрастающей концентрации: 70о,80,90о,96 и помещали в 0,1%-ный спиртовой раствор эозина на 1 мин, затем в 100 спирт, ксилол 1, ксилол 2. В каждом из спиртов и ксилолах препараты держали по 1 минуте. e. Покровные стекла помещали на предметные стекла и заключали в бальзам. 2. Окраска азур П-эозином по Романовскому-Гимза. После того как покровные стекла вынимали из флакончиков сразу сушили фильтровальной бумагой по краю стекла, а затем: a. Стекла с клетками фиксировали смесью Никифорова или смесью Карнуа около 15 минут. b. После фиксации стекла высушивали на воздухе или фильтровальной бумагой и использовали готовый краситель Романовского-Гимза. c. Препарат погружали в краску на 45 минут. Затем ополаскивали дистиллированной водой и тщательно высушивали. d. Покровные стекла помещали на предметные стекла и заключали в иммерсионное масло.
Окраска монослоя непосредственно в лунках. Для клеток, культивируемых на планшетах в лунках, применяли все обычные методы окрашивания при условии, что фиксатор не растворяет пластик, как например, ацетон. Прекрасные результаты получали при использовании спирта, метанола, смеси Карнуа. Окрашивать клетки можно метиленовым синим, гематоксилин - эозином, азур II-эозином. Время фиксации и окраски выбирали как в методе №1 и №2. Фиксацию, окрашивание и отмывку проводили прямо на планшетах, что дает возможность экономить посуду и свести к минимуму потери реактивов. В процессе окрашивания клетки обычно обезвоживаются. Для того чтобы они восстановили нормальную форму, к ним добавляли каплю иммерсионного масла. Окрашенные клетки исследовали с помощью простого микроскопа МБИ при увеличении (х140), положив планшет на столик микроскопа вверх дном. В тех случаях, когда исследование проводят при больших увеличениях, иммерсионное масло капают на наружную поверхность планшета. Для работы при больших увеличениях (х400) использовали планшеты с плоским дном, поскольку это уменьшает периферические искажения.
Иммунохимическая характеристика клеточных антигенов протосколексов Е. multilocularis
Выделенные иммуноферментной реакцией серии антигеноактивных клеточных метаболитов протосколексов из вторичных ларвоцист альвеолярного эхинококка были исследованы реакцией иммунодиффузии (РИД) для установления наличия в них антигенов паразита. Для этой цели использовали как гипериммунные сыворотки к антигенам соматического экстракта протосколексов паразита, так и сыворотки от больных пациентов альвеолярной формой эхинококкоза и от экспериментально зараженных Е. multilocularis крыс.
Предварительный анализ полученной от 2 кроликов гипериммунной сыворотки в гомологичной системе РИД показал незначительные различия в их активности: в одной регистрировали 6 комплексов антиген-антитело, в другой-5 (табл. 5, рис. 17-21). Таким образом, соматический экстракт протосколексов имеет в своем составе не менее 6 антигенных компонентов, стимулирующих антителогенез у иммунизированных им животных. Анализ антигеноактивных серий клеточных метаболитов протосколексов Е. multilocularis, проведенный РИД с этими сыворотками, показал не более 2-3 комплексов антиген-антитело, представленных достаточно четкими линиями преципитации (рис. 17-22). Причем, как правило, полосы преципитации в количественном и качественном отношении более четко проявлялись в РИД с активной гипериммунной сывороткой.
Исследования, проведенные в РИД (вариант «ряды») 9 выделенных ИФР серий клеточных метаболитов протосколексов различной степени активности с гипериммунной сывороткой к антигенам соматического экстракта протосколексов, показали достаточно четкие различия (рис. 17).
Наиболее активные в ИФР серии (1-3) с указанной сывороткой образовывали 2-3 четкие линии преципитации, менее активные (4-6) не более одной несколько диффузного характера, а последующие три (7-9), активность которых в ИФР бьша очень низкой, в РИД видимых комплексов антиген-антитело не образовывали. Последнее обусловлено, во-первых, недостаточной чувствительностью реакции иммунодиффузии, и, во-вторых, очень низкой концентрацией специфического антигена в этих сериях клеточных метаболитов. Использованные другие варианты РИД («семерка», «тройка») также подтвердили данные ИФР о том, что антигеноактивные серии клеточных метаболитов различаются количественным содержанием специфических антигенов паразита, что влияет на проявление линий преципитации в РИД.
Реакция между исследуемыми сериями клеточных метаболитов и сывороткой больного человека была выражена несколько слабее, хотя количество регистрируемых комплексов антиген-антитело также было не менее двух и зависело от антигенной активности клеточных метаболитов (рис. 19).
Аналогичный анализ, проведенный с сывороткой экспериментально зараженных Е. multilocularis крыс, был сопоставим с результатами, полученными с сывороткой больного человека как в количественном, так и в качественном отношении, но линии преципитации более диффузного характера (рис. 20).
Таким образом, иммунохимический анализ выделенных иммуноферментным тестом антигеноактивных серий клеточных метаболитов показал наличие в них антигенов паразита. Последнее свидетельствует о том, что клетки протосколексов Е. multilocularis в искусственно созданных условиях активно растут и выделяют в среду обитания биологически активные вещества — антигены.
Сравнительную оценку диагностической эффективности клеточных антигенов протосколексов Е. multilocularis в зависимости от типа клеток в культуре мы начинали с оценки эффективности ИФР при использовании в качестве антигенов предварительно выбранные клеточные метаболиты различной степени активности.
С этой целью за основу были взяты 3 антигеноактивные серии клеточных метаболитов: серия А-1 - наиболее активная (ОП с контрольной положительной и отрицательной сывороткой в пределах 1,236— 1,320 и 0,182 - 0,191 соответственно); В-2 - менее активная (ОП с указанными сыворотками 0,768 - 0,804 и 0,198 — 0,201 соответственно) и С-3 - антигенная активность очень слабая (ОП с контрольными сыворотками не более 0,350 - 0,362 и 0,219 - 0,225 соответственно).
Эти выбранные серии клеточных метаболитов были исследованы в ИФР с 73 пробами сывороток людей, результаты которой представлены в таблице 6. Анализ результатов ИФР с клеточными метаболитами протосколексов различной степени антигенной активности при эхинококкозе людей, представленных в таблице 6, показал, что наибольшую чувствительность и специфичность проявили антигены серии А-1. Из 25 сывороток с подтвержденным диагнозом цистной формы эхинококкоза только в трех регистрировали отрицательный результат. Таким образом, чувствительность ИФР в этом случае составила 88,0 %. Все сыворотки людей с подтвержденной альвеолярной формой эхинококкоза прореагировали положительно, т. е. чувствительность была 100%. Что касается специфичности, которую в обоих случаях определяли из расчета проб сывороток людей с гетерологичными инвазиями и клинически здоровых доноров, то она составила 86,7 %. Аналогичный анализ результатов исследований с теми же сыворотками и антигенами двух других серий (В-2, С-3) клеточных метаболитов показал постепенное снижение показателей чувствительности и специфичности иммунотеста: при альвеолярном гидатидозе чувствительность была в пределах 66,7 % и 33,3 %, при цистном - 76,0 % и 56,0 %, а специфичность - 77,8 % и 57,8 % соответственно (рис. 23 а, б, с).
Аналогичный анализ результатов ИФР с теми же сериями клеточных метаболитов (А-1, В-2 и С-3), различающихся по антигенной активности, и сыворотками свиней также показали сходную тенденцию (таблица 7).
Наибольшую эффективность и наилучшие показатели чувствительности и специфичности в ИФР регистрировали с серией А-1. Из 42 проб сывороток свиней с подтвержденным диагнозом цистного эхинококкоза только 9 показали отрицательный результат. Таким образом, чувствительность теста в этом случае составила 76,2 %. Показатели специфичности, оцененные с 48 пробами сывороток животных, инвазированных другими гельминтами и клинически здоровых, были в пределах 70,8 %. В 14 случаях мы регистрировали положительный или сомнительный результат. С двумя другими сериями клеточных метаболитов (В-2 и С-3) с меньшей антигенной активностью результаты исследований, судя по показателям чувствительности и специфичности, диагностическая эффективность ИФР была ниже. Так, с серией В-2 чувствительность иммунотеста составила 66,6 %, а специфичность — 62,5 %. Что касается серии С-3, отличающейся наименьшей активностью антигенов, чувствительность реакции была не выше 52,4 %, а специфичность - 47,9 %.
