Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Химический состав растений рода Hedysarum 7
1.1. Алифатические соединения
1.1.1. Углеводороды и производные циклогексана 8
1.1.2. Спирты, кислоты и их производные 8
1.2. Изопреноиды
1.2.1. Бициклические монотерпеноиды и сесквитерпеноиды 9
1.2.2. Пентациклические тритерпеноиды 10
1.2.3. Тритерпеновые гликозиды (сапонины) 10
1.2.4. Стерины И
1.3. Ароматические соединения
1.3.1. Фенолокислоты 12
1.3.2. Аллильные фенилпропаноиды и другие производные бензола 13
1.3.3. Халконы 14
1.3.4. Бензофураны 15
1.3.5. Ксантоны 15
1.3.6. Кумарины 16
1.3.7. Флавоноиды 16
1.3.8. Изофлавоноиды 18
1.3.9. Птерокарпаны 19
1.3.10. Кумэстаны 20
1.3.11. Антоцианидины иантоцианины 20
1.4. Алкалоиды и другие азотсодержащие соединения 22
1.5. Прочие продукты вторичного метаболизма 23
1.5.1. Моносахариды, дисахариды и полисахариды 23
1.5.2. Свободные аминокислоты и аминокислоты белка 24
1.5.3. Витамины 25
1.5.4. Неорганические элементы 26
1.5.5. Другие продукты вторичного метаболизма 26
1.6. Некоторые вопросы хемотаксономии рода Hedysarum 27
1.7. Биологическая активность соединений растений рода Hedysarum 29
1.8. Применение современных "мягких" ионизационных методов масс-спектрометрии в установлении строения флавоноидов 31
Глава 2. Химический состав экстрактивных веществ из надземной части копеечника щетинистого Hedysarum setigerum Turcz. ex Fisch. Et Meyer 41
2.1. Флавоноиды #. setigerum 41
2.1.1. Флавонолы 42
2.1.2. Флавоны 56
2.2. Изучение флавоноидов, выделенных из Н. setigerum, методами FAB- и MALDI масс-спектрометрии 74
2.3. Идентификация берберина 84
2.4. Идентификация 9'-0-Р-0-глюкопиранозид 4,9,4',9'-тетрагидрокси-3,3'-диметокси-Р8,а8',р7'-циклолигнана 89
2.5. Стерины Н. setigerum 99
2.6. Идентификация гидроксибензойных кислот 103
2.7. Возможные пути биосинтеза некоторых фенольных соединений в растениях рода Hedysarum 104
2.8. Биологическая активность вторичных метаболитов Н. setigerum 108
Глава 3. Экспериментальная часть 110
3.1 Методы исследования 110
3.2. Хроматографические методы 113
3.3. Экстракция Hedysarum setigerum и первичное разделение экстракта 115
3.4. Выделение агликонов и гликозидов флавоноидов 117
3.4.1. Кверцетин, кверцитрин 117
3.4.2. Изорамнетин 118
3.4.3. З-Метоксикемпферол, кемпферол-З-О-а-Ь-арабинофуранозид, авикулярин 119
3.4.4. Необудоффицид, роифолин, лоницерозид, рутин 120
3.4.5. Линарин, диосмин 123
3.5 Выделение гидроксибензойных кислот 124
3.6 Выделение берберина 125
3.6.1. Получение йодида берберина 126
3.7 Выделение 9'-0-Р-0-глюкопиранозид 4,9,4',9'-тетрагидрокси-3,3'- диметокси-Р8,а8',Р7,-циклолигнана 126
3.8. Выделение фракции стеринов 127
3.8.1. Ацетилирование стеринов 128
Выводы 129
Список цитируемой литературы 132
Приложение 145
- Спирты, кислоты и их производные
- Алкалоиды и другие азотсодержащие соединения
- Изучение флавоноидов, выделенных из Н. setigerum, методами FAB- и MALDI масс-спектрометрии
- Экстракция Hedysarum setigerum и первичное разделение экстракта
Введение к работе
Химии принадлежит ведущая роль в деле создания новых лекарств. В последнее десятилетие, несмотря на огромное количество синтетических фармацевтических средств, неуклонно возрастает интерес к привлечению химии природных соединений для создания лекарственных препаратов на основе растительного сырья, обладающих эффективным действием.
Одна из наиболее актуальных и нерешенных проблем - лечение внутриклеточных инфекций. В настоящее время, практически нет надежных способов борьбы с хламидиозом и такими вирусными инфекциями, как гепатит С. Тем не менее, в народной медицине накоплен значительный положительный опыт борьбы с заболеваниями вирусной природы с использованием лекарственных растений, в частности, растений из рода Hedysarum (копеечник) [1-3].
Работами Куваева В.Б. и др. [4] и Смирновой Л.П. и др. [5] показано, что противовирусное действие копеечников секции Obscura обуславливает гликозилированный ксантон - мангиферин.
Виды растений рода Hedysarum других секций (Fruticosa В. Fedtsch, Spinosissima В. Fedtsch., Multicaulia Boiss, Crinifera Boiss., Subacaulia Boiss) no литературным данным не содержат мангиферин, но также обладают противовирусным действием. Поэтому актуальной задачей является изучение химического состава копеечников вышеперечисленных секций. Эти исследования позволят выделить и установить структуры вторичных метаболитов, которые определяют противовирусное действие копеечников, а также могут служить хемотаксономическими маркерами внутри секций.
В качестве объекта исследования был выбран ранее неизученный вид Н. setigerum Turcz. ex Fischer et Meyer (копеечник щетинистый), принадлежащий к малоисследованной секции Multicaulia Boiss. Этот вид имеет достаточно широкие ареалы обитания в Западной, Средней и Восточной Сибири.
Выделение индивидуальных соединений из экстракта надземной части Н. setigerum осуществляли методами препаративной хроматографии на различных сорбентах. Изучение их строения проводили спектральными методами с
5 привлечением ID и 2D ЯМР спектроскопии, в ряде случаев с использованием необходимых химических превращений.
Для определения молекулярной формулы выделенных соединений использовали метод масс-спектрометрии высокого разрешения (HR-MC), а для изучения фрагментации труднолетучих гликозидов современные «мягкие» (soft) методы ионизации - FAB и MALDI масс-спектрометрии. Учитывая, с одной стороны, новизну интерпретации этими методами фрагментации агликоновой части гликозидов, и, с другой стороны, значительное число выделенных нами соединений -интересной задачей явилось изучение особенностей масс-спектрального распада гликозидов флавоноидов. Таким образом, целью нашей работы явилось:
- исследование химического состава и установление физико-химическими и
спектральными методами структуры соединений, выделенных из надземной
части копеечника щетинистого;
- изучение закономерностей фрагментации, выделенных гликозидов
флавоноидов, «мягкими» методами масс-спектрометрии (FAB и MALDI);
выявление биологически активных веществ обуславливающих противовирусное действие копеечника щетинистого.
В результате проведенных исследований нами в надземной части Н. setigerum идентифицировано 20 соединений. Доминирующими компонентами являются флавоноиды и их гликозиды, стерины и фенолокислоты. Несмотря на большое число химически изученных ранее видов копеечника (более 40 видов), нами впервые обнаружены в роде Hedysarum восемь флавоноидов и два стерина. Интересно отметить, что выделенный тригликозид метоксифлавона (необудоффицид) является вторым примером нахождения этого соединения в природе.
Об обнаружении в растениях рода Hedysarum алкалоидов и лигнанов ранее в научной литературе не сообщалось. Нам удалось препаративно выделить и идентифицировать алкалоид протоберберинового и лигнан тетрагидронафталинового типов.
В ходе масс-спектрометрического анализа гликозидов флавоноидов «мягкими» методами масс-спектрометрии исследованы некоторые закономерности их фрагментации.
В рамках биогенеза растений рода Hedysarum рассмотрены пути биосинтеза некоторых фенольных соединений растений этого рода. На основании полученных результатов предложены группы соединений, в частности флавоны, ранее не выделенные из этого рода, но ожидаемые по рассмотренным путям биосинтеза. Нами найдены представители этой группы соединений, ранее не обнаруженные ни в одном из растений рода Hedysarum.
Диссертация состоит из трех глав: литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части.
Литературный обзор посвящен химическому составу растений рода Hedysarum и охватывает литературу вплоть до 2004 года. Кроме того, в него включены вопросы хемотаксономии рассматриваемого рода и раздел по применению «мягких» ионизационных методов масе-спектрометрии в установлении строения флавоноидов. В приложении приведена таблица по распределению вторичных метаболитов в растениях рода Hedysarum.
Спирты, кислоты и их производные
В составе легколетучих соединений из корней Я. polybotrys Чен Яаози с соавторами [43] методом капиллярной ГЖХ-МС идентифицировали 2 І метилгексадекан (1) и окт-1-ен (2). В растительном мире достаточно широко распространены простые производные циклогексана, в частности циклогексановые полиолы, иначе называемые циклитолами. Из надземной части Я. multijugum Maxim., Я. alpinum L., Я. coronarium L. был выделен циклитол - D-пинитол (3), который представляет собой метиловый эфир шестиатомного спирта D-хиро-инозитола [19, 24, 38]. Из Я. multijugum Ванг Вей с соавтр. выделили алифатический спирт - 1 триаконтанол (7), который относится к стимулятором роста растений [55]. В составе растений рода Hedysarum были идентифицированы различные насыщенные и ненасыщенные (с одной, двумя и тремя двойными связями) карбоновые кислоты и их производные - глицериды, метиловые эфиры.
Лотти Гоффредо установил с помощью ГЖХ, что в семенах Н. coronarium содержится 11,7 % масла, в состав которого входят глицериды различных карбоновых кислот: насыщенных - миристиновой (С13Н27СООН, следы), пальмитиновой (С,5Н3іСООН, 9-23 %), стеариновой (С7Н35СООН, 0,2-6,3 %) и ненасыщенных -олеиновой (Д9-18:1, 3-32 %), линолевой (А9 ,2-18:2, 12-69 %) и линоленовой (Д912 15-18:3,2-42%) [15].
Спустя более двадцати лет после этой работы появились сообщения о выделении из корней Н. polybotrys лигноцериновой (8), стеариновой (9) и каприновой (10) кислот, а также метиловых эфиров пальмитиновой (11), стеариновой (12), бегеновой (13), 10,12-октадекадиеновой (15) и линоленовой (16) кислот [36, 41, 43, 46].
Чен Ю. и др. в корнях Н. polybotrys идентифицировали методом ГЖХ-МС бициклические монотерпеноиды (17-18) и сесквитерпеноид (19) [43]. По типу углеродного скелета моноизопреноиды фенхон (17) и 4-метил-1-изопропилбицикло[3.1.0]гексан-2-он (18) относятся к типу фенхана и туйана соответственно. Сесквитерпен (19) принадлежит к гваяновому типу с углеродным скелетом пачулана. Содержание в корнях изопреноидов (17-19) достигает 0.6, 2.7 и 1.6 % соответственно .
Китайские исследователи Ли Юнсен и др. [54] идентифицировали в составе Н. sikkimense изопреноид - лупеол (20), который является пентациклическим тритерпеновым спиртом и относится к ряду лупана. Вещества этого ряда достаточно редко встречаются в природе, но отдельные представители, в частности лупеол, относятся к широко распространенным в растительном мире изопреноидам. Эта же группа исследователей идентифицировала в составе Н. sikkimense урсоловую кислоту (21), которая относится к ряду урсана [54]. Из другого вида копеечника Н. multijugum Ванг Вэй и др. выделили и идентифицировали с помощью спектральных методов бетулиновую кислоту (22) (табл. 3) [53]. 21 22
По результатам литературного поиска известно, что сапонины содержатся в надземной части и корнях некоторых видов копеечников (табл. 3). Их обнаружение в растениях (Я. alpinum, Н. dahuricum Turcz., Н. gmelini Ledeb.) было проведено групповым анализом по реакции пенообразования или гемолитической активности [59]. Индивидуальный сапонин (23) выделен Е.А. Хамидуллиной с соавторами из надземной части Н. alpinum. Это пентациклический тритерпеновыи сапонин олеананового ряда, в котором в качестве генина представлен соясапогенин В, гликозилированный по третьему положению D-глюкуроновой кислотой, D-ксилозой и L-рамнозой. Установление структуры, выделенного астрагалозида VIII, проведено с помощью химических (кислотный гидролиз) и физико-химических методов, включая 2D ЯМР-спектроскопию и FAB-масс-спектрометрию [24]. H V Ма К. и др. идентифицировали методом ВЭЖХ астрагалозиды I, II, III, IV (24-27) в корнях Н. polybotrys. В качестве генина для вышеперечисленных астрагалозидов выступает 9,19-циклоланостан - циклоастрагенол, гликозилированный в третьем и шестом положениях D-ксилозой или ее ацетатными производными и D-глюкозой [26].
В составе копеечников обнаружены два свободных стерина - (3-ситостерин (28) и стигмастерин (29), а также р-ситостерин-З-О-р-О-глюкозид (30). Несколько групп китайских исследователей [40, 41, 46, 57] выделили Р-ситостерин из корней Н. polybotrys, содержание которого в корнях дикого и культивируемого видов оказалось одинаковым [41]. Также Р-ситостерин был идентифицирован в Н. sikkimense на основе физико-химических свойств и спектральных данных [54], а в Н. multijugum обнаружены оба стерина 28,29 (табл. 3) [53, 55].
По поводу фенолов 47 и 56 авторы настоящего обзора позволят себе сделать следующее замечание. Соединения 47 и 56 применяются в промышленности как синтетические антиоксиданты. Однако для того, чтобы выяснить являются ли эти соединения нативными метаболитами растения или внесенными в процессе выделения артефактами, необходимы специальные исследования, которых авторы работ не проводили.
По результатам литературного поиска можно сказать, что систематического исследования халконов рода Hedysarum не проводилось. Имеется всего лишь две работы о выделении и установлении строения халкона - изоликвиритигенина (58) из корней Н. polybotrys (табл. 3) [51, 57].
Тошио Миясе и др., исследуя химический состав Н. polybotrys, обнаружили в этилацетатной фракции метанольного экстракта корней два 2-арилбензофурана - 5-гидрокси-2-(2-гидрокси-4-метоксифенил)-6-метоксибензофуран (59) и 6-гидрокси-2-(2-гидрокси-4-метоксифенил)-бензофуран (60) [51]. Первое из вышеперечисленных соединений было выделено впервые, его строение установили на основании данных УФ, 2D ЯМР спектроскопии и масс-спектрометрии. В составе легколетучих соединений из корней того же вида копеечника методом ГЖХ-МС в количестве 4.8 % был идентифицирован 7-метилбензофуран (61) (табл. 3) [43]. 60 61
Наиболее богаты ксантонами, которые являются производными дибензо-у-пирона, растения семейств горечавковые (Gentianaceae), зверобойные (Guttiferae), истодовые (Polygalacea). Исключением является ксантоновый С-гликозид -мангиферин (62), выделенный из многих растений разных семейств [60]. Мангиферин был найден в надземной части 17 видов растений рода Hedysarum (табл. 3) [8, 21, 22, 61-71]. Кроме него в копеечниках были идентифицированы также еще три С-гликозида (изомангиферин, глюкомангиферин, изоглюкомангиферин).
Повышенный интерес к поиску мангиферина в растениях связан с его высокой биологической активностью, что представляет несомненную важность для практической медицины [5]. Работой В.Б. Куваева и др. [4] было показано, что мангиферин содержится в растениях рода Hedysarum в основном в секции Obscura В. Fedtsch. и одновременно с ним присутствует его изомер - изомангиферин (63), что может служить хемотаксономическим маркером принадлежности к этой секции. Нахождение мангиферина и изомангиферина в Н. cephalotes Franch., подтвержденное повторными анализами, требует рассмотрения целесообразности его включения в секцию Subacaulia Boiss. Не изучалась лишь секция Spinosissima В. Fedtsch., представленная в России единственным видом Н. jlexuosum, произрастающим в Крыму в качестве заносного вида. Содержание изомангиферина в надземных частях растений по сравнению с мангиферином значительно меньше (табл. 3). Из Н. flavescens Regel et Schmalh. В.И. Глызиным и др. [72] были впервые выделены также глюкомангиферин (64) и глюкоизомангиферин (65).
Алкалоиды и другие азотсодержащие соединения
К настоящему времени алкалоиды обнаружены в надземной части и корнях девяти видов растений рода Hedysarum - Н. neglectum, Н. semenovii, Н. alpinum, Н. inundatum, Н. denticulatum, Н. flavescens, Н. dahuricum, Н. baldshuanicum, Н. polybotrys (табл. 3). Сведения о наличии алкалоидов в растениях были основаны на качественных реакциях и только в работе [43] приводятся данные об идентификации четырех алкалоидов методом ГЖХ-МС.
В надземной части Н. semenovii обнаружено 0,02% алкалоидов, а в корнях до 0,05 % [8]. Н. flavescens содержит больше алкалоидов - в корнях 0,07%, в стеблях 0,09%, а в листьях и соцветиях 0,23% [79].
Следы алкалоидов были обнаружены в надземной части Н. inundatum у экземпляров собранных со скал горнотаёжного пояса в результате работы экспедиции по исследованию алкалоидоносности флоры Центральных Саян [80]. Анализ осуществляли посредством реактива Вагнера, после перевода алкалоидов в соли 10% уксусной кислотой.
В корнях Н. polybotrys также содержатся алкалоиды, и количество их одинаково как у дикого так и культивируемого вида [40]. Чен Яоцу и др. методом ГЖХ-МС идентифицировали в корнях этого же вида производные азиридина (96), пиразола (97), пиримидина (98) и [1,2,4] триазоло [4,3-а] пиразина (99), а также амид (100) и о-толунитрил (101), в процентном отношении 0.8, 0.8, 2.0, 7.5, 0.4 и 1.2 соответственно [43]. Интересно отметить, что производные азиридина встречаются крайне редко, но могут входить в состав более сложных молекул [77].
В корнях Н. neglectum присутствует алкалоид цитизин (102) (табл. 3) [81]. Он является производным хинолизидина, который составляет структурную основу нескольких групп алкалоидов, в том числе весьма распространенных в природе. Особенно богаты ими бобовые растения. CH3 UNJ CH3 ГТ
Н.С. Павлова исследовала шесть видов дальневосточных копеечников: Н. hedysaroides Schinz. et Thell., H. sachalinense В. Fedtsch., H. alpinum, H.ussuriense J. Schischk. et Kom., H. branthii Trautv. et C.A. Mey., H. dasycarpum [82]. В ходе работы было установлено, что в надземной части и корнях растений содержатся крахмал и другие полисахариды. В продуктах кислотного гидролиза были обнаружены глюкоза, арабиноза, рамноза, ксилоза, галактоза и галактуроновая кислота.
В.Е. Киселев и Е.Г. Пеккер [83] исследовали углеводы в надземной части и семенах других пяти видов копеечников: Н. consanguineum , Н. theium Krasnob., Н. neglectum, Н. gmelini, Н. ferganense. Согласно их данным в этих видах присутствуют: редуцирующие сахара 2-11 %, моносахара 1-8 % и дисахара 0.1-2 % от массы абсолютно сухого растения. Анализ выполняли йодометрическим методом, редуцирующие сахара определяли по методу Бертрана [84]. Ранее Е.Г. Пеккер (1976) проводил биохимическое исследование выше указанных видов копеечников, за исключением Н. theium, и сообщил, что в листьях, соцветиях и семенах содержатся моносахара и сахароза [85].
Работы иностранных исследователей по изучению углеводов растений рода Hedysarum охватывают менее обширный круг копеечников. Саура-Каликсто идентифицировал в составе Н. coronarium полисахариды и фруктозу (табл. 3) [38]. Статья Солтани Абделазиза посвящена изучению углеводного метаболизма Н. coronarium культивируемого в присутствии хлорида натрия. Авторы делают вывод о том, что сахароза играет значительную роль в осморегуляции растения [11]. Лан Зонгфен и др. выделили из корней Н. polybotrys биологически активные полисахариды, в гидролизате которых идентифицировал методом БХ и ТСХ D-глюкозу, D-рамнозу, D-галактозу, L-ксилозу и галактуроновую кислоту [44]. Другие исследователи [29] получили водорастоворимый полисахарид из корней Н. polybotrys. Он представляет собой разветвленный глюкан, в котором остатки глюкозы в главной цепи соединены 1-4 связью, а разветвления происходят по положению 6 остатков глюкозы в главной цепи. Сделанные выводы основаны на данных ИК и ЯМР, а также реакции метилирования, периодатном окислении и расщеплении по Смиту. Ванг Руи и др. идентифицировали в корнях Н. polybotrys сахарозу [41], а Ли Юнсен с соавтр. сообщили об идентификации сахарозы в составе Н. sikkimense (табл. 3) [54].
Е.Г. Пеккер и В.Е. Киселев наиболее детально изучили свободные аминокислоты и аминокислоты белка пяти видов копеечников: Н. consanguineum, Н. theium, Н. neglectum, Н. gmelini, Н. ferganense [83, 86]. Изучение качественного состава аминокислот в надземной части показало, что он остается постоянным независимо от условий произрастания и включает 16 свободных аминокислот и 18 аминокислот белка (табл. 3), сюда входят все незаменимые природные аминокислоты, составляющие 40% от суммы аминокислот. Содержание отдельных аминокислот варьирует в различной степени. В листьях преобладают пролин, аланин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты, аспарагин. В цветках свободных аминокислот больше в 1,2-1,7 раз, при этом значительно увеличивается количество гистидина, аспарагиновой кислоты, аланина и пролина. В стеблях свободных аминокислот в 1,2-1,5 раза меньше, чем в листьях, и в 1,6-2,2 раза меньше, чем в цветках. При этом в максимальных концентрациях обнаружены те же аминокислоты, что и в листьях и цветках. Из аминокислот белка для всех видов характерны значительные количества аспарагиновой и глутаминовой кислот, аланина, пролина, глицина и серина. В цветках общее количество белковых аминокислот уменьшается в 1,1-1,4 раза по сравнению с листьями, но степень уменьшения содержания отдельных аминокислот различна. В больших количествах в этих органах накапливаются те же аминокислоты, что и в листьях. В стеблях найдено в 1,3-2 раза, а в цветках в 1,1-1,4 раза меньше аминокислот белка, чем в листьях. Наибольшее накопление свободных аминокислот и аминокислот белка происходит к периоду бутонизации растений, а с наступлением репродуктивной фазы развития и далее идет их закономерное уменьшение. Аминокислотный состав растений определяли с помощью бумажной хроматографии [83, 86]. Работы иностранных исследователей по изучению аминокислотного состава растений рода Hedysarum охватывают период с середины 60-х до конца 90 -х годов и касаются шести видов растений.
В составе копеечников обнаружены канаванин (Я. alpinum - семена [8], Я. carnosum - цветы [13], Я. polybotrys [33]), у-аминомаслянная кислота (Я. vicioides Turcz. - корни - 0.01-0.013% [52], Я. coronarium - корни [11], Я. polybotrys - надземная часть 0.09% [20, 31, 33, 52]). В надземной части Я. coronarium также идентифицированы серии, аланин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты, пролин [И] и метионин [14], Я. carnosum содержит пролин [13], Я. polybotrys пролин, цистин, аргинин и глутаминовую кислоту (табл. 3) [27,33,37,40].
Изучение флавоноидов, выделенных из Н. setigerum, методами FAB- и MALDI масс-спектрометрии
В процессе исследования химического состава надземной части Hedysarum setigerum нами выделены и изучены методом FAB+ и MALDI+ масс-спектрометрии 12 флавоноидов (агликоны, гликозиды флавонолов и гликозиды флавонов). При этом преследовали цель - установить пути фрагментации агликоновой части флавоноидов и по возможности проследить закономерности образования ионов Y, Y0, Zb Y в зависимости от строения агликона, места гликозилирования и межгликозидной связи. Выбор этих двух методов ионизации масс-спектрометрии был основан на том, что наибольшее число последних работ посвящено изучению фрагментации флавоноидов методом ESI, а меньшее - методами FAB и MALDI масс-спектрометрии. В масс-спектрах флавоноидов положительных ионов наблюдается образование значительного числа фрагментарных ионов, которые и представляют наибольший интерес в нашем исследовании, а в масс-спектрах отрицательных ионов часто присутствует только молекулярный ион или незначительное число осколочных ионов. В связи с этим для исследования выбрали FAB+ и MALDI+ масс-спектрометрию.
В FAB масс-спектрах практически всех флавоноидов присутствовали фрагментные ионы соответствующие отрыву ОН, Н20, СО, СО2, НСО от молекулярных ионов [М+Н] и [M+Na] (табл. 14). Фрагментация агликоновой части в 3-О-замещенных флавонолах протекала по направлениям: I, II, III, IV, VI, VII и VIII (табл. 14, рис. 18), с образованием ионов различной интенсивности. При этом в масс-спектрах этой группы флавоноидов не наблюдали общих закономерностей при фрагментации у-пиронового кольца.
Для 7-О-замещенных флавонов и метоксифлавонов при распаде у-пиронового кольца наиболее характерен разрыв углерод углеродных связей по положениям 1-9, 4-10 (путь I) и 1-9, 3-4 (путь II). Но в тоже время, в масс-спектрах этой группы флавоноидов наблюдали осколочные ионы, образующиеся по путям III, IV, VI, VII и VIII, с относительной интенсивностью от 9 до 40% (табл. 14, рис. 19).
Практически для всех гликозидов флавоноидов удалось получить FAB+ масс-спектры, за исключением лоницерозида. Только в FAB масс-спектре лоницерозида наблюдали образование устойчивых фрагментных ионов при распаде кольца С по направлениям I, II и IV, при этом осколочный ион, образующийся по пути II, имел 100% относительную интенсивность .
Таким образом, на основании собственных и литературных [106] данных можно сделать вывод о том, что фрагментация у-пиронового кольца по пути I или IV, с образованием осколочных ионов различной интенсивности, протекает для большинства гликозидов флавоноидов и не зависит от их принадлежности к флавонам, флавонолам или флаванонам. Распад агликоновой части флавоноида по другим направлениям, вероятно, зависит не только от химической структуры соединения, но и способа ионизации молекулы. Хугхес Д. и др. в своей работе [106] отмечают, что преобладающая фрагментация агликона по пути II и III наблюдается только в ESI+ масс-спектрах кемпферола и апигенина соответственно. В нашем случае, в FAB+ масс-спектрах производных кемпферола фрагментация у-пиронового кольца по пути II отсутствует, но наблюдается в масс-спектрах гликозидов акацетина (линарин, необудоффицид), апигенина (роифолин), лютеолина (лоницерозид) и диосметина (диосмин). А распад агликоновой части по пути III осуществляется не только для гликозидов апигенина (роифолин), но и кверцетина (авикулярин, рутин), что согласуется с данными работы [108] по ESI+.
Фрагментация углеводной части всех гликозидов флавоноидов, протекала с отщеплением углеводных единиц. При этом в масс-спектрах наблюдали типичные ионы - Yo (агликон), соответствующий отрыву всех углеводных остатков и Y, соответствующий отрыву терминального углевода, кроме, кемпферол-3-O-a-L-арабинофуранозида, в спектре которого присутствовал лишь ион Z0, соответствующий отрыву терминального остатка углевода вместе с атомом кислорода гликозидной связи. В спектрах некоторых флавоноидов присутствовали также пики ионов 2Х0, 4Х0,3 4Х0 (табл. 14, рис. 20).
Ион Zi присутствовал только в масс-спектрах рамнозил-(1- 6)-глюкозидов (рутинозидов). Аналогичные данные получены при исследовании перметилированных флавоноидов методом LSI+ масс-спектрометрии [105]. В FAB" масс-спектре лоницерозида фрагментация углеводной части протекала только с разрушением углеводных циклов с образованием ионов 0,Х, 12Х0,15Хо, 0,Хо (рис. 20). Основываясь на данных работы [109] по ESI масс-спектрам флавоноидов мы установили, что в FAB+ масс-спектрах, исследуемых нами флавоноидов, образование осколочных ионов Y (отрыв внутреннего углеводного остатка) и Y0, Y протекает практически аналогично. Так отсутствие интенсивного иона Y в масс-спектрах всех выделенных из Hedysarum setigerum флавоноидов указывает на то, что агликоны представлены флавонами или флавонолами, но не флаванонами, в спектрах которых ион Y основной (рис. 21). Ион Y наблюдали только в спектре рутина, что не противоречит данным работы [110].
Экстракция Hedysarum setigerum и первичное разделение экстракта
Сбор копеечника щетинистого {Hedysarum setigerum) осуществляли в июле в фазу цветения на западном побережье озера Байкал (Ольхонский район) в нескольких километрах от устья реки Сарма, а затем высушивали на воздухе в тени. Сырье (2.2 кг) исчерпывающе экстрагировали 80 % метанолом (4x14 л) при комнатной температуре, продолжительность настаивания не менее 3 суток. Метанол отгоняли под вакуумом при температуре не более 60С. Сконцентрированный водно-метанольный экстракт (375.04 г) обрабатывали хлороформом (4 х 1 л). Хлороформные фракции упаривали (26.34 г). Водный остаток экстрагировали н-бутанолом (7x1 л). Бутанольные фракции объединяли и упаривали (82.32 г). Упаренный бутанольный экстракт хроматографировали на полиамидном сорбенте (соотношение сорбент:вещество - 10:1, колонка - h 35 см, d 8 см), элюируя системами 12,14-29 (рис. 28). При стоянии из водно - метанольного экстракта, после обработки хлороформом, выпал осадок темно коричневого цвета. Его отделили (9.3108 г), а затем хроматографировали на "флеш - колонке" с силикагелем (0.045 мм, 15 г) в системе 1. Полученные фракции объединили (10.2 мг) и хроматографировали на колонке (h 15 см, d 1.2 см) с полиамидным сорбентом (0.25 мм, 10 г). В системе 19 было выделено ярко - желтое вещество I (6.5 мг). Продолжая элюцию системой 1 с "флеш - колонки" собрали фракции (107.4 мг) содержащие преимущественно соединение II. Очистку проводили сначала на полиамидной (0.25 мм, 30 г) колонке (h 30 см, d 2 см) в системах 12, 19, 23 и 28. Фракции (53.7 мг) содержащие флавоноид II полученные в системе 19 хроматографировали на колонке (h 25 см, d 1 см) с силикагелем (0.056 мм, 2 г), элюируя последовательно 2, 3, 5 и 10% метанолом в хлороформе. В итоге выделили соединение II (10 мг).
Кверцетин (І). С5Но07, т.пл. 302 С (из Et20), Лит. данные: т.пл. 302-304 С [143]. УФ-спектр (ЕЮН), Хтах/нм: 256, 374. ИК-спекгр (KBr), V/CM-1: 3400, 3290, 3200, 1650, 1600, 1500, 1310, 1290, 1170, 1000, 800, 620. Спектр ЯМР Н (ДМСО, 5, м.д., J, Гц): 6.19 (д, J=1.6 Гц, 1Н-6); 6.40 (д, J=1.6 Гц, 1Н-8); 6.86 (д, J= 8.5 Гц, 1Н-5 ); 7.54 (дд, J= 8.5, 1.9 Гц, 1Н-6 ), 7.70 (д, J= 1.9 Гц, 1Н-2 ), 12.46 (с, ОН-5). Спектр ЯМР ,3С (ДМСО, 5, м.д.): 146.78 (С-2); 135.71 (С-3); 175.82 (С-4); 160.71 (С-5); 98.16 (С-6); 163.90 (С-7); 93.30 (С-8); 156.20 (С-9); 102.99 (С-10); 121.95 (C-V); 115.04 (С-2 ); 145.02 (С-3 ); 147.60 (С-4 ); 115.58 (С-5 ); 119.96 (С-6 ) [114]. Данные HR-FAB+ и FAB+ масс-спектров приведены в таблице 14. Кверцитрин (II),C2iH2oO,,, т. пл. 181-183 С (МеОН), [a]22D -62.5 (с 0.98; МеОЩ Лит. данные: т. пл. 182-184 С [144], [a]20D -30.0 (с 0.3; ДМФА) [145]. УФ-спектр (ЕЮН), ах/нм: 256, 353. ИК-спектр (KBr), V/CM"1: 3500, 3300, 3000, 1660, 1600, 1500, 1360, 1200, 1080, 970, 810. Спектр ЯМР Н (ДМСО, 5, м.д., J, Гц): 6.18 (д, 118 J=2.1 Гц, 1H-6); 6.37 (д, J=2.1 Гц, 1H-8); 6.86 (д, J= 8.2 Гц, 1H-5 ); 7.25 (дд, J= 8.2, 2.1 Гц, 1H-6 ); 7.27 (д, J= 2.1 Гц, 1H-2 ); 12.62 (с, OH-5); 5.23 (д, J=1.2 Гц, 1Н-1"); 3.95 (дд, J=3.1, 1.2 Гц, 1Н-2"); 3.50 (дд, J=8.9, 3.1 Гц, 1Н-3"); 3.16 (м, 1Н-4"); 3.23 (м, 1Н-5"); 0.81 (д, J= 5.6 Гц, ЗН-6"). Спектр ЯМР ,3С (ДМСО, 5, м.д.): 156.52 (С-2); 134.28 (С-3); 177.81 (С-4); 161.4 (С-5); 98.76 (С-6); 164.25 (С-7); 93.73 (С-8); 157.39 (С-9); 104.15 (С-10); 120.81 (С-Г); 115.71 (С-2 ); 145.25 (С-3 ); 148.49 (С-4 ); 115.53 (С-5 ); 121.21 (С-6 ); 101.88 (С-Г); 70.12 (С-2 ); 70.65 (С-3 ); 71.24 (С-41); 70.42 (С-5 ); 17.54 (С-6 ) [114]. Данные HR-FAB+ и FAB+ масс-спектров приведены в таблице 14.
Из фракций, полученных при элюировании бутанольных извлечений на полиамидной колонке (рис. 1) системой 25, при стоянии выпал ярко - желтый осадок, который отделили и провели доочистку препаративной ТСХ в системе 11 на силикагелевой пластинке. Получили вещество III (11.8 мг).
Изорамнетин (III).Ci6Hi207, т.пл. 299-300 С (МеОН), Лит. данные: т.пл. 301-304 С [143]. УФ-спектр (ЕЮН), Хтах/ны: 255, 369. ИК-спектр (KBr), v/cm"1: 3471, 3400, 3307, 2920, 2851, 1653, 1599, 1559, 1505, 1362, 1257, 1161, 1091, 795. Спектр ЯМР Н (ДМСО, 5, м.д., J, Гц): 3.86 (с, ОСН3-3 ), 6.22 (д, J=2.0 Гц, 1Н-6), 6.50 (д, J=2.0 Гц, Н-8), 6.96 (д, J=8.6 Гц, Ш-5 ), 7.72 (дд, J=8.6, 2.0 Гц, 1Н-6 ), 7.78 (д, J=2.0 Гц, 1Н-2 ) 9.40 (уш с, ОН-3 ), 9.70 (уш с, ОН-4 ), 10.80 (уш с, ОН-7 ), 12.47 (с, ОН-5). Спектр ЯМР 13С (ДМСО, 5, м.д.): 147.81 (С-2), 136.25 (С-3), 176.31 (С-4), 161.12 (С-5), 99.66 (С-6), 164.39 (С-7), 94.04 (С-8), 156.61 (С-9), 103.46 (С-10), 122.42 (С-Г), 115.99 (С-2 ), 147.06 (С-31), 149.26 (С-4 ), 112.19 (С-5 ), 122.15 (С-6 ), 56.23 (ОСН3-3 ) [114].
Авикулярин (VI) С2оН,80,,, т.пл.208-209 С (МеОН), [a]20D -191.8 (с 0.5; МеОН), Лит. данные: т.пл. 210-212 С, [a]20D -175.0 (EtOH) [147]. УФ-спектр (МеОН)Дтах/нм: 257, 355. ИК-спектр (КВг), v/cm 1: 3411, 3125, 2916, 1653, 1608, 1362, 1199, 1044, 1005, 946, 647. Спектр ЯМР !Н (ДМСО, 8, м.д., J, Гц): 6.20 (д, J=2.0 Гц, 1Н-6), 6.39 (д, J=2.0 Гц, 1Н-8), 7.48 (д, J=2.2 Гц, 1Н-2 ), 6.86 (д, J=8.4 Гц, 1Н-5 ), 7.53 (дд, J=8.4, 2.2 Гц, 1Н-6 ), 12.56 (с, ОН-5), 5.58 (д, J=l.l, 1Н-1"), 4.16 (дд, J=3.6, 1.1 Гц, 1Н-2"), 3.74 (м, 1Н-3"), 3.66 (м, 1Н-4"), 3.35 (м, 2Н-5"). Спектр ЯМР ,3С (ДМСО, 6, м.д.): 156.51 (С-2), 133.64 (С-3), 177.88 (С-4), 161.37 (С-5), 98.78 (С-6), 164.30 (С-7), 93.65 (С-8), 156.95 (С-9), 104.16 (С-10), 121.21 (С-Г), 115.71 (С-2 ), 145.18 (С-3 ), 148.55 (С-4 ), 115.81 (С-5 ), 121.70 (С-6 ), 108.18 (С-Г), 82.23 (С-2"), 77.32 (С-3"), 86.22 (С-4"), 61.05 (С-5") [114]. Данные HR-FAB+, FAB+ и MALDI+ масс-спектров приведены в таблице 14.
Колоночной хроматографией на полиамидном сорбенте бутанольных извлечений в системах 16,17,18,19 и 20 получили ряд фракций. Часть фракций объединили (2.5 г) и подвергли флеш-хроматографии на силикагеле (0.045 мм), соотношение сорбент:вещество - 12:1, элюирующие системы -5, 6, 8 и 9. Фракции полученные в системе 6 объединили (1.467 г) и хроматографировали на колонке (h 40 см, d 2 см) с силикагелем (0.045 мм, 30 г) в системах, 1, 2, 5, 6 и 7. При элюции в системе 5 собрали ряд фракций, которые объединили (638.8 мг) и подвергли флеш-хроматографии на полиамиде (0.25 мм, 12.7 г). В системе 13 получили фракции (448.5 мг), которые затем хроматографировали на слабом анионите (сервацел ДЭАЭ 23 SS в ОН в форме). В результате элюирования системой 16 выделили вещество VII (12.8 мг), в виде светло-желтых кристаллов в форме чешуек. Элюируя далее системами 19 и 21 получили соединение VIII (6.5 мг) в виде светло-желтых игольчатых кристаллов. Флеш-хроматографией на силикагеле в системах 8 и 9 получили фракции, которые объединили (0,4303 г) и далее подвергли колоночной хроматографии (h 40 см, d 2 см) на силикагеле (0,045 см, 30 г). В системе 3 получили вещество IX (21 мг).
Другую часть фракций (1 г) подвергли хроматографии на Sephadex G-10 (24 г, колонка h 20 см, d 2.5 см) в системах 12, 23, 25. Элюирую двумя последними системами собрали фракцию (158.3 мг), которую далее хроматографировали на полиамидном сорбенте (0.025 мм, 2 г, колонка h 14 см, d 2.5 см) в тех же системах. Получили фракцию (56 мг) содержащую сумму двух соединений VIII и X. После ее обработки ацетоном получили в виде нерастворимого в ацетоне осадка фракцию (16.5 мг) обогащенную соединением X.
