Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Литературный обзор 9
1.1 Характеристика одуванчика лекарственного 9
1.1.1 Биологическое описание 9
1.1.2 Состав биологически активных веществ 11
1.1.3 Области использования 28
1.2 Методы выделения биологически активных веществ из растительного
сырья 33
ГЛАВА 2 Объекты и методы исследования 50
2.1 Отбор и подготовка объектов исследования 50
2.2 Методы выделения 50
2.3 Методы исследования 54
ГЛАВА 3 Экспериментальная часть 57
3.1 Характеристика исходных образцов одуванчика 57
3.2 Химический состав эфирных масел 59
3.3 Экстракция водой 63
3.3.1 Влияние условий на выход и групповой состав водорастворимых соединений 63
3.3.2 Химический состав низкомолекулярных водорастворимых .соединений 64
3.4 Экстракция этанолом 67
3.4.1 Влияние концентрации этанола на выход и групповой со став экстрактов 67
3.4.2 Исследование химического состава водно-этанольных экстрактов 72
3.4.2.1 Состав гексановых экстрактов 72
3.4.2.2 Состав фракции водорастворимых соединений 79
3.4.2.3 Состав восков 82
3.5 Сверхкритическая экстракция диоксидом углерода 83
3.5.1 Влияние условий процесса на выход и состав СОг-экстрактов
3.5.2 Влияние природы модификатора на выход и состав СОг-экстрактов 89
ГЛАВА 4 Состав и свойства пектиновых полисахаридов одуваничка 99
4.1. Пектиновые полисахариды надземной части 99
4.2. Пектиновые полисахариды корней 107
4.3 Физико-химические показатели пектиновых полисахаридов 112
Заключение 115
Выводы 126
Список литературы 1
- Состав биологически активных веществ
- Методы выделения
- Химический состав низкомолекулярных водорастворимых .соединений
- Пектиновые полисахариды корней
Состав биологически активных веществ
При исследовании фруктозосодержащих углеводов в образцах одуванчика (Свердловской область) установлено, что в корнях накапливается значительное количество спирто- и водорастворимых углеводов, составляющее 21,5 и 40,8% соответственно [9]. Сделан вывод о том, что синтез полифруктанов, в том числе и инулина, осуществляется в большей степени в корнях. Присутствуют только спирторастворимые, низкомолекулярные фруктаны с содержанием в листьях 3,2%, а в соцветиях - 8,8%. Относительно высокое содержание фруктанов в корнях послужило основанием для рекомендации их в качестве сырья для получения фруктозы.
По данным работы [14] содержание спирто- и водорастворимых фруктанов в корнях Taraxacum officinale Wigg (Бурятия) составляет 15,4 и 28,4% соответственно. Структурные исследования основных компонентов показали, что они являются линейными Р"(2— 1)-фруктофурананами. Олигофруктаны представлены набором (1-Р-фруктофуранозил)п-производных нистозы. Доминирующими компонентами фракции низкомолекулярных фруктанов (рисунок 1.2) являются кестоза (1.2), нистоза (1.3), 1-Р-фруктофуранозилнистоза и 1-0-фруктофуранозил-1-Р-фруктофуранозилнистоза. С учетом результатов исследования фракции спирто- и водорастворимых фруктанов, выделенные из корней одуванчика лекарственного, были рекомендована для получения препаратов гипогликемического и пробиотического действия.
Методом тонкослойной хроматографии в составе спирторастворимой фракции, выделенной из коммерческих образцов одуванчика лекарственного, выявлено присутствие фруктозы, сахарозы, 1-кестозы (1.2) и нистозы (1.3), а также ряда олигомеров с более высокой степенью полимеризации [15]. При изучении динамики выделения компонентов спирторастворимых углеводов установлено, что с наибольшей скоростью 95 %-ным этанолом извлекаются фруктоза и 1-кестоза, с наименьшей - нистоза и более высокомолекулярные олигомеры. При исследовании химического состава корней одуванчика лекарственного, собранного до цветения в Красноярском крае, определение содержания Сахаров проводили только в водорастворимой фракции [10]. Установили, что содержание низкомолекулярных (редуцирующих) Сахаров в корнях одуванчика составляет лишь 8,13% на а.с.м.
Литературные сведения о составе углеводов надземной части одуванчика малочисленны. Из имеющихся в публикациях данных можно сделать вывод о том, что в сравнение с углеводами корней они менее представительны. Содержание моно- и полисахаридов в листьях одуванчика лежит в пределах 1-1,5% [16]. В составе листьев и цветков одуванчика лекарственного, собранных в фазу массового цветения растения в различных районах Украины, методами ТСХ, ВЭЖХ и ГЖХ установлено наличие D-фруктозы, L-рамнозы, D-ксилозы, D-арабинозы и D-галактозы [17]. Выявлено незначительное содержание полисахаридов, которое для соцветий и листьев одуванчика составило 7,7 и 2,8% соответственно.
В составе водорастворимых соединений, выделенных из соцветий одуванчика, наряду с фруктозой обнаружена сахароза, а в составе гидролизата водорастворимых соединений - арабиноза, ксилоза, глюкоза, галактоза [16]. В стеблях одуванчика обнаружена Р-генциобиоза [18]. Установлено, что содержание Сахаров в нектаре цветков Taraxacum officinale изменяется в течение суток [19].
Значительная часть моносахаридов надземной части и корней одуванчика входит в состав гликозидов флавоноидов, стеринов, нуклеотидов, сапонинов, горьких веществ и др.
Пектиновые полисахариды. Широким спектром физиологической активности обладают присутствующие в растительном сырье пектиновые полисахариды, прежде всего, благодаря способности выводить из организма человека тяжелые металлы [20]. Поэтому они используются в медицинской и фармацевтической промышленности, а также в пищевой промышленности в качестве гелеобразователей и загустителей [21]. Согласно современным представлениям [20], линейная часть главной цепи макромолекулы пектиновых полисахаридов состоит из а-1,4-связанных остатков D-галактопиранозилуроновой кислоты с включением остатков a-L-рамнопиранозы, связанных с основной цепью галактуронана а-1,2-связями. Разветвленная часть макромолекулы представлена моносахаридами: глюкозой, галактозой и арабинозой. Содержание пектиновых веществ в растительном сырье, соотношение и содержание кислых и нейтральных структурных фрагментов в их макромолекулах, степень этерификации, комплексообразующая способность и молекулярная масса зависят от многих факторов, в том числе, от вида растений, климатических условий произрастания, сроков сбора, способа и условий извлечения и т.д. [22,23].
Информация о исследовании химического состава и свойств пектиновых полисахаридов одуванчика крайне малочисленна. Имеющиеся литературные публикации посвящены, в основном, изучению пектиновых веществ, выделенных из корней [23].
Установлено [24], что в корнях одуванчика, собранных на территории Томской области и Алтайского края, кроме инулина и инулиноподобных полисахаридов, в относительно большом количестве содержатся кислые полисахариды с молекулярной массой 310 и 700 кДа. Фракции, выделенные из высушенных образцов подкисленной водой с выходом 2,5% на а.с.м., на 99,8% представлены углеводами. В составе полисахаридного комплекса присутствуют, в % отн.: уроновые кислоты - 93,6; белки - 1,17; нуклеиновые кислоты-0,13.
Методы выделения
Летучесть большинства используемых модификаторов находится между летучестью экстрагируемых веществ сверхкритического СОг, а температуры кипения лежит в пределах от 20 до 100 С. В качестве модификаторов обычно используют метанол, этанол, изопропанол, ацетон и воду [133]. В случае пищевых и фармацевтических применений экстрактов, в качестве полярного модификатора применяют этанол. Однако растворимость этанола в сверхкритическом диоксиде углерода невысокая и поэтому имеются ограничения в пределах которых возможно его использование [117].
Мало известно о том, как работают модификаторы и, как следствие, отсутствуют критерии их выбора. Однако, экспериментально установлено значительное улучшение растворимости органических соединений и степени извлечения экстрагируемых веществ из растительного сырья при их использовании. Добавление модификатора повышает выход экстрагируемых веществ при снижении селективности и, вероятно, скорости их извлечения. Последнее обусловлено тем, что при добавлении модификатора в диоксид углерода наряду с повышением плотности возрастает вязкость растворителя и, как следствие снижается коэффициент диффузии [140].
В работе [141] исследована зависимость растворимости салициловой кислоты в сверхкритическом диоксиде углерода от температуры и давления в присутствии 0-7,5% этанола. Показано, что растворимость возрастает пропорционально увеличению количества этанола в смеси. При изучении влияния присутствия в СОг уксусной кислоты и метилацетата на растворимость стеариновой кислоты, установлено, что повышение растворимости при добавлении уксусной кислоты связано с образованием более сильных водородных связей.
В работе [142] исследованы условия сверхкритической С02-экстракции растений рода Климакоптера С. Korzhinshyi (К.Коржинского) с использованием этанола в качестве модификатора. Изменяя его процентное содержание и скорость подачи, при давлении 30-40 МПа и температуре 40 С, можно получать экстракты, содержащие в своем составе полярные компоненты - полифенолы и сапонины.
Показана возможность использования С02 и этанола с целью получения из водорослей сверхкритических экстрактов липидов с относительно высоким содержанием полиненасыщенных жирных кислот, в частности а-линоленовой и линолевой жирных кислот, а также хлорофилла, фукоксанти-на и широко известного антиоксиданта - токоферола (витамин Е) [143]. При извлечении липидно-каротиноидного комплекса из панцирьсодержащих отходов ракообразных методом сверхкритической экстракции с этанолом установлено, что суммарное содержание эйкозапентаеновой и докозогексаеновой кислот возрастало с увеличением концентрации этилового спирта до 10% [144]. Сделано предположение, что это обусловлено повышением растворимости фракции фосфолипидов, содержащих значительное количество указанных кислот, за счет применения полярного сорастворителя. При концентрациях этанола выше 10 % существенного повышения их выхода не наблюдается.
Экспериментально установлено, что высокий выход биологически активных полифенольных соединений при С02-экстракции можно получить либо за счет высокого давления, что сопряжено с дополнительными затратами, либо добавлением этанола в диоксид углерода [145]
Отдельного обсуждения заслуживает применение сверхкритических сред в области технологий получения и переработки продуктов функционального назначения, обогащенных С02-экстрактами и С02-шротами, а также лекарственных препаратов на основе растительного сырья. Доказано, что экстракты, полученные из лекарственного сырья с помощью сжиженных газов, оказывают губительное влияние на жизнедеятельность микроорганизмов [146]. Таким образом, выявленные антибактериальные свойства экстрактов открывают новые возможности использования их как природных консервантов, особенно для жидких лекарственных препаратов, предназначенных для длительного хранения [147]. Таким образом, из приведенного анализа следует, что в настоящее время большинство методов, применяемых для извлечения природных веществ из лекарственного растительного сырья предполагает использование органических растворителей, большинство из которых огне- и взрывоопасны, токсичны и не всегда селективны, а сам процесс экстрагирования продолжителен во времени. Удаление растворителей из экстракта требует использования повышенных температур, влияющих на состав экстрагируемых веществ.
Решение данной проблемы возможно путем использования экологически безопасных растворителей, таких как вода и этанол, а также путем разработки новых методов, отвечающих принципам «зеленой химии» и обеспечивающих извлечение натуральных продуктов. Одним из таких методов является сверхкритическая экстракция, позволяющая проводить экстрагирование растительного сырья при низких температурах. К тому же она является управляемым процессом, то есть позволяет, меняя параметры процесса, получать экстракты различного состава. Использование сверхкритических растворителей дает возможность сократить продолжительность экстрагирования, исключить воздействие высоких температур на стадии концентрирования и повысить тем самым качество целевых продуктов. Это ставит сверхкритическую экстракцию в исключительное положение среди всех остальных промышленных способов экстракции. Не говоря уж о том, что получаемые экстракты являются наиболее приближенными к природному составу растительного сырья.
Химический состав низкомолекулярных водорастворимых .соединений
Кислоты экстрактов из надземной части, выделенные этанолом с концентрацией 80 %, характеризуются относительно высоким содержанием кислот: яблочной, пальмитиновой и линоленовой, обладающей F-витаминной активностью. Среди кислот экстракта из корней преобладают фенилуксусная и линолевая кислоты. В минорных количествах в составе водорастворимых фракций водно-этанольных экстрактов корней, выделенных этанолом с концентрацией более 80 %, присутствуют малоновая, масляная и левулиновая кислоты, а из аминокислот идентифицирован лишь серии.
В составе водорастворимых соединений водно-этанольных экстрактов надземной части с концентрацией 96 % превалируют янтарная и фенилук-сусная кислоты, в корнях - пальмитиновая, аминокислоты не обнаружены.
В результате исследования состава ГЭ установлено, что наибольшее количество липидных компонентов одуванчика, в том числе и восков, извлекается этанолом с концентрацией более 80 % об.
Максимальный выход восков из надземной части и корней одуванчика 1,4 % и 1,2 % соответственно получен при использовании 96 %-ного этанола.
Методом ГХ-МС установлено, что основными компонентами гидролизатов восков являются предельные одноосновные С7-С27 и непредельные (олеиновая, линолевая и 8,11,14 - докозатриеновая) кислоты. Среди насыщенных жирных кислот в восках надземной части выделяется относительно высоким содержанием пальмитиновая, генэйкозановая, церотиновая и монтановая кислоты. Одноосновные предельные кислоты восков корней менее высокомолекулярны (Сі4-С2з) и характеризуются преобладающим содержанием стеариновой, бегеновой и лигноцериновой [171].
Содержание ненасыщенных одноосновных кислот в восках надземной части ниже, чем в ГЭ 96 %-ной смеси. Двухосновная кислота (азелаиновая) и кетоны, представленные 2-октадеканоном и 2-нонадеканоном, идентифицированы лишь в восках надземной части.
Суммарное содержание алканов Сі5-С27 в восках корней составляет 17,1 %, в восках надземной части - 14,5 %. В составе алканов преобладают высокомолекулярные гомологи С20-С27. В небольшом количестве в гидроли 83
зате восков надземной части идентифицирован спирт 3,7,11,15-тетраметил-2-гексадецен-1-ол, в гидролизате восков корней - ундециловий спирт.
Эксперимент выполнен в сверхкритических для диоксида углерода условиях: при постоянной температуре 55 С и давлении в интервале от 10 до 30 МПа. Выбор температуры обусловлен стремлением сохранить натуральные термолабильные компоненты экстракта.
Влияние условий процесса на выход и состав СС -экстрактов Согласно полученным результатам (рисунок 3.8) при повышении давления до 20 МПа наблюдается увеличение выхода экстракта до 0,46 % на а.см. корней одуванчика, вероятно, в результате, как повышения плотности флюидного потока растворителя и как следствие возрастания его растворяющей способности [172], так и ускорения заполнения порового пространства экстрагируемого материала флюидным растворителем. Однако, несмотря на дальнейшее повышение плотности растворителя при давлении выше 20 МПа увеличения выхода растворимых веществ не происходит.
Возможно, это вызвано механическим нарушением «пористости» матрицы корней одуванчика и уменьшением, вследствие этого, скорости диффузии растворителя в поровое пространство и экстрагируемых веществ из пор в поток растворителя. Подтверждением этому может быть полученная зависимость выхода С02-экстракта корней одуванчика от продолжительности процесса при давлении 30 МПа (рисунок 3.9). Несмотря на неблагоприятные условия процесса при увеличении продолжительности до 180 мин наблюдается повышение выхода С02-экстракта до 0,57 % на а.с.м. С учетом полученной динамики увеличение давления свыше 20 МПа с целью повышения выхода С02-экстракта из корней одуванчика является нецелесообразным.
Выход СОг-экстракта из надземной части при 20 МПа (55 С, 45 мин) составил 0,86 %, что практически в два раза выше выхода СОг-экстракта из корней. При повышении давления до 30 МПа он возрос до 1,04 %.
Изменение давления и продолжительности экстракции сопровождается количественным перераспределением как групповых составляющих, так и отдельных компонентов экстрактов.
Остальная часть экстракта представлена стеролами, алканами и в незначительных количествах - сложными эфирами, спиртами и альдегидами.
Преобладающее содержание терпенов и терпеноидов является отличительной особенностью С02-экстрактов одуванчика. С повышением давления их доля в экстракте возрастает, прежде всего, за счет извлечения высокомолекулярных компонентов. Терпены С02-экстракта, выделенного при 20 МПа из корней одуванчика, представлены скваленом, а в составе терпеноидов преобладают хопенон Б, лупеол и ацетат лупеола (таблица 3.15). В составе терпеноидов экстракта, выделенном при 30 МПа, обнаружены также Р-амирин, 13,27-циклоурсан-З-ол и глобулол.
Пектиновые полисахариды корней
В работе установлено, что применение модификаторов (вода, этанол, тетрагидрофуран) в количестве 5 % масс, приводит к повышению выхода экстрагируемых веществ. При использовании воды (20 МПа) выход С02 -экстракта из надземной части составил 1,1 % на а.с.м. против 0,8 % из корней, несмотря на то, что прирост выхода составил лишь 37,5 %, а для корней 74 %. Применение в качестве сорастворителя этанола способствует увеличению выхода экстракта из надземной части и корней до 2,9 и 2,4 % на а.с.м. соответственно. Максимальные выходы С02-экстрактов, составляющие 3,2 % для надземной части и 4,1 % для корней получены при использовании тетрагидрофурана.
Установлено, что прирост выхода С02-экстрактов в присутствии модификаторов обусловлен, в большей степени, извлечением высокомолекулярных алифатических кислот, в том числе и ненасыщенных, и в меньшей степени - альдегидов, кетонов и спиртов. На выход и состав терпеноидов и стеролов присутствие модификаторов сказывается слабо. Несмотря на снижение доли терпеноидов в экстрактах их превалирующая роль сохраняется.
Для выделения пектиновых полисахаридов в работе использована двухстадийная обработка исследуемых образцов с использованием на первой стадии дистиллированной воды, а на второй - водного раствора щавелевокислого аммония. Изучена зависимость выхода полисахаридов от температуры на каждой ступени обработки. Установлено, что максимальные выходы полисахаридов могут быть получены при 100 С.
Суммарный выход пектиновых полисахаридов из надземной части при 100 С составил 27,9 % на а.с.м. В их составе около 60 % приходится на гидратопектин, выделенный на первой стадии обработки и характеризующийся высокой зольностью. Для гидратопектина и протопектина надземной части характерно высокое содержание пектинатов. В составе мине ральной части исследуемых образцов пектиновых полисахаридов определено 22 элемента. Среди макроэлементов преобладают калий, кальций, магний и кремний. Наиболее выражено это для гидратопектина, а в составе минеральной части протопектина отмечено сравнительно высокое содержание кремния, алюминия, цинка и ряда микроэлементов. Содержание токсичных элементов не превышает допустимых норм.
По данным ЯМР С основным компонентом макромолекулы гидратопектина надземной части является D-галактуроновая кислота с содержанием около 52 % масс. Ее карбоксильные группы на 34 % метилированы, а около 60 % связано с металлами. Макромолекула протопектина надземной части содержит 37,4 % а-1,4-связанной D-галактопиронозилуроновой кислоты, около 38 % карбоксильных групп галактуроновой кислоты метилировано и 35 % связано с металлами.
Суммарный выход гидратопектина и протопектина из корней одуванчика при незначительном преобладании последнего составил 18 %, что в 1,5 раза ниже выхода пектиновых полисахаридов из надземной части.
Установлено, что в состав гидратопектина корней входят преимущественно остатки нейтральных моносахаридов: арабинозы, ксилозы, галактозы, глюкозы и в минорном количестве маннозы. По данным ГХ-МС доминирующим моносахаридом является глюкоза с содержанием более 70 % от суммы моносахаридов, а по данным ЯМР С - фруктоза с содержанием около 90 % мае. На долю остатков галактуроновой кислоты приходится около 16 %, что говорит о примесном характере пектиновых полисахаридов во фракции. Основными компонентами ее являются полифруктаны и, возможно, глюкан.
Качественный состав гидролизата протопектина корней аналогичен, но доминирующими компонентами среди моносахаридов являются араби-ноза и галактоза, их соотношение составляет 2,7:1. Как и в протопектине надземной части имеет место аномально высокое содержание арабинозы и близкое - галактуроновой кислоты. По данным ЯМР 1JC содержание галактуроновой кислоты в протопектине составляет 41,9 %, при этом около 42 % карбоксильных групп галактуроновой кислоты этерифицировано. Макромолекула протопектина характеризуется низкой степенью разветвлен-ности и содержит боковые цепи, образованные с участием a-L-арабинофуранозы.
Установлено, что по основным физико-химическим показателям гид-ратопектин надземной части одуванчика после деминерализации и очистки от сопутствующих арабинана и арабиногалактана может быть рекомендован для использования при приготовлении продуктов лечебно-профилактического назначения.
Таким образом, в результате выполненной работы выявлено, что максимальный выход экстрагируемых из одуванчика веществ может быть получен обработкой водой при 100 С. В полученных экстрактах сконцентрированы моносахариды, олигосахариды, окси- и аминокислоты, а также, что очень важно, пектиновые полисахариды, представляющие собой уникальный биологически активный продукт с лечебно-профилактическими свойствами.
При использовании водно-этанольной смеси с повышением концентрации этанола выход экстрагируемых соединений, в том числе пектиновых полисахаридов, существенно снижается. В составе экстрактов, полученных этанолом с концентрацией более 60 %, повышается доля липидов до 1,6-1,8 % на а.см., что сравнимо с выходом экстрактов, выделенных диоксидом углерода с модификаторами. Полученные экстракты содержат богатый комплекс биологически активных веществ, тем не менее, по ряду групповых компонентов, прежде всего, по содержанию терпеноидов существенно уступающий сверхкритическим С02-экстрактам. Кроме того, при выделении липидных компонентов используются относительно высокая температура и сложная схема фракционирования этанольного экстракта.
