Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Возрастные особенности заболеваемости, смертности и клинического течения рака шейки матки 13
1.2. Роль вируса папилломы человека в этиологии и патогенезе плоскоклеточной карциномы шейки матки 17
1.3. Роль иммунной системы в развитии плоскоклеточной карциномы шейки матки 27
1.4. Значение SCC как опухолевого маркера клинического течения и прогноза плоскоклеточного рака шейки матки 36
1.5. Заключение 39
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Клиническая характеристика материала 41
2.2. Характеристика применяемых методов исследования
2.2.1. Методы выявления и дифференциации ДНК ВПЧ 44
2.2.2. Методы исследования показателей иммунной системы 45
2.2.3. Методика определения опухолеассоциированного маркера SCC 49
2.2.4. Характеристика методов статистической обработки результатов исследования 50
Глава 3. Влияние вирусологических факторов (генотипа впч, множественности вируса, вирусной нагрузки) на клиническое течение плоскоклеточного рака шейки матки 52
Глава 4. Влияние клеточного и гуморального иммунитета на клиническое течение плоскоклеточного рака шейки матки
4.1. Сопоставление показателей иммунитета у больных пре- и инвазивным плоскоклеточным РШМ 62
4.2. Сопоставление показателей иммунитета у больных РШМ различных возрастных групп 70
4.3. Сопоставление показателей иммунитета у больных РШМ, инфицированных одним или несколькими типами ВПЧ 87
4.4. Сопоставление показателей иммунитета у больных
пре- и инвазивным РШМ в зависимости от уровня SCC 89
Глава 5. Влияние опухолеассоциированного маркера scc на клиническое течение плоскоклеточного рака шейки матки 91
Глава 6. ОБсуждение результатов 96
Выводы , 104
Практические рекомендации 105
Список литературы 106
- Возрастные особенности заболеваемости, смертности и клинического течения рака шейки матки
- Роль вируса папилломы человека в этиологии и патогенезе плоскоклеточной карциномы шейки матки
- Методы выявления и дифференциации ДНК ВПЧ
- Сопоставление показателей иммунитета у больных пре- и инвазивным плоскоклеточным РШМ
Введение к работе
В современной онкологии рак шейки матки является, пожалуй, единственной локализацией, где сконцентрированы одновременно и удачи, и множество сомнений. Несмотря на успехи в разработке программ ранней диагностики и методов лечения, РШМ продолжает входить в число наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований. По данным международного агентства по изучению рака (МАИР), ежегодно в мире регистрируется 371 000 новых случаев РШМ и 190 000 смертей.
Эпидемиология РШМ схожа с эпидемиологией заболеваний, передающихся половым путем. Большинство случаев РШМ (78%) приходится на развивающиеся страны, где эта локализация является 2-й наиболее частой причиной смерти от рака (страны Латинской Америки и Карибского бассейна, Восточной и Южной Африки, Южной и Юго-Восточной Азии). Стандартизованные показатели заболеваемости РШМ на 2000 год на 100 000 женского населения самые высокие в Гаити и Танзании, соответственно 93,8 и 61,4; смертности - 53,5 и 33,7. В странах Северной Америки, Европы и Азии частота РШМ значительно ниже (стандартизованные показатели менее 14 на 100 000 женщин) [80]. Такое распределение случаев РШМ по планете связывают, во-первых, с эпидемиологическими особенностями вируса папилломы человека, этиологическая роль которого в происхождении РШМ считается доказанной, а во-вторых, с внедрением цитологического скрининга в развитых странах.
Благодаря внедрению цитологического скрининга в России в 1950-е годы, заболеваемость РШМ в 80-е годы снижалась, однако, начиная с 1992 года, наблюдается тенденция к возрастанию частоты этой патологии. Абсолютное число заболевших РШМ в России составило в 1994 году - 11-894, а в 2004 году - 12 727 женщин, причем рост числа заболевших РШМ, как и другими злокачественными опухолями, с учетом специфики демографической ситуации
в России, свидетельствует об истинном повышении онкологической заболеваемости, так как наблюдается на фоне убыли численности населения
[1].
Снижение среднего возраста больных злокачественными новообразованиями наблюдается у женщин с впервые в жизни установленным диагнозом рака гортани — на 1,8 года и рака шейки матки — на 3,7 года. Медиана возрастного распределения больных с впервые в жизни установленным диагнозом РШМ снизилась за период с 1995 по 2005 год с 56,8 до 50,7 [45].
В последние годы во многих странах наметилась тенденция к нарастанию заболеваемости РШМ в молодом возрасте [10, 63, 73, 123]. Эта тенденция наблюдается и в России. До 1980 года во всех возрастных группах происходило постоянное снижение уровня заболеваемости, но, начиная с 1985 года, был отмечен рост заболеваемости у женщин в возрастной группе до 39 лет [44]. В структуре смертности от злокачественных новообразований различных возрастно-половых популяционных групп роль РШМ как причины смерти женщин моложе 30 лет существенна - 8,4% [45]. Аналогичные тенденции наблюдаются и в Китае: сравнительное исследование эпидемиологии и клинических характеристик РШМ с 1955 по 2004 год обнаружило, что, начиная с 1991 года, увеличиваются заболеваемость и смертность от РШМ среди молодых женщин [188]. РШМ является второй, после рака молочной железы, ведущей причиной смерти женщин в возрасте от 20 до 39 лет в США [ПО].
Важную роль для диагностики РШМ играет цитологический скрининг, который и обусловил снижение заболеваемости РШМ в 80-90-х годах. Однако за последние 10 лет наблюдаются увеличение числа больных с III—IV стадиями и рост летальности на первом году с момента установления диагноза. При этом увеличивается число «запущенных» форм опухолевого процесса у женщин репродуктивного возраста [2], что нельзя связать только с ухудшением организации профилактических осмотров.
По мнению многих авторов, РШМ у женщин молодого возраста протекает более агрессивно, имеет склонность к раннему метастазированию и рецидивированию [9, 22, 23, 188]. Причина этого явления неизвестна, как неизвестна причина недостаточной эффективности применяемых методов профилактики, диагностики и лечения рака, несмотря на все усилия, предпринимаемые в этой области, что требует более пристального изучения особенностей патогенеза, клинического течения и прогноза РШМ у женщин репродуктивного возраста.
Одним из важнейших достижений в изучении этиологии рака шейки матки принято считать установление факта причинной связи его с ВПЧ-инфекцией [16, 60]. Это открытие по своей значимости находится в одном ряду с обнаружением роли табакокурения при раке легкого, а также роли хронической вирусной инфекции при гепатитах В и С в этиологии первичного рака печени. Следует подчеркнуть, что, несмотря на высокую потенциальную опасность, ВПЧ является условным патогеном. Носительство ВПЧ свидетельствует не о злокачественном процессе как таковом, а о многократно повышенном риске его возникновения. Факторы, модифицирующие опухолевый рост у инфицированных женщин, остаются неизвестными [76, 139].
Почти незыблемой догмой стали утверждения, что «рак никогда не возникает в до того здоровом органе» и что «всякий рак имеет свой предрак» [46]. Если рассматривать ВПЧ-носительство как первый этап малигнизации плоского эпителия шейки матки, то, согласно концепции L.G. Koss (1968), дисплазия и преинвазивный рак - обязательные этапы злокачественной трансформации плоского эпителия шейки матки. Иными словами, плоскоклеточный рак шейки матки крайне редко возникает «с места в карьер» на фоне неизмененного эпителия. Развитие рака идет через определенные стадии: нормальный эпителий, дисплазия, карцинома in situ, карцинома in situ с
8 ранней стромальной инвазией, микрокарцинома, предклиническая карцинома, инвазивная карцинома [7, 8].
Однако существует и иное мнение. В этой ситуации развитие РШМ минует некоторые промежуточные стадии, что подтверждает противоположную концепцию - об отсутствии предрака [34]. В частности, возможен такой вариант, при котором нормальный эпителий сразу превращается в микрокарциному. Так показано, что у подавляющего большинства больных папиллярный рак щитовидной железы возникает в неизмененном органе и только в 4% случаев - на фоне узловатого зоба [34].
Для РШМ, как ни для какой другой опухоли, определены критерии предрака и установлен временной период развития различных этапов опухолевой трансформации эпителия, составляющий в среднем 10 лет [8, 20]. Это представление подтверждается данными, полученными из разных клиник, о возрастном распределении пациенток с различными этапами злокачественной трансформации [73, 123]. Так средний возраст больных со слабовыраженной или умеренной дисплазиеи на 4-6 лет меньше, чем средний возраст больных с тяжелой дисплазиеи или карциномой in situ, и на 10-13 лет меньше, чем средний возраст больных с инвазивной плоскоклеточной карциномой шейки матки.
В соответствии с современными представлениями, связанное с возрастом увеличение степени тяжести неопластической трансформации эпителия шейки матки может отражать последовательность событий, происходящих в генетическом аппарате клетки на этапах опухолевого роста [17]. Этот период связан с переходом эписомальной формы ДНК в интегративную по мере роста опухоли. Следовательно, имеется достаточный период времени для проведения соответствующих профилактических мероприятий, препятствующих развитию инвазивного РШМ, а значит, у женщин репродуктивного возраста, особенно до 30-35 лет, не должны наблюдаться запущенные формы, что противоречит данным статистики.
Высокий процент запущенных форм РШМ у женщин репродуктивного возраста может свидетельствовать, с одной стороны, об отсутствии или неэффективности массового цитологического скрининга, а с другой — может быть связан с существованием факторов, ускоряющих опухолевую трансформацию и определяющих агрессивность процесса. Изучение факторов, ускоряющих опухолевую трансформацию эпителия шейки матки, инфицированного вирусом папилломы человека, необходимо для разработки более эффективных программ профилактики и лечения РШМ. В частности, факторы, ускоряющие опухолевую трансформацию, могут быть связаны со сниженной иммунологической защитой, с особенностью вируса папилломы человека, с фертильностью и беременностью, табакокурением, приемом оральных контрацептивов, изменением экологической ситуации и образа жизни и др.
Исследования в области иммунологии опухолей позволили прийти к заключению о том, что иммунная система организма, как никакая другая, отражает его взаимоотношения с опухолью и обладает модулирующим влиянием на опухолевый рост [32]. Применение доступных и информативных методов определения состояния иммунитета (выполненных в одних и тех же клинико-лабораторных условиях) на контингентах больных разных возрастных групп с однородно протекающим процессом позволяет получить сведения, важные для понимания вопросов патогенеза РШМ.
Другим подходом является углубленное исследование роли ВПЧ в этиологии и патогенезе РШМ в зависимости от генотипа вируса, количества копий вирусной ДНК (вирусной нагрузки), а также его физического статуса. К этим исследованиям в настоящее время приковано внимание многих ученых в мире, о чем свидетельствует большое число публикаций по этому вопросу, однако ученые находятся еще в самом начале своего пути, и, насколько нам известно из специальной литературы, исследования такого рода и объема при РШМ не осуществлялось. Между тем результаты этих исследований могут
10 способствовать выработке критериев прогноза течения ассоциированных с ВПЧ злокачественных изменений.
Проблема затрагивает наиболее активную, социально значимую часть женского населения нашей планеты и имеет большое значение.
Основная цель работы: определить значение отдельных вирусологических и иммунологических факторов в патогенезе и клиническом течении плоскоклеточного РШМ у женщин разных возрастных групп.
Для достижения этой цели необходимо решить следующие конкретные
задачи:
Изучить распределение различных генотипов ВПЧ у больных плоскоклеточным РШМ в зависимости от возраста, этапа малигнизации, стадии заболевания, параметров опухолевого роста (формы роста, глубины инвазии, лимфогенного метастазирования).
Оценить показатели вирусной нагрузки у больных РШМ по мере прогрессирования опухолевого процесса от преинвазивной карциномы к инвазивному росту и при лимфогенном метастазировании.
Сопоставить показатели вирусной нагрузки с возрастом больных РШМ.
Исследовать показатели клеточного и гуморального иммунитета у больных РШМ, сопоставить их с возрастом больных и клиническим течением заболевания.
Сопоставить показатели клеточного и гуморального иммунитета с вирусологическими показателями (генотипом ВПЧ и вирусной нагрузкой).
Оценить влияние опухолеассоциированного антигена SCC на клиническое течение плоскоклеточного рака шейки матки, определить его параметры в зависимости от возраста.
Научная новизна полученных результатов
В результате проведенного исследования выявлены некоторые взаимосвязи:
обнаружено снижение показателей вирусной нагрузки по мере прогрессирования РШМ;
показана связь низкой вирусной нагрузки с молодым возрастом больных РШМ;
— обнаружена ассоциация множественной ПВИ с более ранними стадиями
заболевания, низкой частотой метастазирования в регионарные лимфатические
узлы, экзофитными и смешанными формами роста опухоли;
— обнаружено выраженное снижение функциональной активности Т-
лимфоцитов у больных РШМ моложе 35 лет;
— выявлена связь повышенного уровня опухолеассоциированного
антигена SCC с молодым* возрастом больных РШМ.
Практическая значимость работы
В результате исследования выработаны конкретные рекомендации по формированию факторов риска неблагоприятного течения РШМ, которые должны быть учтены при планировании мониторинга и лечения больных с преинвазивнои и инвазивнои карциномой шейки матки. Определение этих показателей должно входить в программы скрининга и мониторинга женщин репродуктивного возраста.
Внедрение в практику: Результаты работы внедрены и применяются при обследовании больных РШМ в ФГУ НИИ онкологии им. Н. Н. Петрова Росмедтехнологий, НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН, СПб ГМУ им. акад. И. П. Павлова, в некоторых женских консультациях и онкологических отделениях.
12 Структура диссертации: Диссертация изложена на 127 страницах и состоит из введения, обзора литературы, трех глав, содержащих материал собственных исследований, заключения и выводов. Текст иллюстрирован 15 таблицами, 32 рисунками. Указатель литературы содержит 187 названий работ отечественных и зарубежных авторов.
Апробация работы: Материалы диссертации доложены на 466-м заседании научного общества онкологов Санкт-Петербурга и области (Санкт-Петербург, апрель 2008), на Международной конференции по онкохирургии (Краснодар, май 2008), на заседании кафедры онкологии СПб ГМУ им. акад. И. П. Павлова (Санкт-Петербург, 2008). По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.
Возрастные особенности заболеваемости, смертности и клинического течения рака шейки матки
Изменившаяся социально-экономическая обстановка в России обусловила новые тенденции в структуре заболеваемости РШМ. Оценивая современное состояние и перспективы онкологической заболеваемости, многие онкологи страны отмечают существенный рост показателей запущенности. По данным статистических исследований, в 1998 году РШМ III—IV стадии был выявлен в среднем у 41,3% больных [43], несмотря на визуальную локализацию заболевания. Особое внимание следует обратить на специфику динамики повозрастных показателей заболеваемости РШМ женщин России. До 1980 года во всех возрастных группах происходило постоянное снижение уровня заболеваемости, но, начиная с 1985 года, был отмечен рост заболеваемости у женщин в возрастной группе до 39 лет [44]. По данным популяционного ракового регистра Санкт-Петербурга, с 1980 по 1998 год заболеваемость женщин РШМ в возрастных группах моложе 50 и старше 75 лет возросла в 1,5 раза, тогда как в возрасте с 50 до 74 лет она снизилась более чем вдвое [10]. Обращает на себя внимание рост заболеваемости в возрастной группе 30-49 лет: каждая третья-четвертая больная - моложе 50 лет (36,5%), при этом 4,7% -моложе 30 лет [29]. Подобная тенденция к увеличению заболеваемости женщин репродуктивного возраста отмечается и в других странах. Так в США, по данным Американского онкологического общества, на 2002 год 47% больных РШМ — это женщины до 35 лет [66]. Анализ 30-летней динамики распространения РШМ в Европе показал, что с начала 70-х годов значительно увеличилась распространенность этого заболевания среди женщин до 39 лет, достигнув в последние годы 20% от общего числа заболевших, при этом на возраст до 29 лет и моложе приходилось 4,8% больных [123]. Увеличение частоты заболеваемости РШМ среди женщин репродуктивного возраста отмечено и рядом других авторов [57, 68, 71]. Сравнительное исследование эпидемиологии и клинических характеристик РШМ с 1955 по 2004 год в Китае обнаружило, что начиная с 1991 года увеличивается заболеваемость и смертность от РШМ среди молодых женщин [188]. Эти тенденции эпидемиологии РШМ, свидетельствующие об «омоложении» заболевания, пока не нашли четкого научного объяснения. Данные результатов исследований, проведенных в США A. Jemal с соавторами в 2002 году, показывают, что РШМ является второй, после рака молочной железы, ведущей причиной смерти женщин в возрасте от 20 до 39 лет [НО]. А. Э. Воронцова [10] отмечает в своих исследованиях рост смертности от РШМ среди женщин в возрасте от 25 до 49 лет, тогда как у больных в возрастной группе 50-79 лет отмечается тенденция к ее снижению.
По данным статистических исследований, в последние десятилетия отмечен рост числа «запущенных» форм РШМ у женщин фертильного возраста [2]. Часто в литературе встречается мнение о крайне неблагоприятном клиническом течении рака шейки матки у больных в возрасте до 30 лет. В. П. Тобилевич еще в 1953 году в своих исследованиях указывал, что рак шейки матки в молодом возрасте (30—35 лет) протекает более агрессивно, плохо поддается лучевой терапии, характеризуется более ранним метастазированием и прогрессией опухоли [39]. А. Г. Косников в 1998 году на основании клинико-морфологических исследований сделал вывод, что молодой возраст больных является фактором, ухудшающим прогноз РШМ [22]. Автор отметил, что частота метастазирования РШМ в регионарные лимфатические узлы коррелирует с возрастом и выше среди больных молодого возраста. Также было отмечено, что у больных в возрасте до 35 лет значительно чаще встречается метастазирование даже при небольшой инвазии, что не характерно для больных плоскоклеточным раком старшей возрастной группы. По данным госпитального исследования, проведенного В. В. Кропаневой в 2004 году, было установлено, что двустороннее метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов чаще наблюдалось у больных РШМ репродуктивного и пременопаузального возраста. Отмечено, что у больных РШМ в возрастных группах до 49 лет наблюдается тенденция к преобладанию опухолей большего размера, чем у женщин старшего возраста, и с глубиной инвазии 0,8 см и более, что в значительной степени ухудшает течение заболевания [23]. В работе Е. Kastritis обнаружено снижение медианы выживаемости в группах больных моложе 35 лет и старше 70 лет при прогрессировании заболевания и рецидиве РШМ после лечения, по сравнению с группой больных 35-70 лет [111]. При многофакторном анализе определены 43 фактора, влияющие на прогноз течения РШМ, 23 из них связаны с неблагоприятным исходом: отягощенная наследственность, форма роста опухоли, локализация, степень распространения, морфологическая структура опухоли, в том числе и возраст пациента и др. [41, 61].
На большую агрессивность течения рака шейки матки в молодом возрасте указывают и другие авторы [10, 188]. Тем не менее, некоторые исследователи склоняются к мнению, что прогноз рака шейки матки хуже у женщин старших возрастных групп [27, 51]. По мнению J. P. Geisler, возраст не является фактором, влияющим на клиническое течение и прогноз РШМ [87]. Приведенные данные свидетельствуют об отсутствии единого мнения относительно влияния возраста на клиническое течение и прогноз РШМ.
Роль вируса папилломы человека в этиологии и патогенезе плоскоклеточной карциномы шейки матки
Следует признать, что в настоящее время, пожалуй, ни одна из локализаций злокачественных опухолей у женщин, за исключением РШМ, не обнаруживает столь доказанной роли вирусов в происхождении рака. За последние годы накоплено большое количество эпидемиологических и молекулярно-биологических данных, подтверждающих связь между опухолевым процессом и наличием вирусного генетического материала [89, 91, 106, 124, 125, 163]. Установлено, что в 99,7% случаев цервикального рака выявляют ВПЧ высокого онкогенного риска [181]. При этом ВПЧ 16 и родственные типы (31, 33, 35, 52 и 58) - обнаружены в 67-69 %, а ВПЧ 18 и родственные ему типы (39, 45, 59, 68) - в 27% опухолей (59, 89). В остальных 6% случаев выявлены ВПЧ умеренного риска — 53, 55, 56, 62, 66.
Информационный бюллетень ВОЗ в июле 1996 года внес окончательную ясность в длительно дискутируемый вопрос о роли вирусов в возникновении опухолей человека: подтверждено, что вирусы семейства папилломавирусов являются этиологическим агентом рака шейки матки [182]. Дескриптивные эпидемиологические исследования выявили корреляцию между заболеваемостью РШМ и частотой инфицированности ВПЧ. Процент женщин с носительством ВПЧ значительно выше среди населения с высокой заболеваемостью РШМ, чем среди популяции с низкой заболеваемостью.
Встречаемость ВПЧ-инфекции в популяциях здоровых женщин значительно варьирует в разных этнико-географических регионах и во многом определяется поведенческими, социально-экономическими, медицинскими и гигиеническими стандартами [164]. Минимальная зарегистрированная частота инфицированности ВПЧ (5%) наблюдается в Испании — стране с «низким риском» РШМ [139]. В Мексике, Бразилии, Марокко и Парагвае (странах с высокой заболеваемостью РШМ) - 17%; 17%; 20,5% и 20% здоровых женщин,
соответственно, являются носительницами ВПЧ [139, 147, 155]. В Аргентине зараженность папилломавирусами генитального тракта достигает самых высоких цифр, составляя приблизительно 40% [81]. Несмотря на высокий социально-экономический и образовательный уровень, частота выявления ВПЧ у здоровых женщин США составляет 26%, а у жительниц Канады - 21,8% [153]. ВПЧ-носительство в России практически не подвергалось объективным оценкам, адекватных лабораторных исследований, посвященных этому вопросу, до сих пор не проводилось, несмотря на очевидную значимость этих сведений, поэтому была предпринята попытка оценить встречаемость ВПЧ у здоровых женщин России на примере популяции Санкт-Петербурга. Так последовательности ВПЧ были выявлены у 90 (29%) из 309 здоровых женщин репродуктивного возраста Санкт-Петербурга, причем 58% образцов содержали ВПЧ «высокого риска» [3, 4].
Географические колебания характерны не только для встречаемости ВПЧ, но и для распределения их по типам. У женщин Европы и Америки превалирует ВПЧ 16, тогда как в Индонезии более чем в 50% РШМ обнаружен ВПЧ 18 [185]. Среди прочих генотипов ВПЧ практически во всех регионах мира чаще встречаются ВПЧ 31 (2-7%), 33 (3-5%), 45 (2-8%) типов, исключая страны Азии, где превалируют ВПЧ 58 (6%) и 52 (4%) типа [107].
Папилломавирусные последовательности выявлены не только в злокачественных опухолях, но и в предраковых поражениях (интраэпителиальных дисплазиях) разного уровня, что также свидетельствует об инициирующей роли вируса в развитии трансформации многослойного плоского эпителия шейки матки, способной прогрессировать в преинвазивный и инвазивный рак шейки матки [18, 91, 144]. Так ДНК ВПЧ была выявлена у 94% женщин с преинвазивными поражениями и у 46% женщин с цитологически нормальными тканями шейки матки [105].
В настоящее время охарактеризовано более 120 различных типов ВПЧ, систематизированных на основе нуклеотидньгх последовательностей геномов вируса, из которых около 40 типов могут вызывать заболевания ано-генитального тракта. При анализе эпителия шейки матки у женщин с инвазивным раком на наличие ВПЧ особенно часто встречались 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58 и 68 типы [91]. Самыми распространенными типами ВПЧ высокого онкогенного риска являются 16 и 18 типы [120, 140, 180]. М. J. Khan с соавт. в своем исследовании выявили, что именно 16 и 18 генотипы ВПЧ коррелируют с высоким риском развития преинвазивных и инвазивных изменений шейки матки, по сравнению с другими онкогенными типами ВПЧ, что подразумевает более агрессивный подход к лечению данных инфекций [114].
Анализ типов папилломавирусов у российских женщин выявил ВПЧ 16 в 77%, а ВПЧ 18 - в 14% случаев плоскоклеточного РШМ [158]. В другом исследовании ВПЧ 16 присутствовал в 69% плоскоклеточного рака и 54% аденокарцином, а ВПЧ 18 — в 4% и 26% соответственно. Кроме того, в 8% РШМ был обнаружен ВПЧ 45, а также в 1% - ВПЧ 31, 33, 56, 35, 52, 58 и 68 типов [179]. Некоторые различия в приведенных данных, по всей вероятности, связаны с обследованием женщин из разных регионов России, а также с вариациями в постановке ПЦР.
Что касается возрастных особенностей, то имеется ряд сообщений о превалировании ВПЧ 58 типа в старшем возрасте, а ВПЧ 16 и 18 типов — в молодом возрасте [119, 120, 121, 126, 180].
Имеются сообщения о том, что различные злокачественные цервикальные опухоли ассоциированы с определенным типом ВПЧ. В плоскоклеточном РШМ в основном присутствует ВПЧ 16 типа, а в аденокарциномах и низкодифференцированных опухолях — ВПЧ 18 [185, 187]. В некоторых работах показано, что присутствие ВПЧ 16 типа прогрессивно повышается по мере нарастания тяжести цервикальных поражений. Так в исследовании J. А. Нее частота встречаемости ВПЧ 16 типа у больных CIN I
Методы выявления и дифференциации ДНК ВПЧ
Клиническим материалом для проведения анализа послужили соскобы из цервикального канала или опухоли шейки матки. Материал собирался специальной щеточкой и помещался в транспортную среду, содержащую физиологический раствор и 20% сыворотку крупного рогатого скота. Выделение ДНК из клинических проб проводили с использованием тест-системы ДНК-сорб-А.
Для выявления и дифференциации ДНК вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска — 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типов - использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с типоспецифическими праймерами (АмплиСенс ВПЧ, ЦНИИ эпидемиологии, Москва). Анализ проводился в лаборатории микробиологии НИИ акушерства и гинекологии имени Д. О. Отта (заведующая лабораторией - профессор А. М. Савичева) с участием старшего научного сотрудника, к. б. н. Е. В. Шипицыной и научного сотрудника Е. А. Золотоверхой, за что автор приносит им свою благодарность.
Метод ПЦР основан на одновременной амплификации (мультиплекс-ПЦР) в одной пробирке участков ДНК четырех типов ВПЧ и участка р-глобинового гена, используемого в качестве внутреннего контроля.
Анализ с использованием метода ПЦР включает 3 этапа: 1. Выделение ДНК из клинического образца. 2. Амплификация (увеличение количества) специфических фрагментов ДНК. 3. Детекция продуктов амплификации.
Детекцию амплифицированной ДНК производили методом горизонтального электрофореза в агарозном геле.
С помощью новейшей технологии ПНР-анализа - ПНР в реальном времени - осуществлялась количественная оценка ДНК вирусов папилломы человека (оценка вирусной нагрузки). Количество ДНК ВПЧ рассчитывали по отношению к числу копий гена р-глобина человека и представляли как число копий ДНК ВПЧ на 10 копий геномной ДНК человека (одна клетка человека содержит две копии р-глобинового гена).
Исследование иммунного статуса проводилось в лаборатории иммунологии городской больницы № 31 г. Санкт-Петербурга (заведующая лабораторией - Г. И. Иванова).
Для иммунологического исследования лимфоциты выделяли из периферической крови в градиенте плотности фиколл-верографина (плотность 1, 077 г/мл) по А. Воушп, в модификации Л. Б. Хейфец, В. А. Абалкин [15]. Кровь на анализ брали у пациентов в одно и то же время суток - утром, натощак, до существенной физической нагрузки.
Субпопуляции лимфоцитов определяли в реакции непрямой иммунофлюоресценции. Метод основан на использовании специфичности иммунологической реакции антиген-антитело и чувствительности флюоресцентной микроскопии. При применении этого метода суспензию живых клеток вначале обрабатывали антителами, специфическими к выявляемому антигену, а затем - антителами, соединенными с флюорохромом и направленными против специфических антител. При проведении реакции руководствовались стандартизацией методов иммунофенотипирования клеток крови и костного мозга человека. Были использованы моноклональные антитела (МКАТ) фирм «Dako» (Дания), «Сорбент» (Россия). Панель исследования включала маркеры, указанные в табл. 5.
Для визуализации реакции использовали ФИТС (флюоресцинизотиоцианат). Результаты оценивали с помощью люминисцентного микроскопа ЕС ЛЮМАМ РПО 11 (Россия): подсчитывали не менее 200 клеток, сопоставляя фазово-контрастную (световую) и люминисцентную картину каждого поля зрения для определения процентного содержания клеток с меткой.
Количество иммуноглобулинов (Ig) М, G, А в сыворотке определялось методом простой радиальной иммунодиффузии по G. Mancini. Определение иммуноглобулинов производили с помощью моноспецифических сывороток против IgM, IgG, IgA и стандарта (эталонных сывороток, содержащих IgM, IgG, IgA) производства ФГУП НПО «Микроген» (Москва). Уровень иммуноглобулинов определяли по калибровочной кривой, выражающей зависимость между концентрацией иммуноглобулинов и диаметром колец преципитации, образующихся при внесении исследуемой сыворотки в лунки, вырезанные в агаре, в которые предварительно была диспергирована моноспецифическая антисыворотка. Реакция торможения миграции лейкоцитов периферической крови в присутствии митогенов является одним из методов определения функционального состояния Т-системы иммунитета. Вследствие неспецифической стимуляции митогеном лимфоциты секретируют ряд лимфокинов, в том числе фактор торможения миграции лейкоцитов. По степени торможения миграции лейкоцитов можно судить о лимфокинпродуцирующей способности лимфоцитов, а следовательно, и об их функциональной активности. Реакция проводилась согласно рекомендации А. И. Карпищенко [15]. Определяли зону миграции основной массы лейкоцитов от границы эритроцитарного осадка в контроле и в опыте с митогенами Кон-А и ФГА. Результаты миграции выражали в виде процента миграции: длина зоны миграции в присутствии процент миграции = митогена х 100% длина зоны миграции в контроле
Процент миграции лейкоцитов в присутствии митогена у здоровых людей в норме составляет от 20% до 80% (в зависимости от митогена и его концентрации), что свидетельствует о нормальной активности Т-лимфоцитов. Усиление миграции лейкоцитов расценивалось нами как угнетение Т-системы, а снижение процента миграции лейкоцитов по сравнению с нормой указывало на активацию клеток Т-системы.
Сопоставление показателей иммунитета у больных пре- и инвазивным плоскоклеточным РШМ
Известно, что развитие злокачественных опухолей формирует иммунологическую недостаточность у больных. Так, опухолевые клетки индуцируют поликлональные митогены, которые истощают иммунную систему, заставляя ее продуцировать неспецифические факторы защиты [14]. Изучение изменений, происходящих в этих случаях в иммунной системе, имеет значение не только для установления механизмов, связанных с прогрессией опухоли, но и для прогноза и лечения злокачественного процесса. Сопоставление показателей иммунитета у больных преинвазивным и инвазивным РШМ приведено в табл. 8.
В ходе исследования было выявлено снижение показателей иммунитета у больных преинвазивным и инвазивным РШМ только по функциональным показателям НСТ-теста и спонтанной миграции, свидетельствующим о пониженной функциональной активности Т-клеток и метаболической активности нейтрофилов периферической крови (рис. 14, 15). Результаты исследования иммунитета в нашей работе свидетельствуют о достоверных изменениях клеточного иммунитета у больных с карциномой in situ, в сравнении с инвазивным РШМ. Хотя показатели и находятся в пределах нормы, однако при карциноме in situ, по сравнению со средними показателями при инвазивном РШМ, отмечено достоверно значимое снижение показателей абсолютного количества общих Т-лимфоцитов (р = 0,004) (рис. 11) и их
Т-хелперы относятся к регуляторним клеткам. Без них невозможна трансформация В-лимфоцитов в плазматические клетки, которые образуют антитела. Снижение этой субпопуляции лимфоцитов значительно ослабляет защитные возможности организма. В группе больных карциномой in situ обнаружено достоверное снижение, по сравнению с группой больных инвазивным РШМ, среднего количества IgA (р = 0,033), хотя показатели и находятся в пределах нормы (рис. 16). Также у больных преинвазивным раком шейки матки выявлено достоверно значимое снижение, по сравнению с аналогичными показателями при инвазивном РШМ, абсолютного количества моноцитов (р = 0,025), абсолютного числа лимфоцитов (р - 0,02) и лейкоцитов периферической крови (р = 0,009) (рис. 17, 18, 19). Рис. 16. Иммуноглобулин А у больных преинвазивным и инвазивным РШМ
Вполне вероятно, что подобные нарушения иммунитета у больных предклиническим РШМ связаны с этиопатогенезом заболевания.
Нарастание заболеваемости злокачественными новообразованиями по мере старения является универсальной биологической закономерностью. Частота злокачественных опухолей у человека увеличивается с 45 до 80 лет, удваиваясь каждые 9 лет [13]. Рак шейки матки не является исключением.
С возрастом у здоровых людей наблюдается прогрессивное угнетение всех звеньев иммунной системы. Больше всего страдает Т-звено иммунитета -снижается содержание Т-лимфоцитов, изменяется соотношение регуляторных субпопуляций лимфоцитов. В-звено иммунитета также подвергается негативным изменениям - у лиц старшей возрастной группы наблюдается падение уровня нормальных антител. С возрастом также происходит снижение функциональной активности макрофагов и сегментоядерных нейтрофилов, хотя их общее количество и не меняется.
Рост заболеваемости РШМ больных молодого возраста в последние десятилетия диктует необходимость более углубленного подхода к изучению данной патологии. В нашем исследовании проведено сопоставление показателей иммунограмм больных РШМ различного возраста (табл. 9).
