Введение к работе
Актуальность исследования. В основе онкологического заболевания лежат изменения генома клетки, представленные „генетическими и эпигенетическими нарушениями. Среди различных механизмов репарации повреждений ДНК особую роль в канцерогенезе играет соматическая гомологичная рекомбинация (СГР), которая инициируется при наличии двунитевых разрывов ДНК. Ее биологический смысл заключается в восстановлении поврежденной структуры локуса хромосомной ДНК за счет взаимодействия с интактным локусом, расположенным на гомологичной хромосоме. При этом'в случае гетерозиготности аллелей по данному локусу происходит частичная потеря генетической информации в результате перехода аллелей в гомозиготное состояние. Если в исходной клетке один из аллелей гена-супрессора опухолевого роста является нормальным, а другой - мутантным, то СГР может привести к потере нормального аллеля и фенотипическому проявлению мутантного гена-супрессора опухолевого роста Это и объясняет важную роль СГР в многостадийном канцерогенезе.
Многочисленные данные свидетельствуют о неравномерном распределении по геному рекомбинационных событий, вероятность каждого из которых во многом зависит от локальной структуры ДНК в хромосоме. В ряде -исследований были выявлены «горячие» точки рекомбинации, представленные микросателлитными повторами ДНК, и в частности, CA/TG-повторами. Так, было показано, что наличие повторов приводит к увеличению частоты рекомбинации в трансфецированной ДНК в культуре клеток млекопитающих, в хромосомах дрожжей, а также к стимуляции внутриплазмидной рекомбинации у бактерий. Кроме того, существуют данные, указывающие на возможную роль СА-повторов в промотировании хромосомных транслокаций, возникающих при различных типах лимфоидных опухолей человека. Однако молекулярные механизмы влияния микросателлитных повторов на рекомбинацию не исследованы. Одним из возможных объяснений служит способность микросателлитных повторов к формированию в результате внутри- и межмолекулярных взаимодействий неканонических структур ДНК, влияющих на инициацию и (или) терминацию гомологичной рекомбинации. В соответствии с этим изучение особенностей структуры ДНК в области СА-повторов, наиболее широко распространенных в геноме млекопитающих, включая человека, является актуальным для современной молекулярной онкологии, и в частности, для понимания механизмов генетических перестроек, ведущих к возникновению опухолевых клеток.
Цели и задачи исследования. Целью данного исследования являлось изучение структурно-функциональных особенностей микросателлитных повторов. Соответственно,
конкретными задачами исследования являлись следующие: 1) изучение роли СА-повторов в ДНК-ДНК-взаимодействии гомологичных линейных дуплексов ДНК с образованием структур Холлидея, являющихся одним из промежуточных соединений гомологичной рекомбинации; 2) анализ структурных особенностей ДНК в дуплексах, содержащих СА-повторы; 3) изучение взаимодействия дуплексов с одноцепочечными олигонуклеотидами, аналогичного ДНК-ДНК-взаимодействию на стадии инициации гомологичной рекомбинации, а именно: инвазии одноцепочного конца ДНК в гомологичный дуплекс; 4) изучение особенностей встраивания олигонуклеотидов в дуплексы, содержащие СА-повторы.
Научная новизна. Для изучения структурных особенностей ДНК в области микросателлитных повторов, а также их роли в процессе гомологичной рекомбинации необходимо моделирование различных стадий данного процесса. В связи с этим одной из удобных систем in vitro является модель структуры Холлидея, представляющей собой одно из промежуточных соединений гомологичной рекомбинации. В предыдущих исследованиях лаборатории методов скрининга канцерогенов была продемонстрирована способность природных гомологичных двухцепочечных ДНК к спонтанному взаимодействию" с образованием, структур Холлидея без участия белков. Полученная модельная система раскрыла новые возможности для изучения функциональных свойств повторов ДНК, а также влияния микроокружения на ДНК-ДНК-взаимодействие фрагментов, содержащих повторяющуюся последовательность. В представленной работе впервые исследованы и выявлены структурно-функциональные особенности СА-повторов на модели структуры Холлидея, образованной гомологичными линейными дуплексами ДНК. Так, с помощью электронной микроскопии ДНК показано влияние СА-повторов на положение точки перекреста в структурах Холлидея. Кроме того, впервые in vitro продемонстрирован феномен инвазии одноцепочечной ДНК случайной последовательности в комплементарные концевые участки линейных дуплексов с образованием трехцепочечного комплекса, аналогичного D-петле, образующейся in vivo на стадии инициации гомологичной рекомбинации. Также продемонстрированы особенности инвазии одноцепочечной ДНК в дуплексы, содержащие СА-повторы.
Научно-практическая значимость исследования. Одной из характерных - особенностей опухолевых клеток является нестабильность генома, представленная ' многочисленными соматическими изменениями генов, прогрессивно нарастающими в процессе опухолевого роста. Некоторые изменения, ассоциированные с трансформацией клеток или приобретением ими злокачественного потенциала, появляются на ранних этапах опухолевого роста и могут служить основой для создания диагностических тестов. В связи с этим в современной онкологии для выявления определенных типов генетических нарушений в опухолях используются микросателлитные повторы ДНК, и в частности СА-повторы, с высокой частотой распределенные в геноме человека.
При проведении микросателлитного анализа ДНК опухолевых клеток выявляют два типа генетических нарушений: потерю гетерозиготности полиморфных аллелей хромосомных локусов, приводящую к изменению функционирования генов данного локуса в результате делеции или их перехода в гомозиготное состояние, и микросателлитную нестабильность, связанную с мутациями в пределах повторяющейся последовательности ДНК. Потеря гетерозиготности хромосомных локусов с высокой частотой встречается при раке легкого, желудка, молочной железы и в ряде случаев является маркером малигнизации, метастазирования и других составляющих неблагоприятного прогноза развития рака. Повреждения микросателлитных повторов были обнаружены в интронных областях генов, участвующих в репарации ДНК и контроле клеточного цикла. Для ряда генов было показано, что микросателлитная нестабильность в них приводит к нарушению транскрипции или сплайсинга м-РНК. Однако, несмотря на важную роль обоих типов генетических нарушений в канцерогенезе, механизмы, приводящие к возникновению этих нарушений, мало изучены.
Исследования механизмов потери гетерозиготности хромосомных локусов в эукариотических клетках свидетельствуют о важной роли в данном процессе соматической гомологичной рекомбинации. С другой стороны, в ряде работ была' обнаружена стимуляция гомологичной рекомбинации микросателлитными повторами ДНК, в частности, СА-повторами, в системах in vitro и in vivo. Таким образом, изучение механизмов регуляции рекомбинации микросателлитными повторами является важным для понимания причин, приводящих к генетической нестабильности в опухолевой клетке.
В представленной работе исследованы структурно-функциональные особенности СА-повторов, получены новые данные об их влиянии на процесс миграции ветвей в структуре Холлидея, образующейся in vivo в процессе гомологичной рекомбинации, выявлены новые закономерности в ДНК-ДНК-взаимодействии как случайных, так и повторяющихся последовательностей ДНК. Полученные данные важны для понимания молекулярных механизмов рекомбинации и закономерностей возникновения генетических перестроек.
Апробация работы состоялась 20 декабря 2006 г. на совместной научной конференции лабораторий методов скрининга канцерогенов, механизмов гибели опухолевых клеток, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, молекулярной биологии вирусов, иммунологии онкогенных вирусов, вирусного канцерогенеза, биохимии опухолей, генетики опухолевых клеток, канцерогенных веществ НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, а также группы электронной микроскопии Института Молекулярной биологии им. В.А.Энгелыардта РАН. Основные положения диссертации обсуждались на конференциях лаборатории методов скрининга канцерогенов и Ученом совете НИИ Канцерогенеза, представлены на 2 устных и 8 стендовых докладах на научных конференциях. По результатам диссертации опубликовано 5 печатных работ.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (№ 03-04-48979а, грант МАС-2003
№ 03-04-06829, № 0б-04-49204а).
Объём работы. Диссертация содержит 139 страниц машинописного текста, состоит из
введения, обзора литературы, описания использованных в работе материалов и методов,
результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов.
В работе содержится 4 таблицы, 45 рисунков. Указатель литературы содержит 206 ссылок
на работы отечественных и зарубежных авторов.
