Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Нестабильные атеросклеротические бляшки и их роль в развитии инфаркта миокарда 10
1.2. Методы выявления нестабильных атеросклеротических бляшек 14
1.3. Роль матриксных металлопротеиназ в атерогенезе и формировании нестабильности атеросклеротических бляшек 25
1.4. Роль системы урокиназного активатора плазминогена в атерогенезе и формировании нестабильности атеросклеротических бляшек 30
1.5. Прочие молекулы, потенциально вовлечённые в процесс дестабилизации атеросклеротических бляшек 35
Глава 2. Материалы и методы исследования 41
2.1 Контингент исследования 41
2.2 Гистологические методы 44
2.3 Выделение геномной ДНК 49
2.4 Определение полиморфизма исследуемых генов 50
2.5 Статистическая обработка данных 55
Глава 3. Результаты исследования 57
3.1. Результаты исследования группы пациентов с инфарктом миокарда 57
3.1.1. Клиническая характеристика пациентов 57
3.1.2. Исследование полиморфизма гена MMP2. 58
3.1.2. Исследование полиморфизма гена MMP9. 58
3.1.3. Исследование полиморфизма гена PLAU. 60
3.1.4. Исследование полиморфизма гена PLAUR. 61
3.1.5. Исследование полиморфизма гена PAI-1. 64
3.1.6. Исследование полиморфизма других генов, связанных с миграцией клеточных элементов атеросклеротической бляшки. 65
3.1.7. Многофакторный анализ генетической предрасположенности к развитию ИМ у лиц без верифицированной стенокардии напряжения 69
3.2. Результаты исследования группы пациентов, перенесших каротидную эндартероэктомию 80
3.2.1. Клиническая характеристика пациентов 80
3.2.2. Анализ генетической предрасположенности к развитию нестабильности бляшки, определённой по её макроскопическим характеристикам. 83
3.2.3. Анализ генетической предрасположенности к развитию нестабильности бляшки, определённой по её микроскопическим характеристикам. 88
3.3. Сопоставление исследованных групп 104
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 109
4.1 Взаимосвязь молекулярно-генетических факторов с развитием ИМ у лиц без верифицированной стенокардии напряжения анамнеза 109
4.1.1 Взаимосвязь с полиморфизмом генов CX37 и eNOS 109
4.1.3 Взаимосвязь с полиморфизмом прочих исследованных генов 112
4.2 Взаимосвязь молекулярно-генетических факторов с морфологическими параметрами атеросклеротических бляшек 114
4.2.1 Взаимосвязь полиморфизма изученных генов с макроскопическими характеристиками АСБ 114
4.2.2 Взаимосвязь полиморфизма изученных генов с микроскопическими характеристиками АСБ 115
4.3 Ассоциация традиционных факторов риска с развитием ИМ у лиц без верифицированной стенокардии напряжения, их связь с признаками нестабильности АСБ и взаимодействие с молекулярно-генетическими факторами. 117
Выводы 120
Практические рекомендации 121
Список сокращений и обозначений 122
Список литературы
- Роль матриксных металлопротеиназ в атерогенезе и формировании нестабильности атеросклеротических бляшек
- Выделение геномной ДНК
- Исследование полиморфизма гена MMP2.
- Взаимосвязь с полиморфизмом генов CX37 и eNOS
Роль матриксных металлопротеиназ в атерогенезе и формировании нестабильности атеросклеротических бляшек
ОКТ позволяет не только оценивать толщину фиброзной капсулы (покрышки), но и, благодаря высокому разрешению, определять степень её инфильтрации макрофагами. Однако существует и ряд ограничений для использования данного метода. ОКТ обладает ограниченной проникающей способностью и, таким образом, не может использоваться для оценки ремоделирования сосуда. Кроме того, для исследования необходима оптически прозрачная среда. Это заставляет замещать кровь прозрачной средой (контрастным препаратом), что может привести к ишемии тканей [98].
Внутрисосудистая МРТ сходна с внутрисосудистым ультразвуковым исследованием по разрешающей способности (порядка 250 мкм). Она не может быть использована для прямой визуализации тонкой покрышки бляшки, и в связи с этим при внутрисосудистой МРТ фиброатерома с тонкой капсулой диагностируется при наличии в поверхностной полосе бляшки (0-100 мкм) липидной фракции. Также внутрисосудистая МРТ не может быть использована для оценки степени ремоделирования сосуда, однако она помогает оценить воспалительные реакции в бляшке. Для этого используются так называемые магнитные наночастицы на основе оксида железа. Эти частицы интернализуются рецепторами макрофагов, благодаря чему макрофаги становятся видны при МРТ [98].
Все перечисленные методы позволяют диагностировать нестабильные атеросклеротические бляшки со сравнительно высокой чувствительностью и специфичностью. Однако все они являются инвазивными, технически сложными, дорогостоящими и, как правило, предполагают лучевую нагрузку. Поэтому наиболее часто такие методики используются для оценки атеросклеротического процесса в коронарных артериях.
Визуализация аорты и сонных артерий значительно проще удобнее, чем коронарных: они больше по размеру, ближе к коже, а также отсутствует их движение, связанное с сокращениями сердца [59], поэтому для оценки нестабильной каротидной бляшки, в отличие от бляшек коронарных артерий, используются в основном неинвазивные методики: УЗИ, МРТ, радионуклидная визуализация и мультиспиральная компьютерная томография (МСКТ), применение которых связано с доступностью каротидных бляшек и возможностью сравнения полученных результатов с результатами гистологического исследования ткани после каротидной артерэктомии как золотого стандарта для оценки результатов визуализации [37]. При всём многообразии визуализирующих методик следует отметить, что чаще всего (особенно в случае визуализации коронарного русла) они не являются скрининговыми, т.е. применимы только тогда, когда бляшка тем или иным способом (например, при ангиографии) уже обнаружена. Поэтому другим направлением исследований является изучение связи уровня различных циркулирующих в крови биомаркеров с наличием у пациента нестабильных АСБ. Как показали исследования работ А.В. Тимофеевой и соавт., в атеросклеротически изменённых участках артерий меняется экспрессия целого ряда генов, вовлеченных в процессы клеточной миграции и адгезии, фенотипические изменения гладкомышечных клеток, в иммунные и воспалительные реакции, окислительные процессы и ремоделирование компонентов внеклеточного матрикса. В то же время изменение экспрессии многих из этих генов отмечается и в лейкоцитах периферической крови [16], что позволяет измерять различные маркеры атеросклеротического процесса неинвазивно.
Известно, что возникновение и прогрессирование атеросклеротических поражений сопровождается развитием воспалительной реакции в стенке пораженных артерий, поэтому одним из наиболее изученных биомаркеров, ассоциируемых с нестабильностью АСБ, наряду с металлопротеиназами (влияние которых будет рассмотрено ниже), является С-реактивный белок [23]
С-реактивный белок представляет собой циркулирующий гликопротеин суперсемейства пентраксинов, показатель текущего процесса острой фазы неспецифического воспалительного ответа, который на сегодняшний день наиболее полно изучен в ассоциации с ИБС [51; 136]
СРБ – крайне чувствительный и быстрый индикатор повреждения тканей при воспалении, некрозе, травмах и опухолях, паразитарных инфекциях. СРБ стимулирует иммунные реакции, в т.ч. фагоцитоз, выступая в роли опсонизирующего белка для ряда патогенов и связываясь с Fc рецепторами, участвует во взаимодействии Т- и В-лимфоцитов, активирует классическую систему комплемента. В крови здоровых людей СРБ содержится в минимальных количествах, но при развитии активного воспаления в течение первых суток происходит выраженное повышение уровня циркулирующего СРБ. Сывороточная концентрация СРБ имеет высокую корреляцию с активностью заболевания и стадией процесса, а эффективная терапия проявляется снижением концентрации, что позволяет осуществлять мониторинг за развитием и лечением острой фазы заболеваний, сопровождающихся воспалением [51].
Выделение геномной ДНК
Помимо протеаз, разрушающих межклеточный матрикс и дестабилизирующих бляшку, важную роль играют и факторы, стимулирующие пролиферацию и миграцию клеточных элементов АСБ, включая макрофаги и гладкомышечные клетки. Первые, как отмечалось, синтезируют различные протеолитические ферменты, ослабляя капсулу АСБ. Вторые осуществляют активный синтез коллагена, что приводит к росту атеросклеротической бляшки и развитию стабильной стенокардии или хронической ишемии других органов, однако такая бляшка является стабильной и не склонной к разрыву.
Одной из молекул, связанных с процессами миграции клеток, является коннексин-37 (Cx37). Этот трансмембранный белок участвует в формировании щелевых контактов, необходимых для непосредственной связи между цитоплазмами контактирующих клеток. Шесть идентичных коннексинов формируют коннексон. Коннексоны взаимодействующих клеток образуют канал диаметром около 1,5 нм, позволяющий осуществлять обмен различными молекулами и ионами. [60]. Коннексины – трансмембранные белки, четыре раза пересекающие мембрану, имеющие две внеклеточные петли (EL-1 и EL-2) и цитоплазматическую петлю CL. N- и C-концы также находятся в цитоплазме. Различные киназы могут фосфорилировать коннексины, осуществляя регуляцию работы канала, кроме того, канал может менять свои свойства в ответ на изменение pH, электрического потенциала и концентрации Ca2+. Тубулины (белки микротрубочек), взаимодействуя с коннексонами, позволяют осуществлять транспорт различных веществ непосредственно к каналу [128].
Сх37 в организме человека экспрессируется, в частности, в эндотелии и моноцитах. По мере прогрессирования атеросклероза он начинает экспрессироваться также в гладкомышечных клетках, находящихся под атеросклеротической бляшкой [32]. Cx37 участвует в адгезии моноцитов, опосредует взаимодействия между эндотелием и гладкомышечными клетками сосудов и в настоящее время обсуждается как важный молекулярный фактор, вовлеченный в развитие атеросклероза [49].
Richard G. и соавт. описали однонуклеотидную замену С на Т в 1019 положении гена Сх37, что приводит к замене пролина на серин в кодоне 319 аминокислотной последовательности Сх37 (предположительно – регуляторный домен) [126]. Функциональное значение данного полиморфизма остаётся неясным. В 2002 г. Yamada Y. и соавт. продемонстрировали влияние данного полиморфизма на развитие ИМ [167], в дальнейшем связь генотипа ТТ с развитием ИМ была подтверждена в других исследованиях [67; 91; 92]. В российской популяции шансы развития ИМ у больных ишемической болезнью сердца, имеющих генотип ТТ, существенно возрастают (ОШ=5,3 р=0,001) [13].
Позднее были проведены экспериментальные исследования, результаты которых позволили сделать предположения о возможном механизме связи Cx37 c процессами атерогенеза. Используя животную модель (АпоЕ-дефицитных мышей) Wong C.W. и соавт. показали, что нокаут по гену CX37 приводит к развитию большего числа атеросклеротических поражений. Подавление экспрессии Cx37 в моноцитах и макрофагах (но не в эндотелиальных клетках) увеличивает рекрутирование макрофагов. Активность коннексина-37 в первичных культурах моноцитов и макрофагов, а также в клеточных линиях макрофагов ингибировала адгезию этих лейкоцитов, причём данный эффект был опосредован выделением АТФ во внеклеточное пространство. Также в этой работе было показано, что макрофаги, несущие аллель 319Ser Cx37, демонстрируют более сильную АТФ-зависимую адгезию, чем макрофаги, несущие аллель 319Pro [165].
В последнее время появились сведения об экспериментах in vitro, показывающих возможное взаимодействие Сх37 с эндотелиальной NO-синтазой (eNOS) [121]. Интенсивность данного взаимодействия не связана с генетическим полиморфизмом, однако в связи с большой значимостью NO в развитии сердечнососудистой патологии представляется важным совместное изучение этих двух белков.
Оксид азота – важная молекула, т.к. он является одним из самых активных веществ, секретируемых эндотелием в норме и выполняющим модулирующую, вазодилататорную, антикоагулянтную, защитную и другие функции. NO является вторичным мессенджером и принимает участие в физиологических процессах практически во всех органах и тканях организма. Оксид азота регулирует межклеточные взаимодействия, участвует в различных процессах в нервной, репродуктивной и иммунной системах. Кроме того, NO играет важную роль в регуляции сосудистого тонуса, синтеза внеклеточного матрикса и ремоделирования сосудов, а также в процессах ангиогенеза, пролиферации, апоптоза и миграции эндотелиальных клеток. В небольших концентрациях NO ингибирует экспрессию молекул адгезии, синтез цитокинов и хемокинов, трансмиграцию и адгезию лейкоцитов [5]. Недостаток NO может привести к нарушению баланса между вазоконстрикторами и вазодилататорами, т.е. нейрогуморальному дисбалансу. Важным является также то, что нейрогуморальный дисбаланс в пользу вазоконстрикторов способствует пролиферации гладкомышечных клеток сосудов и кардиомиоцитов, а кроме того, и развитию склеродегенеративных процессов [3].
Исследование полиморфизма гена MMP2.
В настоящей работе независимыми факторами, связанными с развитием ИМ у лиц без верифицированной стенокардии напряжения являлись генотипы 298EE гена NOS3 и 319SS гена CX37. По данным однофакторного анализа носительство варианта 319SS увеличивало шансы развития ИМ у лиц без верифицированной стенокардии напряжения в 9,33 раза, а носительство варианта 298EE – в 2,68 раза. Генотипы 319PP и 298DD обладали протективным эффектом.
Соотнесение этих результатов с данными литературы несколько затруднено из-за отсутствия работ, целенаправленно изучающих возникновение ИМ без верифицированной стенокардии напряжения. Однако влияние полиморфизма гена CX37 на развитие ИМ вообще подтверждено на различных популяциях: японцах мужского пола [67; 167], жителях Сицилии [91; 92] и пациентах российской популяции [13]. Поскольку функциональное значение замены пролина на серин в 319 позиции коннексина-37 остаётся неясным, не вполне понятен и механизм его влияния на развитие сердечно-сосудистой патологии. По всей видимости, в основе негативного эффекта лежит усиление воспалительной реакции в АСБ за счёт АТФ-зависимой адгезии макрофагов, которая усиливается при наличии аллели 319Pro [165].
Результаты, полученные для гена NOS3, расходятся с имеющимися в литературе сведениями. Во многих работах, выполненных как в европейских, так и в азиатских популяциях, подтверждена связь полиморфизма Glu298Asp с развитием (в том числе ранним) ИМ [66; 74; 102]. Однако по всем имеющимся данным аллелью высокого риска является 298D, что представляется логичным с учётом имеющихся данных о снижении каталитической активности eNOS у носителей аллели Т [120]. В настоящем исследовании аллель 298D напротив, оказывала протективный эффект.
Принято считать, что NO является ангиопротективной молекулой, т.к. он ингибирует агрегацию тромбоцитов, уменьшает адгезию различных клеток к эндотелию, ингибирует апоптоз эндотелиальных клеток и оказывает множество других благоприятных эффектов [85]. Тем не менее, следует заметить, что одним из эффектов NO является ингибирование пролиферации и миграции сосудистых гладкомышечных клеток [43; 52; 58; 129]. Известно, что под действием различных цитокинов в АСБ происходит миграция гладкомышечных клеток из медии в интиму, где они начинают активно пролиферировать и синтезировать компоненты межклеточного матрикса, в результате чего в атеросклеротической бляшке разрастается соединительная ткань [142]. Итогом этого процесса является развитие того или иного подтипа АСБ типа V (в зависимости от количества соединительной ткани). Возможно, что недостаток NO, связанный с носительством генотипа 298DD NOS3, способствует более интенсивной миграции и пролиферации гладкомышечных клеток с образованием более стабильных фиброзных бляшек. В настоящей работе данную гипотезу на основании макроскопического и микроскопического анализа АСБ подтвердить не удалось, однако для окончательного уточнения этого вопроса требуются дальнейшие исследования морфологии АСБ (включая оценку количества гладкомышечных клеток и коллагена) в связи с генетическими особенностями пациентов.
Поскольку различные генотипы CX37 и NOS3 могли быть ассоциированы с разными клиническими ситуациями, особый интерес, в том числе и с точки зрения возможного практического применения, представляли собой комбинации тех или иных генотипов у одного пациента. Показано, что комбинации генотипов 319SS+298EE, 319SS+298ED, 319PS+298EE и 319SS+298DD увеличивают шансы развития ИМ у лиц без верифицированной стенокардии напряжения в 4,41 раза, тогда как комбинации 319PP+DD, 319PP+ED и 319PS+DD снижают шансы в 5 раз (ОШ=0,20). При этом у 100% пациентов, имевших сочетание генотипов 319SS+298EE, ИМ развился без верифицированной стенокардии напряжения.
В литературе отсутствуют данные о совместном влиянии полиморфных маркеров генов CX37 и NOS3 на развитие каких-либо проявлений ИБС, однако существует достаточное количество сведений о возможном взаимодействии коннексина-37 с эндотелиальной NO-синтазой, а также непосредственно с оксидом азота. Обобщая имеющиеся данные, можно говорить о том, что повышенный уровень NO подавляет коммуникацию эндотелиальных клеток через щелевые контакты, образованные коннексином-37 без использования сигналинга, зависимого от циклического гуанозинмонофосфата; данный эффект подтверждается in vivo [67]. Взаимодействие С-конца коннексина-37 (предположительно, являющегося регуляторной областью), в котором и локализуется замена Pro319Ser, с eNOS показано in vitro методом фагового дисплея. Также солокализация коннексина-37 и eNOS подтверждена в культуре клеток [121]. С учётом этих данных ассоциация комбинации полиморфных маркеров генов CX37 и NOS3 с развитием ИМ у пациентов без стенокардии напряжения, вероятно, имеет под собой биохимическую основу, которая нуждается в подробном дальнейшем изучении.
Взаимосвязь с полиморфизмом генов CX37 и eNOS
В данном исследовании пациенты с каротидным атеросклерозом были разбиты на группы носителей макроскопически стабильных и макроскопически нестабильных АСБ. К первой группе были отнесены поражения типа Vc (плотные фиброзные бляшки), а ко второй – поражения типа Va (фиброатеромы).
Единственным значимым молекулярно-генетическим фактором, ассоциированным с макроскопическими характеристиками АСБ, являлся полиморфизм Pro141Leu (C7240T, rs2227564) гена PLAU. Генотип 141PP увеличивал шанс развития фиброатеромы в 4,27 раза, тогда как генотип 141LL напротив, в 14,3 раза (ОШ=0,07) снижал его. Генотип 141PL значимостью не обладал.
Данный результат – впервые показанное свидетельство взаимосвязи полиморфизма Pro141Leu гена PLAU с характером течения атеросклероза. В литературе практически отсутствуют данные о связи данного полиморфного маркера с сердечно-сосудистой патологией. В ходе анализа литературы обнаружена единственная работа, в которой показано отсутствие влияния полиморфизма Pro141Leu на риск развития ИМ [166].
Тем не менее, полученные данные подтверждают важность роли uPA в процессах атерогенеза. Известно, что при развитии атеросклеротического поражения происходит увеличение содержания урокиназы и ее рецептора в интиме [66]. Замена пролина на лейцин в 141 позиции урокиназы ведёт к усилению гидрофобности крингл-домена, что приводит к снижению аффинности uPA к фибрину и, возможно, к другим компонентам внеклеточного матрикса [169]. Патофизиологическая роль данной замены однозначно не охарактеризована, отчасти потому, что до конца не ясна функция крингл-домена [117]. Возможно, меньшее сродство uPA к структурам межклеточного матрикса АСБ ведёт к снижению интенсивности процессов протеолиза и формированию плотных бляшек с большим количеством фиброзной ткани.
Полиморфизм прочих изученных генов был связан с макроскопическими характеристиками каротидных АСБ.
Единственным молекулярно-генетическим фактором, ассоциированным с толщиной капсулы АСБ, являлся полиморфизм С(-516)T (rs344781) гена PLAUR. Аллель Т чаще встречалась у пациентов с источённой ( 65 мкм) капсулой (81,0% против 69,0%), однако эти различия не достигали уровня статистической значимости (р=0,26). Тем не менее, при однофакторном анализе генотип (-516)TC продемонстрировал протективный эффект: шанс развития АСБ с истончённой капсулой у носителей данного генотипа по сравнению с другими пациентами был ниже в 4 раза (ОШ=0,25). Генотип (-516)TT чаще встречался у лиц с нестабильными АСБ, увеличивая шанс истончения капсулы в 3,08 раза. При однофакторном анализе различия между группами не достигали уровня статистической значимости, однако при включении в анализ традиционных факторов риска (таблица 3.25) генотип (-516)TT однозначно проявлял свой негативный эффект. Генотип (-516)СC, по всей видимости, должен обладать ещё большими, чем (-516)TC, свойствами, однако подтвердить это не удалось из-за малого числа носителей (-516)СC (4 человека в 2 группах).
В разделе 4.1.3 уже были рассмотрены возможные эффекты носительства аллели (-516)T. Выявление связи этого варианта с толщиной капсулы АСБ подтверждает возможное влияние изменённой экспрессии рецептора урокиназы на процессы протеолиза внеклеточного матрикса АСБ с последующей её дестабилизацией. Однако следует подчеркнуть, что выявленная взаимосвязь генотипа (-516)TT, а следовательно, и толщины капсулы АСБ с развитием ИМ у лиц без верифицированной стенокардии напряжения нивелировалось другими факторами, такими, как полиморфизм генов CX37 и eNOS.
Полиморфизм генов CX37 и eNOS не связан с процессами дестабилизации атеросклеротической бляшки, однако ассоциирован с развитием ИМ у лиц без верифицированной стенокардии напряжения, в то время как полиморфизм С(-516)T (rs344781) гена PLAUR связан с обоими состояниями. По всей видимости, в развитии нестабильных АСБ существенную роль играет усиление миграции клеточных элементов в фиброзную капсулу и активация протеолиза за счёт урокиназной системы. Эти процессы играют роль и при формировании ИМ без верифицированной стенокардии напряжения, однако в данном случае более значительную роль играет усиленная адгезия моноцитов к эндотелию, связанная с коннексином-37. Следует отметить, что в настоящей работе анализировались пациенты, имеющие каротидные АСБ существенных размеров, тогда как ИМ без стенокардии напряжения, вероятнее всего, связан с мелкими бляшками. Можно предположить, что для дестабилизации подобных поражений интенсивность адгезии имеет большее значение.
Роль эндотелиальной NO-синтазы в развитии ИМ без стенокардии напряжения следует признать недостаточно изученной. Возможно, при более высоком уровне NO уменьшается пролиферация гладкомышечных клеток, стабилизирующих АСБ, однако эта гипотеза требует проверки. Из данных литературы известно, что eNOS взаимодействует с коннексином-37, однако функциональное значение этого взаимодействия неизвестно. Вполне вероятно, что eNOS каким-то образом модулирует работу межклеточных контактов и, как следствие, влияет на адгезию моноцитов к эндотелию.
