Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Гомологичная рекомбинация 11
1.1.1. Основные стадии и пути гомологичной рекомбинации 11
1.1.2. Основные белки, вовлеченные в соматическую гомологичную рекомбинацию у человека 1 4
1.1.3. Гомологичная рекомбинация в процессе канцерогенеза 17
1.1.4. Гомологичная рекомбинация при лечении онкологических заболеваний 19
1.1.5. Распределение рекомбинационных событий по геному 23
1.2. (CA/TG)n-микросателлитные последовательности 25
1.2.1. Локализация и особенности строения poly(CA/TG)-локусов .2 5
1.2.2. Функциональные возможности (СА/TG)n-повторов 26
1.2.2.1. Роль микросателлитных повторов в организации хроматина 26
1.2.2.2. Роль (СА/TG)n-повторов в регуляции экспрессии генов 27
1.2.2.3. Участие (СА/TG)n-повторов в гомологичной рекомбинации 29
1.2.3. Структурные особенности poly(CA/TG) 31
1.2.3.1. poly(CA/TG) и Z-форма ДНК 31
1.2.3.2. poly(CA/TG) и квадруплексная структура 35
1.2.4. Мутационная изменчивость poly(СА/TG) и системы контроля стабильности у различных организмов 3 5
1.2.4.1. Механизмы изменения числа повторяющихся единиц в CA микросателлитах 37
1.2.4.2. Факторы, влияющие на стабильность (CA/TG)n-повторов 39
1.3. CA-микросателлиты как сайты инициации и терминации
гомологичной рекомбинации 42 1.3.1. CA-микросателлиты как сайты терминации гомологичной рекомбинации: модельные системы и предварительные данные 42 1.3.2. CA-микросателлиты как сайты инициации гомологичной
рекомбинации 45
Глава 2. Материалы и методы 47
2.1. Список использованных реактивов и олигонуклеотидов 47
2.2. Процедура клонирования последовательностей (CA/TG)10, (CA/TG)15, (CA/TG)25, (CA/TG)31 и RI (рэндомная) в полилинкерный сайт плазмиды PUC19 50
2.2.1. Фосфорилирование синтетических олигонуклеотидов 50
2.2.2. Процедура формирования дуплексов 51
2.2.3. Реакция лигирования ДНК 51
2.2.4. Трансформация бактериальных клеток E.Coli штамма XL10-Gold 51
2.2.4.1. Приготовление компетентных клеток E.Coli штамма XL10-Gold 51
2.2.4.2. Трансформация компетентных клеток E.Coli штамма XL10-Gold с использованием «бело-голубой» селекции 52
2.3. Выделение плазмидной ДНК 53
2.4. Выделение геномной ДНК из ткани 54
2.5. Обработка плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции 55
2.6. Амплификация ДНК с помощью полимеразной цепной реакции 55
2.7. Осаждение ДНК в этаноле 56
2.8. Кинирование 5 -концов олигонуклеотидов радиоактивным фосфором... 56
2.9. Электрофоретическое разделение ДНК 57
2.10. Визуализация ДНК 57
2.10.1. Окрашивание ДНК с помощью SYBR Gold 57
2.10.2. Окрашивание ДНК с помощью бромистого этидия 58
2.10.3. Авторадиография 58
2.10.4. Визуализация ДНК, несущей флуоресцентные зонды FAM и TAMRA 58
2.11. Извлечение ДНК из агарозного геля 59
2.11.1. Экстракция с помощью ДНК-связывающего матрикса на основе двуокиси кремния 59 2.11.2. Выделение ДНК с помощью электроэлюции 60
2.12. Определение концентрации ДНК и SYBR Gold 60
2.13. Электронная микроскопия 60
2.14. Статистическая обработка результатов электронной микроскопии 61
Глава 3. Результаты исследования 62
3.1. Оптимизация метода визуализации ДНК с помощью флуоресцентного расителя SYBR Gold по протоколу предокрашивания 62
3.1.1. Определение стабильности комплекса SG - ДНК при проведении агарозного гель-электрофореза 63
3.1.2. Выявление несвязавшегося с ДНК SYBR Gold в растворах при различных количественных соотношениях краситель/ДНК 65
3.1.3. Зависимость электрофоретической подвижности окрашенной ДНК от соотношения SG/ДНК 67
3.2. Изучение структурно-функциональных особенностей (CA/TG)n повторов, важных для процессов инициации и терминации гомологичной рекомбинации 70
3.2.1. Анализ влияния poly(CA/TG) на процесс миграции точки перекреста структур Холлидея 70
3.2.1.1. Модельная система 70
3.2.1.2. Анализ локализации точки перекреста в популяциях структур Холлидея, образованных ПЦР-продуктами 73
3.2.1.3. Анализ локализации точки перекреста в популяциях структур Холлидея, образованных фрагментами плазмидной ДНК 74
3.2.1.4. Анализ локализации точки перекреста в популяциях структур Холлидея, образованных фрагментами плазмидной ДНК, несущими разное число (CA/TG)n-повторов 75 3.2.2.Особенности олигонуклеотидной инвазии во внутреннюю комплементарную последовательность дуплексной ДНК 76
3.2.2.1. Оптимизация метода визуализации ДНК-ДНК взаимодействий с помощью флуоресцентно меченных олигонуклеотидов 77
3.2.2.2. Инвазия олигонуклеотидов d(CA)10 и d(TG)10 в эукариотическую ДНК 79
3.2.2.3. Олигонуклеотидная инвазия в ди-, три- и терануклеотидные последовательности 80
3.2.2.4. Анализ возможности олигонуклеотидной инвазии в (CA/TG)n-последовательность дуплексной ДНК после удаления ранее сформированного комплекса 83
3.2.2.5. Встраивание олигонуклеотидов d(CA)10 и d(TG)10 в дуплексную ДНК с разной длиной (CA/TG)n-повтора 86
3.2.2.6. Зависимость интенсивности инвазии олигонуклеотидов d(CA)10 и d(TG)10 в плазмиду, содержащую (CA/TG)31-повтор, от мольного соотношения плазмида/олигонуклеотид 87
3.2.2.7. Олигонуклеотидная инвазия в разных солевых условиях 89
Глава 4. Обсуждения 92
4.1. Оптимизация метода визуализации ДНК с помощью флуоресцентного расителя SYBR Gold по протоколу предокрашивания 92
4.2. Изучение структурно-функциональных особенностей (CA/TG)n-повторов, важных для процессов инициации и терминации гомологичной рекомбинации 96
4.2.1. Анализ влияния poly(CA/TG) на процесс миграции точки перекреста структур Холлидея 97
4.2.2. Особенности олигонуклеотидной инвазии во внутреннюю комплементарную последовательность дуплексной ДНК 100
Заключение 105
Выводы 108
Список сокращений 110
Список литературы .
- Гомологичная рекомбинация при лечении онкологических заболеваний
- Процедура клонирования последовательностей (CA/TG)10, (CA/TG)15, (CA/TG)25, (CA/TG)31 и RI (рэндомная) в полилинкерный сайт плазмиды PUC19
- Определение стабильности комплекса SG - ДНК при проведении агарозного гель-электрофореза
- Оптимизация метода визуализации ДНК-ДНК взаимодействий с помощью флуоресцентно меченных олигонуклеотидов
Введение к работе
Актуальность исследования
Соматическая гомологичная рекомбинация (ГР) – один из ключевых механизмов поддержания стабильности генома клетки, обеспечивающий репарацию двунитевых разрывов ДНК. Дефекты данной репарационной системы повышают вероятность злокачественной трансформации клетки при действии генотоксических факторов и обнаруживаются в опухолевых клетках в виде хромосомных аберраций. Лежащее в основе ГР копирование генетической информации с гомологичной молекулы ДНК в ряде случаев сопровождается потерей гетерозиготности, что, в свою очередь, приводит к манифестации рецессивных мутаций, одному из наиболее распространенных процессов при канцерогенезе. Этот механизм лежит в основе патогенеза наследственной ретинобластомы и опухолей при синдроме Ли-Фраумени.
Многочисленные данные свидетельствуют о неравномерном распределении по геному рекомбинационных событий. «Горячими» точками рекомбинации являются микросателлитные последовательности ДНК, наиболее распространенная из которых – poly(CA/TG). Механизмы, лежащие в основе влияния микросателлитных повторов на частоту ГР до настоящего времени остаются практически неизученными. Одним из возможных объяснений подобного влияния служит наличие конформационных особенностей в области микросателлитных повторов, влияющих на стадии инициации и (или) терминации ГР. Понимание механизмов влияния (CA/TG)n-повторов необходимо для выявления локусов с наибольшей предрасположенностью к потере гетерозиготности, что раскроет возможности для формирования групп риска и позволит более точно определять прогноз заболевания. Таким образом, изучение закономерностей ДНК-ДНК взаимодействий в области микросателлитных повторов является актуальной задачей современной молекулярной биологии и экспериментальной онкологии.
Цели и задачи исследования
Целью данного исследования являлось изучение важных для инициации и терминации ГР структурно-функциональных особенностей микросателлитных (CA/TG)n-локусов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1) оптимизация метода визуализации ДНК с использованием флуоресцентного красителя SYBR Gold (SG) по протоколу предокрашивания; 2) анализ влияния poly(CA/TG) на процесс миграции точки перекреста структур Холлидея; 3) изучение закономерностей
взаимодействия (инвазии) олигонуклеотидов d(СА)10 и d(GT)10 с гомологичным участком
плазмидной ДНК, а также геномной ДНК человека; 4) анализ возможности
олигонуклеотидной инвазии в другие, также широко распространенные,
микросателлитные локусы: (CT/GA)n, (AT/TA)n, (CAG/GTC)n, (СТТ/GAA)n,
(CGG/GCC)n, (GGT/CCA)n и (GGGT/CCCA)n.
Научная новизна
В настоящем исследовании впервые проведено изучение закономерностей ранее
показанного в лаборатории М.Г. Якубовской встраивания олигонуклеотидов d(CA)10 и
d(TG)10 во внутреннюю комплементарную последовательность дуплексной ДНК.
Установлено, что структурные особенности (CA/TG)n-повтора, лежащие в основе
образования комплекса олигонуклеотид-ДНК, формируются in vivo и остаются
стабильными на протяжении экстракции ДНК. Показано, что интенсивность инвазии
одноцепочечных фрагментов d(CA)10 и d(GT)10 в (CA/TG)n-повторяющуюся
последовательность сверхспирализованной плазмидной ДНК зависит от длины
микросателлитного локуса следующим образом:
(CA/TG)31 =(CA/TG)94 >(CA/TG)10 >(CA/TG)15 =(CA/TG)25. При изучении влияния
мольного соотношения дуплекс/олигонуклеотид на интенсивность взаимодействия
(CA/TG)n-локуса плазмидной ДНК с комплементарными одноцепочечными
фрагментами, обнаружено повышение интенсивности инвазии олигонуклеотидов с
увеличением соотношения от 1/10 до 1/1, при достижения которого, дальнейшего
возрастания интенсивности встраивания не происходит. Установлено, что интенсивность
взаимодействия микросателлитных локусов (CA/TG)31 с одноцепочечными фрагментами
d(CA)10 и d(GT)10, не изменяется при использовании ряда солевых буферных растворов,
однако снижается в безсолевых условиях. Кроме того, анализ возможности
олигонуклеотидного встраивания в другие микросателлитные последовательности
показал, что среди (GA/TC)n-, (TA/AT)n-, (CAG/GTC)n-, (CGG/GCC)n-, (CTT/GAA)n-,
(GGT/CCA)n- и (GGGT/CCCA)n-повторов, такой способностью обладают только
длинные (CTT/GAA)n-локусы, формирующие в условиях отрицательной
сверхспирализации неканоническую H-форму ДНК. В рамках изучения
функционирования (CA/TG)n-повторов в качестве точек терминиции ГР с помощью электронной микроскопии установлено, что гетерология между микросателлитными локусами (CA/TG)n в шесть повторяющихся единиц ингибирует миграцию ветвей
структуры Холлидея, промежуточного продукта рекомбинационного процесса, чего не наблюдается в случае полной гомологии.
Кроме того, при проведении данного исследования предложен новый подход в использовании для визуализации ДНК флуоресцентного красителя SYBR Gold (SG), основанный на отсутствии влияния последнего на электрофоретическую подвижность ДНК при низких соотношениях SG/ДНК. Оптимизированный метод окрашивания нуклеиновых кислот позволяет более рационально использовать этот дорогостоящий краситель.
Научно-практическая значимость исследования
Настоящая работа посвящена изучению актуальной проблемы, касающейся
молекулярных механизмов канцерогенеза. В данном оригинальном исследовании
продемонстрированы закономерности взаимодействия дуплексной ДНК с
одноцепоченым фрагментом в области микросателлитных повторов, объясняющие их
функционирование в качестве «горячих» точек соматической ГР. Полученные данные о
взаимодействии микросателлитных локусов (CA/TG)n c комплементарной
одноцепочечной ДНК, влиянии на этот процесс длины повторяющейся
последовательности и мольного соотношения дуплекс/олигонуклеотид, а также о
способности гетерологии в области (CA/TG)n-повтора ингибировать миграцию ветвей
структуры Холлидея расширяют представление о молекулярных механизмах
рекомбинационной репарации и причинах генетической нестабильности. Результаты
исследования важны для сравнительной оценки вероятности соматической ГР по
различным повторяющимся последовательностям, что в перспективе должно позволить
выявлять предрасположенность к потере гетерозиготности по определенным локусам и,
соответственно, определять риск развития онкологического заболевания и
способствовать составлению более точного прогноза его течения. Кроме того, оптимизированный в ходе данной работы протокол использования флуоресцентного красителя ДНК SYBR Gold расширяет возможности его применения в молекулярно-биологических исследованиях, позволяя в целом ряде случаев избежать использования мутагенных и токсичных соединений.
Методы исследования
Работа выполнена с использованием классических молекулярно-биологических методов исследования (полимеразная цепная реакция, культивирование бактериальных
клеток, выделение и очистка ДНК из клеток и тканей, молекулярное клонирование, электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле), электронной микроскопии и статистической обработки полученных данных. Кроме того, в настоящей работе для изучения ДНК-ДНК взаимодействий, наряду с введением радиоактивной метки, применен более современный подход, основанный на использовании флуоресцентно-меченных олигонуклеотидов и флуоресцентного красителя последнего поколения SYBR Gold.
Положения, выносимые на защиту
-
В структуре микросателлитных (CA/TG)n-локусов in vivo возникают конформационные особенности, обуславливающие возможность их спонтанного взаимодействия с одноцепочечными фрагментами d(CA)10 и d(GT)10.
-
Среди других микросателлитных локусов способностью к спонтанному взаимодействию с гомологичной одноцепочечной ДНК обладают только длинные (CTT/GAA)n-повторы, формирующие в условиях отрицательной сверхспирализации неканоническую H-форму ДНК.
-
Интенсивность взаимодействия d(CA)10 и d(GT)10 с (CA/TG)n-локусом дуплексной ДНК зависит от длины повтора, соотношения дуплекс/олигонуклеотид и солевых условий.
-
Обладающие полной гомологией (СА/TG)n-микросателлитные локусы не влияют на миграцию ветвей структуры Холлидея, промежуточного продукта гомологичной рекомбинации, в то время как гетерология в области повторяющейся последовательности ингибирует данный процесс, что может способствовать ее ферментативному разрешению в этих участках генома.
-
Оптимизированный в ходе данной работы протокол визуализации ДНК с помощью флуоресцентного красителя последнего поколения SYBR Gold позволяет сократить финансовые и временные затраты на этапе пробоподготовки ДНК и избежать использования токсичных и мутагенных соединений.
Апробация результатов
Результаты работы были представлены 28 сентября 2012 года на совместной научной конференции лабораторий отдела химического канцерогенеза, лабораторий отдела трансформирующих генов опухолей, лаборатории онкогеномики и лаборатории молекулярной эндокринологии НИИ Канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина»
РАМН. Основные положения диссертации представлены на 4 международных научных конференциях. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.
Структура и объем диссертационной работы
Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, экспериментальную часть, включающую изложение и обсуждение результатов, заключение, выводы и список цитируемой литературы. Материал иллюстрирован 25 рисунками и 9 таблицами. Библиографический указатель включает 197 цитированных работ.
Гомологичная рекомбинация при лечении онкологических заболеваний
Основной целью лучевой и химиотерапии, применяемых при лечении онкологических заболеваний, является повреждение ДНК, приводящее, в конечном счете, к гибели опухолевых клеток. При этом лучевая терапия и ряд химических соединений, например, алкилирующие агенты, напрямую вызывают изменения в структуре нуклеиновых кислот, а другие химиотерапевтические препараты, в частности ингибиторы топоизомераз, - опосредованно, через повреждение белков, участвующих в метаболизме. Наиболее опасными для жизни клетки являются двунитевые разрывы ДНК, исправления которых осуществляется системой ГР. Этот репарационный механизм наиболее активен в S и G2 фазах клеточного цикла, т.е. как раз в интенсивно делящихся опухолевых клетках. Поэтому состояние системы ГР таких клеток представляет собой важный критерий выбора стратегии лечения и составления прогноза течения заболевания. Так, зачастую, этот репарационный механизм, в норме поддерживающий целостность и стабильность генома, существенно усложняет лечение того или иного онкологического заболевания, являясь причиной возникновения лекарственной устойчивости. Например, было показано, что эффективность использования этопозида (ингибитора топоизомеразы II) при лечении мелкоклеточного рака легкого коррелирует с уровнем экспрессии в опухолевых клетках RAD51 – одного из ключевых белков ГР [65]. С гиперэкспрессией этого белка связана и устойчивость ряда клеточных линий к гидроксимочевине ингибитору рибонуклеотид-редуктазы, применяемому в терапии миелопролиферативных заболеваний [66].
Подавление функционирования ГР в опухолевых клетках представляется на сегодняшний день перспективным направлением в области разработки новых противоопухолевых препаратов. И хотя многочисленные попытки создания прямых ингибиторов ГР пока не увенчались успехом, уже нашли свое применение химиотерапевтические агенты, косвенно затрагивающие эту репарационную систему. Иматиниб («Gleevec») и эрлотиниб – ингибиторы тирозинкиназ, влияющие на ядерную локализацию белков RAD51 и BRCA1, используются при лечении хронического миелолейкоза и немелкоклеточного рака легкого соответственно [67]. Кроме того, было показано, что иматиниб повышает чувствительность клеток хронического лимфолейкоза к хлорамбуцилу, а глиомы - к лучевой терапии [68]. В стадии разработки находятся ингибиторы и других киназ, в частности, CHK1, CHK2, ATM, и хотя самостоятельное использование этих соединений затруднено из-за отсутствия селективности в отношении опухолевых клеток, преклинические испытания показали перспективность их применения в составе комбинированной терапии и при лечении опухолей со специфическими генетическими дефектами [69].
С другой стороны, клетки значительной части новообразований человека являются дефектными по системе ГР, что зачастую и лежит в основе развития заболевания. Такие клетки демонстрируют гиперчувствительность к широкому спектру химиотерапевтических препаратов. Например, показана высокая эффективность цисплатина в отношении BRCA1-негативных форм рака легкого и яичников, а камптотецина (ингибитора топоизомеразы II) – WRN-дефицитных клеток [70-72]. Особо перспективным на настоящей момент времени считается применение ингибиторов PARP для лечения BRCA1/2-негативных вариантов опухолей. PARP – белок, принимающий участие в репарации однонитевых разрывов ДНК. В его отсутствие в геноме клетки возникает большое количество нерепарированных одноцепочечных разрывов, которые со временем трансформируются в двунитевые. В нормальной клетке последние исправляются системой ГР, что является невозможным в BRCA1/2-негативных опухолевых клетках (рис. 2). Применение ингибиторов PARP, в частности олапариба, позволило снизить побочные эффекты противоопухолевой терапии и увеличить показатель безрецидивной выживаемости у больных с раком яичников и молочной железы [67, 69]. Цифрой 1 обозначен двунитевой разрыв ДНК, 2 – однонитевой разрыв ДНК Рисунок 2 - Механизм синтетической летальности, обусловленной действием ингибиторов PARP в BRCA1/2-дефицитных клетках 1.1.5. Распределение рекомбинационных событий по геному
Как уже было сказано в предыдущих главах, ГР - это сложный биохимический процесс, сопряженный с множеством других клеточных систем, и требующий тонкой и многоплановой регуляции, осуществляемой с помощью всевозможных белковых молекул и комплексов. Но, как показали исследования, не только белки, но и сама молекула ДНК оказывает существенное влияние на этот процесс.
Первоначально считалось, что рекомбинационные события происходят по геному равномерно и не зависят от локальных особенностей ДНК. Это предположение долгое время составляло основу изучения структуры хромосом. При создании генетических карт расстояние между генами рассчитывалось исходя их частоты рекомбинационных событий между определенными маркерами. Однако много позже, с развитием современной генетики и молекулярной биологии, стало ясно, что генетические карты отражают лишь приблизительное расположение генов, но не расстояние между ними. Многочисленные исследования выявили наличие так называемых «горячих» точек рекомбинации – участков генома, где данный процесс происходит чаще всего. Их существование показано для бактериофагов, бактерий, дрожжей и млекопитающих [73].
«Горячими» точками рекомбинации человеческого генома являются микросателлитные повторы ДНК, что, в частности, было продемонстрировано в работе Мажевски и соавторов при изучении рекомбинационных событий на 22-ой хромосоме [74]. Анализ физической локализации 59 маркеров и микросателлитных последовательностей (ди-, три- и тетрануклеотидных повторов) с последующей статистической обработкой данных выявили положительную корреляцию между плотностью микросателлитных повторов и интенсивностью рекомбинации. Причем наибольший вклад в эту корреляцию вносили динуклеотидные (СА/TG)n-повторы.
Процедура клонирования последовательностей (CA/TG)10, (CA/TG)15, (CA/TG)25, (CA/TG)31 и RI (рэндомная) в полилинкерный сайт плазмиды PUC19
1) Выделение плазмидной ДНК осуществлялось методом щелочного лизиса. Для этого жидкая ночная культура клеток E.coli штамма XL10-Gold, несущих соответствующую плазмиду, центрифугировалась на 7000 об/мин в течение 5 минут при 4С. Клеточный осадок ресуспендировался в бидистиллированной воде, после чего добавлялся раствор, состоящий из 1% SDS и 0,2 M NaOH, а также 3 M ацетата натрия (рН 5,2). Полученная смесь центрифугировалась на 13000 об/мин 15 минут при 4С. К супернатанту добавлялись 0,6 объема изопропанола, смесь инкубировалась в течение 10 минут при комнатной температуре. Образовавшийся в результате центрифугирования при комнатной температуре, осадок промывался 96% этанолом, высушивался и растворялся в бидистиллированной воде. Последующее осаждение белков из раствора осуществлялось с помощью ацетата аммония. Для этого на 200 мкл водного раствора ДНК добавлялись 100 мкл 7,5 M ацетата аммония. Смесь инкубировалась 30 минут при -20С, а затем центрифугировалась 15 минут на 13000 об/мин при 4С. Очищенный от белков супернатант переосаждался этанолом, осадок растворялся в ТЕ-буфере (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5). Для удаления РНК полученный раствор инкубировался 30 минут при 37С в присутствие РНКазы («Fermentas», Литва), после чего к нему добавлялся равный объем смеси хлороформ:изоамиловый спирт (49:1). Образовавшаяся в результате центрифугирования верхняя (водная) фракция переосаждалась в этаноле, осадок растворялся в ТЕ-буфере (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5) или бидистиллированной воде.
2) Для выделения плазмидной ДНК из жидкой ночной клеточной культуры использовался коммерчески доступный набор GeneJet Plasmid kit («Thermo Scientific», США). Выделение геномной ДНК из ткани Образцы опухолевой и нормальной тканей молочной железы были предоставлены отделением патологической анатомии опухолей человека РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. ДНК из них получена методом фенольной экстракции, для чего ткань сначала в течение суток инкубировалась в лизирующем буфере (10 мМ Трис-HCl, 10 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl , 2% SDS, протеиназа К с концентрацией 20 мг/мл) при 37С. Затем происходило добавление равного объема фенола и центрифугирование смеси 2 минуты при 2000 g. К образовавшейся водной фазе добавляли 500 мкл смеси фенол:хлороформ (1:1) и центрифугировали смесь 5 минут при 12000 g. К вновь отобранной водной фазе добавляли 500 мкл смеси хлороформа с 1/24 объема изоамилового спирта, центрифугировали 5 минут при 12000 g. Водная фракция переосаждалась этанолом, осадок растворялся в бидистиллированной воде. 2.5. Обработка плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции
Рестриктазы к раствору плазмидной ДНК добавлялись из расчета 1-3 единицы активности на 1 мкг ДНК. Смесь инкубировалась в соответствующем, поставляемом производителем буфере, в течение 2,5 часов при 37С (при использовании эндонуклеаз рестрикции HindIII, SalI, SspI, EcoRI) или 3 часов при 65С (при использовании эндонуклеазы рестрикции TfiI). Фермент инактивировался прогреванием в течение 20 минут при 65С или при 80С в зависимости от вида рестриктазы. Его удаление достигалось за счет добавления к раствору равного объема смеси хлороформ:изоамиловый спирт (49:1) с последующим центрифугированием на 13000 об/мин 15 минут. Полученная в результате верхняя (водная) фракция переосаждалась этанолом. Осадок ДНК растворялся в бидистиллированной воде или ТЕ-буфере (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5).
Амплификация ДНК с помощью полимеразной цепной реакции Состав реакционной смеси в расчете на одну пробу: 5 мкл 10x буфера для ПЦР; 1,5 мМ МgCI2; 0,8 мМ смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов; по 10 пмоль прямого и обратного праймеров; 20 нг матрицы; 2,5 ед Taq-полимеразы; бидистиллированная вода до конечного объема смеси 50 мкл. Программа амплификации включала в себя следующие стадии: 95С - 1 минуна, 30 циклов (95С - 40 секунд, 56С - 1 минута, 72С - 1 минута), 72С - 10 минут и охлаждение до 4С.
Определение стабильности комплекса SG - ДНК при проведении агарозного гель-электрофореза
Линейные дуплексы размером 1490 п. о., содержащие и не содержащие (CA/TG)31-повторы в своем внутреннем участке, для данного исследования были получены путем ПЦР-амплификации с использованием в качестве матрицы ДНК плазмид UC-CA31 и UC-RI (см. Материалы и методы) соответственно. Формирование структур Холлидея осуществлялось путем инкубации очищенных гомологичных ПЦР-фрагментов в TSM-буфере (6 мM Трис-HCl, 300 мM NaCl, 6 мM MgCl2, pH 7.8) при 37С в течение суток. Разделение полученной смеси на фракции четырехнитевых структур и дуплексной ДНК проводилось с помощью агарозного электрофореза с последующей экстракцией структур Холлидея из геля методом электроэлюции.
На основании данных электронной микроскопии, фракции структур Холлидея подразделялись на три группы исходя из расположения точки перекреста относительно концов молекул: I группа – 1-248 п.о., II группа – 248-496 п.о. и III группа – 496-745 п.о. Статистический анализ показал, что в популяции структур Холлидея, образованных фрагментам неповторяющейся последовательности, максимальное число крестообразных структур принадлежит I группе. Во фракции же структур Холлидея, образованных дуплексами, содержащими (CA/TG)31-повтор, максимальное число структур принадлежит II группе с локализацией точек перекреста в районе повтора (таблица 5). Таблица 5 - Локализация точки перекреста в популяциях структур Холлидея, образованных ПЦР-продуктами
Анализ локализации точки перекреста в популяциях структур Холлидея, образованных фрагментами плазмидной ДНК
В данном эксперименте структуры Холлидея были сформированы с помощью фрагментов ДНК размером около 900 п.о., полученных в результате обработки плазмид UC-CA31 и UC-RI эндонуклеазами рестрикции TfiI и SspI. Как и в предыдущем исследовании, очищенные гомологичные линейные дуплексы инкубировались в TSM-буфере (6 мM Трис-HCl, 300 мM NaCl, 6 мM MgCl2, pH 7.8) при 37С в течение 1 суток. Фракция образовавшихся структур Холлидея получена методом электроэлюции из геля.
По результатам электронной микроскопии структуры Холлидея были разделены на следующие группы, отражающие локализацию точки перекреста: I группа– 1-150 п.о., II группа – 150-300 п.о. и III группа – 300-450 п. о. от концов молекул.
Статистический анализ полученных данных показал, что как во фракциях структур Холлидея, образованных (CA/TG)31-содержащими фрагментами плазмиды, так и плазмидными фрагментами, не содержащими повторов, большинство структур принадлежит I группе (таблица 6).
Структуры Холлидея для данного эксперимента были сформированы фрагментами плазмид UC-CA31 и UC-CA25, несущими повторяющиеся последовательности соответствующей длины. При этом одна из популяций четырехнитевых структур была получена путем инкубации дуплексов с (CA/TG)25-повторами, а другая – в результате совместной инкубации как фрагментов, несущих последовательность (CA/TG)25, так и (CA/TG)31.
После инкубации в TSM-буфере (6 мM Трис-HCl, 300 мM NaCl, 6 мM MgCl2, pH 7.8) при 37С в течение суток, образовавшаяся популяция структур Холлидея изолировалась от дуплексной ДНК с помощью электроэлюции из агарозного геля.
Анализ данных электронной микроскопии показал, что локализация точки перекреста в области повторяющейся последовательности встречается достоверно чаще в популяции структур Холлидея, имеющих (CA/TG)25/31-гетерологию, по
Особенности олигонуклеотидной инвазии во внутреннюю комплементарную последовательность дуплексной ДНК
В предыдущих исследованиях нашей лаборатории был впервые продемонстрирован феномен взаимодействия (инвазии) олигонуклеотидов d(CA)10 и d(TG)10 с линейной и кольцевой молекулами ДНК, содержащими (CA/TG)31-последовательность [168]. При этом в случае неповторяющейся последовательности подобное взаимодействие обнаружено не был. Полученные данные свидетельствуют о существовании конформационных особенностей в области (CA/TG)n-последовательности, по всей видимости, лежащих в основе синаптической стадии ГР. Соответственно, представляет интерес дальнейшее изучения этого феномена. 3.2.2.1. Оптимизация метода визуализации ДНК-ДНК взаимодействий с помощью флуоресцентно меченных олигонуклеотидов
Во всех предыдущих исследованиях, касающихся ДНК-ДНК взаимодействий, для визуализации олигонуклеотидной инвазии в дуплексную ДНК использовались олигонуклеотиды, содержащие на 5 -конце радиоактивный фосфор 32Р. Однако применение этой методики осложняло проведение исследований, что было связано с временными затратами на пробоподготовку, коротким периодом полураспада радионуклидного изотопа и соблюдением техники безопасности при работе с ним. Таким образом, представлялось актуальным использование более современного подхода, основного на введение в состав олигонуклеотида флуоресцентной метки.
В ходе оптимизации были выбраны два флуоресцентных красителя: карбоксифлуоресцеин (FAM) и тетраметилкарбоксиродамин (TAMRA) и модель, ранее изученного В.К. Гасановой, встраивания олигонуклеотида в комплементарный концевой участок линейного дуплекса случайной последовательности (рис. 15) [179]
Оптимизация метода визуализации ДНК-ДНК взаимодействий с помощью флуоресцентно меченных олигонуклеотидов
Соматическая гомологичная рекомбинация – один из ведущих репарационных механизмов, обеспечивающий поддержание стабильности клеточного генома путем исправления наиболее опасных повреждений – двунитевых разрывов ДНК. На сегодняшний день известно, что дефекты в системе ГР лежат в основе развития целого ряда наследственных заболеваний, ассоциированных с высоким риском развития злокачественных новообразований, а мутации белков ГР встречаются в клетках большинства спорадических опухолей. Значительный прогресс в понимании механизмов ГР, связанный с изучением ее белковых систем, уже позволил использовать накопленные знания в области диагностики онкологических заболеваний, при составлении прогноза течения и выборе стратегии химиотерапевтического лечения. Однако многое в функционировании ГР по-прежнему остается непонятным. Известно, что рекомбинационные события распределены по геному неравномерно. В качестве основных претендентов на роль «горячих» точек рекомбинации выступают микросателлитные последовательности ДНК, и, в частности, (CA/TG)n-повторы.
Причины такого стимулирующего действия со стороны (CA/TG)n последовательностей не известны, но понимание механизма их влияние необходимо, ведь даже при нормальном функционировании, ГР может вносить значительный вклад в процесс канцерогенеза. Возникающая в ходе рекомбинации потеря гетерозиготности является одним из важнейших событий в патогенезе опухолевых заболеваний. Понимание механизмов влияния (CA/TG)n-повторов, во-первых, позволит выявить локусы с наибольшей предрасположенностью к потере гетерозиготности, что раскроет возможности для формирования групп риска и позволит более точно определять прогноз заболевания. Во-вторых, изучение структурных особенностей CA-микросателлитов расширит наше представление о работе системы ГР в целом, что, возможно, в будущем откроет перспективы для создания новых химиотерапевтических препаратов.
Наиболее вероятной причиной влияния (CA/TG)n-последовательности на ГР является наличие структурных особенностей данного региона. В настоящей работе проведено изучение структурно-функциональных характеристик poly(CA/TG), важных для ключевых этапов ГР: стадий инициации и терминации процесса. С помощью модельной системы, основанной на спонтанном формировании четырехнитевых структур в высококонцентрированных водных растворах дуплексной ДНК, электронной микроскопии и последующей статистической обработки полученных данных показано, что гетерология между микросателлитными локусами (CA/TG)n в шесть повторяющихся единиц ингибирует миграцию ветвей структуры Холлидея. Полиморфизм СА микросателлитов в популяции человека обеспечивает высокую вероятность гетерозиготности по этим локусам, что может быть одной из причин торможения «миграции ветвления» в процессе рекомбинации и увеличения частоты разрешения структур Холлидея именно в районе повторяющихся последовательностях. Кроме того, в данной работе продолжено, ранее начатое в лаборатории М.Г. Якубовской, изучение феномена встраивания коротких одноцепочечных ДНК в комплементарную им область CA-микросателлита дуплексной ДНК. С помощью плазмидной ДНК прокариот, а также геномной ДНК человека, установлено, что структурные особенности (CA/TG)n-повтора, лежащие в основе образования комплекса олигонуклеотид-ДНК, формируются in vivo. Кроме того, показано, что на процесс олигонуклеотидной инвазии практически не влияют условия микроокружения. Все эти данные свидетельствуют в пользу того, что встраивание одноцепочечных фрагментов d(CA)10 и d(GT)10 в (CA/TG)n-повторяющуюся последовательность обусловлено наличием в последней выпетливаний нескольких повторяющихся единиц. С другой стороны, полученные в настоящей работе данные о возможности встраивания олигонуклеотида d(GAA)7 в повторяющуюся последовательность (CTT/GAA)114, способную в условиях отрицательной сверхспирализации формировать H-структуру ДНК, а также о влиянии на интенсивность олигонуклеотидной инвазии длины (CA/TG)-повтора, свидетельствуют в пользу 107 образования CA-микросателлитом какой-либо неканонической структуры ДНК (G-квадруплекса, Z-формы), лежащей в основе наблюдаемого ДНК-ДНК взаимодействия. Дальнейшее изучение CA-микросателлитов с использованием различных про- и эукариотических систем позволит более точно выявить те структурные особенности, которые определяют возможность встраивания d(CA)10 и d(GT)10, а следовательно и стимулируют синаптическую стадию ГР.
