Введение к работе
Актуальность темы
Хромосомный аппарат клетки является основным, но не единственным нилищем генетической информации. Описано два типа экстрахромосомных ментов - амплифицированные последовательности и малые іидисперсньїе кольцевые ДНК. Если вторые распространены весьма широко рмальные и опухолевые клетки, клеточные культуры и ткани животных), то вые встречаются исключительно в опухолевых клетках как проявление сущей им общей нестабильности генома и играют важную роль в церогенезе (Stark, 1994).
Недавно двумя независимыми методами [пульс-электрофорез
апсулированной в агарозе интактной ДНК (Smith and Cantor, 1987) и
Ьференциальная экстракция ДНК из иммобилизованных нуклеопротеидных
плексов (Lichtenstein et al., 1991)] в ядрах клеток млекопитающих были
аружены минорные (-2-3% тотальной ДНК) фракции так называемой
бодной ДНК, не связанной физически с хромосомной ДНК и существенно
ичающейся от последней своими метаболическими свойствами (Сухова и
1996). Поскольку общеизвестна роль экстрахромосомных элементов в
церогенезе, представляло интерес выяснить, какова природа
аруженных ДНК, в частности, являются ли они продуктами деградации мосом, или же существуют in vivo как особые элементы неизвестного ранее а.
В связи с этими предположениями казалось оправданным, используя в эстве экспериментальных моделей нормальные и опухолевые клетки, педовать структурные и метаболические свойства свободных ДНК: скорость геза и его чувствительность к различным ингибиторам, топологию, пределение уникальных и повторяющихся последовательностей, іскрипционную активность.
Цель и задачи исследования
В данной работе предполагалось исследовать ряд функционально важных їств свободных ДНК в сопоставлении с таковыми хромосомных ДНК на елях.нормальных и опухолевых клеток:
-
Синтез в различных условиях клеточного роста.
-
Присутствие структурных генов (некоторых протоонкогенов) и горяющихся последовательностей, используя методы молекулярной іидизации и PCR.
-
Топологические свойства.
-
Транскрипционную активность.
-
Попытаться визуализировать свободные ДНК методом избирательного вния BUdR с последующим иммунохимическим окрашиванием.
Научная новизна работы
Некоторые исследователи находили в ядрах эукариотических кле молекулы, не связанные с хромосомной ДНК и отличающиеся по ряду свойї от известных типов экстрахромосомных элементов, но рассматривали преимущественно как результат апоптического распада ДНК. Свидетельства автономного существования, основывающиеся на анализе метаболизма топологических свойств, получены впервые.
Научно-практическая значимость исследования
В результате исследования получена новая информация о неизвестної настоящее время типе экстрахромосомных элементов, о их метаболиз внутриклеточной локализации, транскрипционной активности. Эти данные мо пролить новый свет на механизмы возникновения и эволкн экстрахромосомных элементов, играющих большую роль в канцерогенезе.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены совместной научной конференции лабораторий вирусного канцерогенезг биохимии опухолей НИИ канцерогенеза ОНЦ РАМН (февраль 1997 г.).
Структура диссертационной работы
Диссертация построена по традиционному плану. Обзор литерат^ состоит из трех глав. Собственные исследования автора приведены в се главах, завершающихся разделами "Обсуждение результатов" и "Выво/з Указатель литературы включает 121 наименование. Диссертаї иллюстрирована 19 рисунками.
Принятые сокращения: хрДНК - хромосомные ДНК; свДНК - cвoбoд^ ДНК; мтДНК - митохондриальная ДНК; FUdR - 5-фтор-2'-дезоксиуридин; BUd 5-бром-2.'-дезоксиуридин; FIGE - пульс-электрофорез в инвертированном по PCR - полимеразная цепная реакция; SSCP - конформационный полиморфі однонитевых фрагментов; ФДХ - фибробласты джунгарского хомя1 трансформированные SV40 (линия 4/21); УФ - ультрафиолетовое облучение.
Объекты исследования. В работе использовали культивируемые клетки HeLa (рак шейки матки человека), НТ1080 (фибросаркома легких человека) Rasheed et al., 1974), Namalwa (лимфома Беркитта) (Klein et al., 1972), эйробластомы мыши N1E-115 (Amano et al., 1972), ФДХ, а также ткани ивотных (мышей, крыс) и биоптаты, полученные при оперативном удалении ценокарциномы желудка (в качестве нормальной ткани использовали пизистую желудка, окружающую опухоль). Клетки HeLa выращивали в среде 39, содержащей 10% эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота. ФДХ сращивали в однослойной культуре на минимальной среде Игла с 10% ибриональной сывороткой в присутствии стрептомицина или гентамицина
000 ед/мл среды). Клетки N1E-115 выращивали в однослойной культуре в
зеде DMEM с 10% эмбриональной сывороткой и с пенициллином и
грептомицином.
Мочение ДНК радиоактивными предшественниками. В качестве адиоактивной метки использовали [3Н]тимидин (уд. рад. 54 Ки/ммоль) и С]тимидин (уд. рад. 42 мКи/ммоль). Радиоактивные предшественники збавляли в культуральную среду в концентрации 0,1-0,25 мкКи/мл и клетки этили на протяжении от 1 час до нескольких суток.
Экспериментальным животным внутрибрюшинно вводили [3Н]тимидин ,0-1,5 мкКи на грамм веса в сутки) на протяжении 2-3 сут. Животных ібивали, кусочки тканей печени, селезенки, мозга и тимуса измельчали, а ітем гомогенизировали в гомогенизаторе Даунса с лизирующим раствором, (держащим 2% Тритон Х-100. Содержание ДНК в пробах определяли луоресцентным методом с использованием красителя Hoechst 33258. змерения проводили на спектрофлуориметре Perkin-Elmer 3000 (длина волны (збуждения - 365 нм, длина волны эмиссии - 458 нм). Калибровочную кривую роили, используя растворы ДНК известной концентрации. Радиоактивность -IK определяли следующим образом. ДНК из проб с известной концентрацией м. выше) осаждали 10% ТХУ при 2-4С 30 мин, переносили на фильтры GF/C i/hatman, Англия), промывали 2 раза 10% ТХУ и 1 раз 70% этанолом, >1сушивали и измеряли радиоактивность в толуоловом сцинтилляторе на іетчике Mark II (Nuclear Chicago,США).
Нуклеопротеидцелитная хроматография ДНК. Клетки (0,5 - 1,0 х 106; 5 -
1 мкг ДНК) разрушали в лизирующем буфере (Забойкин и др., 1991) в
могенизаторе Даунса. Лизаты клеток смешивали с суспензией 1,5 г целита
\5 (60-80 mesh, L.P.C. Chemicals and Dyes, London) в 5-10 мл буфера ТМ при
С и полученной смесью заполняли термостатируемую хроматографическую
лонку. Из иммобилизованных на целите нуклеопротеидов экстрагировали
НК тремя последовательными градиентами диссоциирующих агентов: NaCI,
Dl-мочевины и температуры (Lichtenstein et al., 1991).
Стандартный электрофорез ДНК. Фракционирование молекул ДНК пс размеру осуществляли с помощью электрофореза в горизонтальном 1%-ноы геле агарозы (Chemapol, Praha, Czechoslovakia), приготовленном на буфере ТРЕ (Maniatis et al., 1984), 2-3 ч при комнатной температуре и напряжении 4-4.S В/см. При анализе продуктов PCR (полимеразная цепная реакция] электрофорез проводили в горизонтальном 3,5% (2,5% Chemapol + 1% NuSieve Sigma) агарозном геле в 0,5 х ТРЕ буфере, 30 - 40 мин при комнатной температуре и напряжении 4-4,5 В/см. Бромистый этидий (0,5 мкг/мл] добавляли в электрофоретический буфер. Гели фотографировали на УФ-трансиллюминаторе.
Пульс-электрофорез ДНК. Клетки инкапсулировали в низкоплавкой агарозе (Sigma), ДНК депротеинизировали стандартным методом (Smith апс Cantor, 1987). ДНК в агарозных вставках (1,5-6 мкг в 10-40 мкл) подвергала пульс-электрофорезу в вертикальном геле 1%-ной агарозы в разбавленном (вдвое) ТФЭ-буфере (Maniatis et al., 1984), 3 ч при 200 В и 17-20 С, используя для задания импульсов электрического поля прибор РС-750 (Hoefer) Длительность импульса вперед - 0,3 с, назад - 0,1 с (ramp factor 6.6). В качестве маркеров использовали мультимеры ДНК фага лямбда. Гели окрашивала бромистым этидием (0,5 мкг/мл) или красителем Hoechst 33258 (2,5 мкг/мл) Фракции ДНК, разделенные в пульсирующем поле (хрДНК - на старте геля свДНК - в геле), выделяли сорбцией на стекловолоконных фильтрах.
Топологическое тестирование ДНК. ХрДНК и свДНК разделяли пульс электрофорезом, как описано ранее, гели окрашивали бромистым этидием (0,1 мкг/мл) 20 мин, после чего вырезали нужные полосы. ДНК в срезах агарозь облучали при комнатной температуре в интервал доз от 0 до 20 крад (источник 137Cs, 524 рад/мин). Срезы после облучения выдерживали 1 сут при 4С, после чего подвергали пульс-электрофорезу в стандартных условиях. В качестве контроля использовали линейные молекулы ДНК размером 225 т.п.н (хромосома I S. cerevisiae), полученные из набора маркеров (CHEF ONA size standard, Bio-Rad Laboratories).
Концевое мечение ДНК in situ. Содержащие ДНК блоки агарозы суспендировали в 100 мкл 50 мМ NaCI, 10 мМ Трис-НСІ.рН 7.5, 10 мМ MgCI2, 1 мМ дитиотреитол, добавляли 2 ед. фрагмента Кленова, 20 мкКи [32P)dCTP остальные dNTP (20 мкМ), после чего инкубировали 20 мин при комнатное температуре (Maniatis et al., 1984). Реакцию останавливали охлаждением е ледяной бане. Пульс-электрофорез проводили, как описано выше, rem высушивали и авторадиографировали.
Иммунохимическое окрашивание ДНК. Клетки нейробластомы мыип N1E-115, активно растущие или терминально дифференцированные t результате лишения сыворотки на протяжении 3 сут, метили в течении 1 сут К мкМ BUdR в присутствии 1 мкМ FUdR (FUdR, ингибитор тимидилатсинтетазы применяли для повышения включения BUdR в ДНК благодаря сниженик
юнкуренции эндогенным тимидином). Препараты споласкивали раствором <енкса, клетки фиксировали 30 мин в смеси 95% этанола и 5% ледяной уксусной кислоты при комнатной температуре, после чего обрабатывали 3 N HCI 15 мин для денатурации ДНК. После многократного промывания фиксированных клеток раствором Хенкса (до рН 7,0) и удаления влаги вокруг жализируемого участка, последний покрывали 100 мкл раствора лоноклональных антител к BUdR (разведение 1:100) и инкубировали 1 ч при юмнатной температуре в боксе, насыщенном водными парами. Препараты инкубировали 30 мин при комнатной температуре с анти-мышиными іммуноглобулинами, конъюгированными с пероксидазой (разведение 1:150). ДНК, включившую BUdR, окрашивали 7 мин раствором :убстрат/интенсификатор (Cell Proliferation Kit, Amersham, U.K.).
Дот-гибридизация ДНК. ДНК наносили на нейлоновые фильтры (Hybond і, Amersham) описанным ранее методом (Lichtenstein et al., 1989). После іереноса, фильтры споласкивали 2 х SSC, высушивали, после чего ДНК риксировали 3 мин УФ-облучением. Предгибридизацию и гибридизацию іроводили 16-24 час при 42С. Предгибридизационный раствор - 5 х SSC, 50% іеионизированньїй формамид, 0,1% SDS, 1 мМ ЭДТА, 0,1% BLOTTO, 100 ікг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Для увеличения концентрации онда в состав гибридизационного раствора вводили 5,5% полиэтиленгликоль 000 (Sigma). ДНК зонда метили в , реакции ник-трансляции. После ибридизации фильтры отмывали 4 раза по 5 мин в 2 х SSC, 0,1% SDS при омнатной температуре и 4 раза по 15 мин в 0,1 х SSC, 0,1% SDS при 55 С.
PCR. При помощи регулируемого термостата "РТ 3.2/Г (Биолюкс, Іущино, Россия) проводили 35 циклов (плавление - 95С, 1,2 мин; отжиг - 55С-3С, 1 мин; полимеризация - 72 С, 1,5 мин). Первый цикл денатурации ДНК - 3 іин, последний цикл элонгации - 7 мин. Поиск оптимальных праймеров существляли при помощи компьютерной программы (A computer program for election of oligonucleotide primers for polymerase chain reactions. Nucl. Acids. Res. 8, No 7, 1757-1761). Для определения температуры отжига использовали оотношение - 2С (AT) + 4С (GC). Использовали следующие пары праймеров: ) для гена c-Ha-ras1 человека - 5'-GTCATTGATGGGGAGACGTG-3' (sense), 5'-lACTTGGTGTTGTTGATGGC-3' (antisense); амплифицируемый фрагмент - 134 .н.; б) для гена с-тус человека (экзон 3) 5'-ACGCAGCGCCTCCCTCCACT-3' sense), 5'-GCTCGTTCCTCCTCTGGCGC-3' (antisense); амплифицируемый юагмент - 183 п.н; в) для гена L-myc человека (интрон 2) - 5'-AGTTCACTCACA-iGCCACAT-3' (sense); 5'-TGCATATCAGGAAGCTTGAG-3' (antisense); ампли->ицируемый фрагмент - 267 п.н.
Сшивание матрицы ДНК с новообразованной РНК. Клетки НТ1080, зстущие в среде Игла, метили [3Н]уридином (20 мкКи/мл) 2 ч, после чего іетки лизировали в слабо притертом гомогенизаторе Даунса 5 мин в изирующем растворе (Забойкин и др., 1991). Лизат переносили в пластиковую
чашку Петри, предварительно охлажденную в ледяной бане, добавляли I метоксипсорален до конечной концентрации 5 мМ, и облучали сниа посредством LKB 2011 MacroVue transilluminator (8 mW/см, дважды по 5 мин интервалом 5 мин для охлаждения). После облучения ядра осаждал низкоскоростным центрифугированием (1000 х д), инкапсулировали в агарозі обрабатывали протеиназой К и SDS и подвергали FIGE. Из окрашеннь бромистым этидием гелей вырезали нужные участки, элюировали из них ДНК определяли радиоактивность [3Н]РНК, приходящуюся на 1 мкг ДНК.
