Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Апотоз, некроз, днк повреждения, свободно-радикальные процессы и обмен холестерина при травме и кровопотере (обзор литературы)
1.1. Виды клеточной гибели.
1.2. Свободно-радикальные процессы в норме и при травме .
1.3. Антиоксидантная система в норме и при травме.
1.4. Транспортная система липидов крови и ее нарушения при травме .
ГЛАВА 2. Характеристика клинических наблюдений и методы исследовнаия
2.1. Общая характеристика больных с тяжелой сочетанной травмой и кровопотерей
2.2. Методы исследований
2.2.1. Исследование апоптоза, некроза, ДНК-повреждений, показателей свободнорадикальных процессов
2.2.2. Исследование липидного профиля и биохимических показателей
2.2.3. Исследование показателей центральной гемодинамики 60
ГЛАВА 3. Результаты исследования и их обсуждение 62
3.1. ДНК-повреждения у больных с тяжелой сочетанной травмой
3.2. Свободнорадикальные процессы у больных с тяжелой сочетанной травмой
3.3. Липидный профиль плазмы в первые две недели после тяжелой сочетанной травмы 73
3.4. Биохимические показатели в первые две недели после тяжелой сочетанной травмы
3.5. Липидный профиль, биохимические показатели крови и показатели центральной гемодинамики в отдаленном периоде тяжелой сочетанной травмы
Заключение 96
Выводы юз
Практические рекомендации 105
Список литературы
- Свободно-радикальные процессы в норме и при травме
- Транспортная система липидов крови и ее нарушения при травме
- Исследование апоптоза, некроза, ДНК-повреждений, показателей свободнорадикальных процессов
- Свободнорадикальные процессы у больных с тяжелой сочетанной травмой
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из важнейших проблем современной реаниматологии является исследование механизмов развития критических, терминальных и постреанимационных состояний на органном, клеточном и молекулярном уровнях (В.А. Неговский, 1999; В.В. Мороз, 2003). В структуре летальности механические повреждения различной этиологии занимают в настоящее время третье место после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. Тяжелая сочетанная травма (ТСТ) является ведущей причиной гибели лиц молодого - 18-45 лет - работоспособного возраста, что обуславливает социальную значимость этой проблемы (Г.Н. Цыбуляк, 1995; Е.К. Гуманенко, 1997).
Тяжелая сочетанная травма сопровождается развитием декомпенсации систем жизнеобеспечения организма, возникающего в результате комплексного влияния факторов повреждения: кровопотери, гипоксии, токсемии, боли, нарушения специфической функции жизненно важных органов. Доминирующими из этих факторов являются кровопотеря и гипоксия (Д.А. Остап-ченко, 2005). При несвоевременном оказании интенсивной помощи тяжесть состояния больного усугубляется развитием шока, который характеризуется общими гемодинамическими, гемореологическими и метаболическими расстройствами. Известно, что ТСТ приводит к нарушению практически всех видов обмена веществ (Е.В. Гембицкий, 1994). Вместе с тем, состояние обмена холестерина и его транспортной системы - липопротеидов, в разные периоды течения ТСТ до сих пор остается малоизученным. Имеются лишь единичные данные о возможности формирования дислипидемии у таких больных (Л.В. Молчанова и Л.Н. Щербакова, 2008; А.А. Бессекеев, 2006). Одной из важных причин нарушения метаболизма возможно считаются структурно-функциональные изменения клеток, происходящие в условиях нарушения физиологического равновесия между анти- и прооксидантными процессами (В.А. Неговский, 1986).
Свободнорадикальные процессы, ведущие к структурно-функциональным нарушениям в органах и тканях, могут быть запускающими механизмами патологических процессов при критических состояниях. Нарушения физиологического равновесия между анти- и прооксидантными процессами в результате полученной травмы происходят за счет избыточной генерации активных форм кислорода (АФК) из-за блокады электронно-транспортной цепи митохондрий в посттравматическом периоде (С. Goo-dyear-Brach et al., 2002; M. Keel et al., 2005). АФК исходно являются продуктами нормального клеточного метаболизма. При патологических состояниях их генерация значительно увеличивается и не компенсируется антиокси-дантной системой защиты, в результате чего АФК вызывают выраженные цитотоксические эффекты. Поскольку период жизни АФК слишком мал, то оценить уровень их продукции в клинических условиях практически невозможно. Поэтому определение увеличения продукции АФК осуществляют косвенным путем - по содержанию ряда метаболитов, образующихся в результате окислительной модификации липидов, белков и нуклеиновых кислот (Г.А. Рябов и соавт., 2002). Повреждения ДНК включают однонитевые
и/или двунитевые разрывы цепей ДНК, модификацию азотистых оснований и др. Ранее было показано, что из четырех оснований, входящих в структуру ДНК, гуанин является наиболее окисляемым (М. Dizdaroglu et al., 1992). Продуктом его окисления, в результате воздействия АФК, является 8-гидрокси-2-дезоксигуанозин, который можно определить в различных биологических тканях и жидкостях (А.К. Жанатаев и соавт., 2002). Количественное определение 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина предложено использовать в качестве одного из маркеров свободнорадикальных процессов, происходящих в организме в норме и при развитии патологического процесса. Определение ДНК-повреждений в качестве биологического индикатора свободнорадикальных процессов может иметь существенное значение для раскрытия механизмов развития патологического процесса и при мониторинге терапии, а также для оценки прогноза заболевания. Реагируя с ненасыщенными жирными кислотами, входящими в состав мембранных липи-дов, АФК инициируют цепную реакцию их пероксидации, что сопровождается рядом нарушений в свойствах биологических мембран и функционировании клеток.
На сегодняшний день нет четких представлений о ДНК-повреждениях при критических состояниях и, в частности, при тяжелой сочетанной травме (В.Л. Кожура и соавт., 1999; R.S. Hotchkiss et al., 1999; J. Guan et al., 2002; J. Pachl et al., 2005). Повреждающему действию АФК на клеточные структуры в организме противостоит сложная многокомпонентная антиоксидантная система. С помощью этой системы обеспечивается поддержание про/антиокислительного баланса. Природные антиоксиданты являются представителями разных классов химических соединений, в связи с чем разнообразны и механизмы их антиоксидантного действия. Снижение уровня антиоксидантной защиты у пациентов в критических состояниях описано многими авторами (H.F. Goode et al., 1995; Е. Borrelli et al., 1996). При этом вопрос о необходимости ее усиления с помощью экзогенных антиоксидан-тов остается нерешенным (R. Lovat et al., 2003).
Цель работы.
Выявить новые механизмы развития посттравматических изменений путем исследования повреждения ДНК, апоптоза, некроза и ряда биохимических показателей у пострадавших с тяжелой сочетанной травмой.
Задачи исследования:
Оценить динамику ДНК-повреждений, апоптоза и некроза клеток крови у пострадавших в первые две недели после тяжелой сочетанной травмы.
Исследовать динамику содержания 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина клеток крови и общего антиокислительного статуса у пострадавших в первые две недели после тяжелой сочетанной травмы.
Выявить динамику биохимических показателей и липопротеинов крови у пострадавших в первые две недели после тяжелой сочетанной травмы.
Определить уровень общего холестерина, холестерина липопротеинов и ряда биохимических показателей крови у лиц, перенесших тяжелую со-четанную травму в отдаленном посттравматическом периоде.
Исследовать изменения эластических свойств стенки артериальных сосудов у пострадавших, перенесших тяжелую сочетанную травму в отдаленном посттравматическом периоде.
Научная новизна.
Впервые у пострадавших с тяжелой сочетанной травмой доказано, что в патогенезе посттравматических процессов имеет значение выявленное увеличение количества ДНК-повреждений, ассоциирующееся с усилением клеточной гибели - некрозом и апоптозом.
Показано в динамике изменение содержания суммарного показателя свободно-радикальных процессов - 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина - у пострадавших в первые две недели после тяжелой сочетанной травмы, свидетельствующее о дисбалансе про-/антиокислительной системы в организме и о необходимости проведения исследований по изучению коррекции антиокислительного статуса.
Оценено состояние гемодинимических и биохимических показателей в отдаленном периоде у выживших больных. Впервые у пострадавших, перенесших травму с нарушением гемодинамики, в отдаленном посттравматическом периоде обнаружено уменьшение эластических свойств артериальной стенки путем оценки изменений ее податливости и скорости распространения пульсовой волны, что требует ежегодного диспансерного наблюдения за этими больными.
Практическая значимость.
Увеличение количества ДНК-повреждений клеток крови у пострадавших с тяжелой сочетанной травмой, усиление клеточной гибели дает представление о механизмах развития постгравматических патологических процессов.
Динамика общего антиокислительного статуса в первые две недели у больных с тяжелой сочетанной травмой свидетельствует о необходимости проведения дополнительной более эффективной антиоксидантной терапии.
Увеличение жесткости сосудов, сохранение в течение нескольких лет дислипидемии и повышенной активности щелочной фосфатазы у пострадавших в отдаленном периоде после тяжелой сочетанной травмы, позволяет предположить, что они нуждаются в диспансерном наблюдении.
Апробация работы. Результаты исследования по материалам диссертации доложены на:
19th Annual Congress European Society of Intensive Care Medicine (ESICM-2006), 24-27 сентября 2006 г, Барселона, Испания;
всероссийской научно-практической конференции «Экстренная медицинская помощь при чрезвычайных ситуациях техногенного характера в
крупном промышленном центре», 2007 г, Новокузнецк;
14th World Congress of Anesthesiology (WCA-2008), 2-7 марта 2008 г, Кейптаун, ЮАР;
28th International Symposium on Intensive Care and Emergency Medicine (ISICEM-2008), 18-21 марта 2008 г, Брюссель, Бельгия;
IX сессии MHO АР, 28 марта 2008 г, Голицыно;
Всероссийском конгрессе анестезиологов-реаниматологов с международным участием, посвященном 100-летию академика РАМН В.А. Негов-ского, 18-20 марта 2009 г, Москва.
Внедрение результатов исследования в практику. Новые данные о патогенезе общепатологических реакций организма у больных с тяжелой сочетанной травмой в первые дни после травмы используются в учебном процессе в Государственном Учреждении Научно-исследовательском Институте общей реаниматологии РАМН и учитывается при ведении пострадавших в отделении общей реанимации городской клинической больницы имени СП. Боткина.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.
Основные положения, выносимые на защиту.
При тяжелой сочетанной травме наблюдается увеличение процессов ДНК повреждений, ассоциирующееся с усилением клеточной гибели.
Выявлены различия в динамике изменений показателей обмена холестерина, свободно-радикальных процессов и ряда биохимических показателей (общего белка, активности гамма-глютамилтрансферазы, аспартатами-нотрансферазы и коэффициента де Ритиса) в ранние сроки после травмы в группах выживших и умерших больных, часть из которых имеет прогностическое значение.
В отдаленном периоде у пострадавших после тяжелой сочетанной травмы отмечается нормализация обмена холестерина и биохимических показателей.
Результаты исследования эластических свойств артериальной стенки свидетельствуют об увеличении жесткости сосудов в отдаленном периоде у пострадавших после тяжелой сочетанной травмы с нарушением гемодинамики, как отдаленные неблагоприятные последствия тяжелой сочетанной травмы.
Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на I2.k страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных методов и материала исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 14 рисунками. Список литературы включает № источника, из которых ? 5 отечественных и И Г иностранных.
Свободно-радикальные процессы в норме и при травме
После индукции апоптоза дальнейшая судьба клетки зависит от присутствия, активации или индукции многочисленных факторов, модулирующих этот процесс. Среди них наиболее важное значение имеют регуляторы апоптоза семейств Всі 2 и ІАР.
Семейство Всі 2. Белки Всі 2 семейства регулируют апоптоз на уровне митохондрий, препятствуя выходу цитохрома С. Предотвращающие апоптоз представители этого большого семейства включают собственно Всі 2, а также Bel xL, Bel w, Mel 1, Al и Boo; проапоптозные белки - Bax, Bad, Bok, Bel xS, Bak, Bid, Bik, Bim, Krk и Mtd. Цитозольный Bid (p22), увеличение которого было обнаружено при травме [102], расщепляется каспазой 8, активируемой через «рецепторы смерти», и лизосомными протеазами катепсинами. Образующийся активный белок, так называемый truncated Bid (t Bid), изменяет конформацию другого проапоптозного белка - Вах, повышенное количество которого в клетках селезенки наблюдается при травме в эксперименте на мышах [134], после чего тот встраивается во внешнюю мембрану митохондрий, где образует комплекс с порином. Вместе они образуют канал, по которому из межмембранного пространства выходят цитохром С и другие проапоптозные белки. Проапоптозные белки этого семейства, в покое обычно связанные с цитоскелетом, при запуске апоптоза переносятся в митохондрии, где инактивируют встроенные в их мембраны антиапоптозные белки. Всі xL и вышеупомянутый Вах образуют ионные каналы в искусственных мембранах, что позволяет предполагать регуляцию апоптоза через образование пор. Всі 2 действует как антиоксидант и блокирует выход цитохрома. Уменьшение данного белка в первые 72 часа после травмы в клетках селезенки наблюдается в эксперименте на мышах [134].
Семейство ІАР. Поскольку активация каспаз приводит к необратимым последствиям, их активность тщательно регулируется. В этом принимают участие ингибиторы белков апоптоза (inhibitors of apoptosis proteins, IAPs) [104, 144, 177]. Идентифицировано восемь белков этого семейства, которые ингибируют каспазы 3, 7 и 9. Помимо ингибирования каспаз, белки семейства IAP могут ингибировать апоптоз, влияя на прохождение клеточного цикла, деление клеток и передачу сигнала апоптоза. Как все ингибиторы протеаз они сами подвержены отрицательной регуляции. Антиапоптотическая активность белков семейства ІАР в клетке может подавляться специфическими белками-ингибиторами Smac/DIABLO и Omi/HtrA2. В частности, митохондриальный полипептид Smac/DIABLO, выходя из митохондрий в цитозоль, связывается с ними и нарушает связывание белков семейства IAP с каспазами, ускоряя, таким образом, активацию каспаз [130]. Также ведет себя Omi/HtrA2.
Катепсин В, лизосомная цистеиновая протеаза, также принимает участие в апоптозе [128]. Каспаза 8 вызывает выход активного катепсина из лизосом, а тот усиливает выход цитохрома из митохондрий. Некоторые Са -связывающие белки, например ALG 2 (apoptosis linked gene 2), тоже принимают участие в апоптозе. Взаимодействующий с ним белок Alix (ALG interacting protein X, известный также как AIP1), регулирует апоптоз, связываясь с TNFR [147].
Морфологические признаки апоптоза.
Важно отметить, что во всех случаях апоптоза, в норме или при патологических процессах, морфология процесса гибели клеток очень сходна. В ядре регистрируются первые морфологические признаки апоптоза - конденсация хроматина с формированием его осмиофильных скоплений, прилежащих к ядерной мембране. Позже появляются инвагинации ядерной мембраны, и происходит фрагментация ядра [181]. В основе деградации хроматина лежит ферментативное расщепление ДНК [84]. Происходит нарушение целостности всех мембранных структур, в первую очередь лизосом, и, как следствие, аутолиз клетки. Во время некроза клетка вакуолизируется (изменяется строение цитоплазматической мембраны, внутрь клетки поступает вода, происходит набухание органелл). Клетка отделяется от внеклеточного матрикса, нарушается структура цитоплазматической мембраны что и, в итоге, приводит к образованию апоптотических телец. Морфологические черты характерные для апоптоза и некроза были обнаружены в нейтрофилах, макрофагах и альвеолярных клетках в эксперименте при моделировании гемморагического шока [136].
Повреждения ДНК при апоптозе. ДНК повреждения могут быть как причиной, так и следствием апоптоза. Индукция апоптоза при повреждении ДНК обусловлена появлением в клетке нерепарируемых повреждений ДНК. При этом происходит активация ряда протеинкиназ. Протеинкиназы фосфорилируют и активируют белковый фактор транскрипции р53. Активация р53 ведет к подавлению транскрипции генов антиапоптогенных белков (Всі 2, NF-кВ) и активации р53-зависимой транскрипции генов проапоптотических белков Вах и Fas. р53 так же принимает участие в запуске апоптоза, активируя PUMA (р53 upregulated modulator of apoptosis), который затем связывает Всі 2 и тем самым стимулирует выход цитохрома С из митохондрий [149, 192]. Активация р53 приводит к блоку клеточного цикла деления.
Транспортная система липидов крови и ее нарушения при травме
Проявлению повреждающего действия свободных радикалов в организме препятствует сложная многокомпонентная антиоксидантная система, которая обеспечивает связывание и модификацию радикалов, предупреждение их образования или гидролиз перекисей. С помощью этой системы обеспечивается механизм поддержания свободнорадикального окисления на уровне, необходимом для нормального течения окислительных процессов. У пострадавших с тяжелой сочетанной травмой кроме интенсификации свободнорадикальных процессов имеет место угнетение антиокислительной активности крови и отдельных ее звеньев [4, 13].
Неферментативная антиоксидантная защита связана с участием соединений низкомолекулярной и высокомолекулярной природы. Низкомолекулярные антиоксиданты делятся на жиро- и водорастворимые [27, 29, 42]. К первым относят токоферолы, витамин А и каротиноиды, билирубин, убихинон, витамин Р, витамин К, стероидные гормоны. Термин «витамин Е» является собирательным названием для группы токоферолов - а, р\ у. Наиболее высокой антиоксидантной активностью среди них обладает а-токоферол, локализующийся в гидрофобном слое мембран, в котором в основном протекают процессы ПОЛ. Биологические мембраны содержат примерно одну молекулу а-токоферола на одну тысячу молекул липидов. Токоферолы, доля которых в суммарной антиокислительной активности липидов составляет около 30%, эффективно ингибируют процессы ПОЛ, взаимодействуя за счет переноса электрона на токоферол, с последующим восстановлением его аскорбиновой кислотой, которая окисляется до дегидроаскорбиновой. Большинство плазменных токоферолов обнаруживаются в липидах плазмы, которые в свою очередь снижены у пациентов находящихся в критических состояниях. Токоферол оказывает антиоксидантное и мембраностабилизирующее действие, однако, применение его при неотложных состояниях малоэффективно вследствие необходимости длительного накопления его в тканях для достижения необходимой для терапевтического эффекта концентрации.
К водорастворимым антиоксидантам принадлежат глутатион, а так же аскорбиновая кислота, мочевая кислота, серосодержащие аминокислоты. Витамин С рассматривается не только как синергист витамина Е, но и может непосредственно взаимодействовать с синглетным кислородом, гидроксильным радикалом и супероксидным радикалом, а так же разрушать перекись водорода. Было показано прогностическое значение определения концентрации аскорбиновой кислоты и а-токоферола в развитии полиорганной недостаточности [88]. Раннее добавление в схему лечения пострадавших с травмой аскорбиновой кислоты и а-токоферола препятствует развитию органной дисфункции/недостаточности [151].
Некоторые из низкомолекулярных антиоксидантов, такие как глутатион, убихинон, мочевая кислота образуются в организме, другие, такие как витамины Е, С, каротиноиды должны поступать с пищей.
Представители высокомолекулярного неферментативного звена антиоксидантной системы - белки церулоплазмин, альбумин, лактоферрин, трансферрин — играют ключевую роль в антиоксидантной защите. Церулоплазмин связывает и переносит ионы меди, обладающие прооксидантной активностью и участвует в окислении Fe2+ до Fe3+, которое не принимает участия в реакциях, ведущих к образованию свободных радикалов. У больных с ТСТ возникают глубокие нарушения транспортной способности альбумина, выраженность которых зависит от тяжести состояния больных и величины кровопотери [32].
Ферментативное звено антиоксидантной системы представлено супероксиддисмутазой (СОД), каталазой и глутатион-пероксидазой. СОД участвует в каталитическом превращении супероксидного радикала в перекись водорода и кислород. Каталаза катализирует разрушение перекиси водорода. Глутатион-пероксидаза катализируют реакции взаимодействия глутатиона с гидроперекисями жирных кислот. Каталитическая активность этих ферментов связана с наличием в их активном центре микроэлементов. К числу таких микроэлементов относятся в частности селен, входящий в состав глутатионпероксидазы, цинк, медь и марганец, входящие в структуру СОД. Нарушения метаболизма микроэлементов было обнаружено у пациентов с травмой [86].
Показатели, характеризующие состояние системы антиоксидантной защиты - содержание сульфгидрильных (SH-) и дисульфидных групп (SS-) [31], аскорбиновой кислоты и ее окисленных форм [69], супероксидисмутазы [74] - могут быть использованы для оценки степени тяжести эндогенной интоксикации, которая развивается в ранние сроки после получения травмы в результате первичного повреждения тканей и является одной из основных причин формирования полиорганной недостаточности.
На сегодняшний день не существует достаточно четкой концепции применения тех или иных лечебных факторов, способных положительно влиять на восстановление баланса про /антиокислительной системы. Исследование Д.А. Остапченко показало, что у больных с тяжелой травмой груди и кровотечением введение перфторана в дозе 6-8 мл/кг в раннем посттравматическом периоде оказывает нормализирующее действие на интенсивность окислительных и антиокислительных процессов [57].
Исследование апоптоза, некроза, ДНК-повреждений, показателей свободнорадикальных процессов
Всем больным с ТСТ, поступившим в отделение реанимации больницы им СП. Боткина, после оценки тяжести пострадавшего и состояния его витальных функций проводили традиционный комплекс интенсивной терапии согласно основным принципам лечения острой кровопотери и травматического шока, предложенным членом-корреспондентом РАМН, профессором В.В. Морозом [46]:
1. Устранение шокогенного фактора. У 61 (79,2%) больных в течение 1-4 часов с момента поступления в стационар после стабилизации гемодинамики на достаточном уровне, согласно показаниям, выполнено оперативное вмешательство. Всем больным в качестве анестезиологического пособия проводился многокомпонентный эндотрахеальный наркоз. Пациенты оперированы на фоне респираторной, инотропной и/или вазотропной поддержки. Физический статус пострадавших соответствовал IV классу классификации объективного статуса пациента Американского общества анестезиологов (ASA - American Society of Anesthesiologists).
2. Восстановление, поддержание эффективного объема циркулирующей крови, поддержание должной реологии, восстановление эффективной микроциркуляции и перфузии тканей, коррекция ацидоза, белкового, электролитного и водного дисбаланса осуществлялись с помощью заместительной инфузионно трансфузионной терапии, объем которой в среднем составлял 90-110 мл/кг/сутки. Структура инфузионно-трансфузионной терапии на догоспитальном и госпитальном этапах лечения представлена в таблице 6.
Полиорганная недостаточность была диагностирована у 21 человека (27,3%). У всех больных с полиорганной недостаточностью отмечали выраженную дыхательную недостаточность, требующую проведения респираторной поддержки, способ и длительность которой определяли: тяжесть состояния больного, выраженность дыхательной недостаточности, продолжительность и объем оперативного вмешательства, величина кровопотери. Недостаточность двух систем органов зафиксирована у тринадцати (61,9%), трех - у шести (28,6%), четырех - у двух пострадавших (9,5%). Структура органно-системной недостаточности представлена в таблице 7.
4. Восполнение энергетических потребностей организма. Энтерально-парентеральное питание начинали в течение 24-48 часов с момента получения травмы. Общий калораж составлял 30-40 ккал/кг/сутки и обеспечивался за счет концентрированных растворов глюкозы, растворов аминокислот [Аминосол (Hemofarm, Югославия), Аминоплазмаль (B.Braun, Германия)], а так же сбалансированных смесей для энтерального питания Nutrison, Nutrilan (Nutricia, Нидерланды). Жировые эмульсии не использовались. Для усиления антиокислительной системы организма использовалась аскорбиновая кислота - внутривенно 4 раза в сутки по 250 мг через каждые 6 часов (1 г/сутки) в течение всего пребывания больного в реаниматологическом отделении.
Лабораторно-инструментальные исследования осуществляли при поступлении пострадавших в реанимационное отделение, на 3-й, 5-е, 7-е и 15-е сутки, а так же в отдаленном периоде после перенесенной ТСТ через 1-5 лет (через 1 год - 5 человек, через 3 года — 6, через 5 лет - 2). Забор 20 мл венозной крови для определения показателей свободнорадикальных процессов и обмена холестерина проводили из катетеризированной центральной вены во время нахождения больных в реанимационном отделении или из локтевой вены при обследовании пострадавших в профильных отделениях и в отдаленном периоде после ТСТ. Для исследования свободнорадикальных процессов 2 мл цельной крови смешивали с равным объемом среды RPMI 1640, содержащей 10% диметилсульфоксида, замораживали и хранили до проведения анализа при минус 20С. Для определения значений холестерина липопротеидов, оказателей и антиокислительного статуса 18 мл крови помещали в пробирку с 0,1 мл гепарина с последующим перемешиванием и центрифугированием в течение 15 минут при скорости 2000g для получения плазмы, которую разливали по 1,5 мл в пробирки эппендорф, замораживали и хранили до проведения анализа при минус 20С.
Свободнорадикальные процессы у больных с тяжелой сочетанной травмой
В таблице 8 представлены данные о % поврежденной ДНК, % некротических и % апоптотических клеток у больных с ТСТ на этапах исследования.
Средний показатель % ДНК в «хвосте комет» клеток крови у здоровых доноров составил 6,1±2,2%.
У всех обследованных больных ТСТ аналогичный показатель при поступлении в реаниматологическое отделение составил 10,5±1,9%, что статистически значимо выше по сравнению с контролем, причем как у умерших (8,9±6,3%), так и у выживших (10,8±6,0%) больных (табл. 8). На 3-й, 5-е и 7-е сутки наблюдается увеличение данного показателя. На 5-е сутки значение поврежденности ДНК у всех обследованных (14,0±1,3%) оказалось статистически значимо выше по сравнению с первыми сутками (рис. 7). В 1-й группе показатель поврежденности ДНК при поступлении составил 8,9±6,3% (табл. 8). На 3-й сутки наблюдали резкий рост данного показателя в этой группе на 41% (15,0±8,7%). Так же достаточно высокие значения показателя поврежденности ДНК наблюдаются на 7-е и 15-е сутки в 1-й группе (14,2±12,1 и 14,5%, соответственно). В подгруппе 2Б показатель поврежденности ДНК при поступлении был 10,8+6,0%. В дальнейшем так же наблюдался рост данного показателя до 12,4±5,4% на 3-й сутки и до максимального значения на 5-е сутки (14,7±4,5%), которое статистически значимо отличается от исходных данных. Затем наблюдалось постепенное уменьшение значений данного показателя на 7-е и 15-е сутки (12,5±5,8 и 9,4±1,2%, соответственно).
Нуклеотиды ДНК подвергаются трансформации вызванной АФК, являющимися естественными продуктами метаболизма. При патологических состояниях генерация АФК значительно увеличивается и не компенсируется антиоксидантной системой защиты, в результате чего АФК вызывают большее количество повреждений ДНК. Проявляется это увеличением одно- и двунитевых разрывов ДНК, которые и образуют электрофоретический след "кометы". Увеличение этого показателя может быть связанно с гибелью клеток и/или с усилением процессов репарации в клетках, связанных с травмой. На 15-е сутки средний показатель поврежденности ДНК у всех обследованных снизился до уровня 10,3±0,9%, но оставался статистически значимо выше величины контроля (рис. 7). В дальнейших исследованиях с использованием иных методических подходов возможно удастся дифференцировать причину выявленного увеличения ДНК-повреждений (одно- и/или двунитевые разрывы, щелочно-лабильные сайты): связанно ли оно с травматическим повреждением клеток или с ДНК-репаративными процессами.
У здоровых доноров в крови некротические клетки не обнаруживается, а показатель апоптотических клеток составил 0,7±0,2% (табл. 8).
У всех обследованных больных ТСТ показатель апоптотических «ДНК-комет» на всех этапах обследования статистически значимо отличался от показателя контрольной группы. При поступлении показатель «ДНК-комет» апоптотических клеток для всех обследованных после ТСТ составил 4,7±9,2% (рис. 8а). На 3-й сутки наблюдается максимальное значение данного показателя за весь период наблюдения (6,9±7,7%), что статистически значимо выше данных при поступлении. С 5-х суток начинается постепенное поэтапное уменьшение количества апоптотических «ДНК-комет» в крови пострадавших и в конце второй недели у всех пострадавших данный показатель составил 2,3±1,1%, что в 2 раза меньше данных при поступлении (рис. 8а).
Количество «ДНК-комет» апоптотических клеток при поступлении в 1-й группе составило 3,1±0,4%, затем наблюдается рост данного показателя более чем в 2 раза на 3-й сутки (7,1±6,3%), с сохранением последующих высоких значений на 5-е сутки (7,7+8,5%) (табл. 8). Затем в 1-й группе наблюдается снижение показателя апоптотических «ДНК-комет» до 5,7±4,4% на 7-е сутки. В подгруппе 2Б при поступлении уровень «ДНК-комет» апоптотических клеток составил 4,9±9,8%. Далее на 3-й сутки также наблюдается рост данного показателя на 27% (6,7±8,4%) в этой подгруппе. После 3-х суток начинается поэтапное падение уровня апоптотических «ДНК-комет», достигнув к концу 2-й недели значения 2,4±1,1% (табл. 8).
У всех обследованных больных ТСТ показатель некротических клеток на 1-е сутки составил 4,9±5,9% (рис. 86). На 3-й сутки наблюдается увеличение данного показателя более чем на 65% от исходных данных (8,2±4,5%), с достижением максимального значения
на 5-е сутки (9,2±7,1%). После 5-х суток начинается постепенное уменьшение количества некротических клеток в крови пострадавших и уже в конце первой недели у всех пострадавших данный показатель составил 7,5±5,4%. А на 15-е сутки показатель некротических клеток (4,9±3,6%) у всех пострадавших с ТСТ был сравним с данными при поступлении (рис. 86).
![Диагностика ранних стадий острого повреждения легких при тяжелой сочетанной травме (клинико-экспериментальное исследование) [Электронный ресурс]](/i/i/4358/191790.png "Диагностика ранних стадий острого повреждения легких при тяжелой сочетанной травме (клинико-экспериментальное исследование) [Электронный ресурс] Лысенко Дмитрий Владимирович")
