Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Травма, кровопотеря, гипоксия и их значение в развитии повреждений клеток (обзор литературы)
ГЛАВА 2. Характеристика клинических наблюдений и методы исследования
2.1 Материалы исследования. 22
2.2 Методы исследований. 36
2.2.1 Исследование повреждений ДНК, апоптоза, некроза 36
2.2.2 Исследование эритроцитов 39
2.2.3 Определение концентрации каспаз в плазме крови 42
2.2.4 Исследование гематологических и биохимических показателей 42
2.2.5 Статистический анализ 43
ГЛАВА 3. Результаты исследования и их обсуждение 44
3.1 Повреждение клеток белой крови, повреждения днк потрадавших с тяжелой травмой и кровопотерей
3.1.1. Свободная внеклеточная ДНК в плазме 44
3.1.2. Некротические ДНК-кометы 44
3.1.3. Апоптотические ДНК-кометы 48
3.1.4. Одно-, двунитевые разрывы в молекуле ДНК 53
3.1.5. Двунитевые разрывы в молекулах ДНК белых клеток крови 55
3.1.6. 8-гидрокси-2-дезоксигуанозин и супероксиддисмутаза (СОД) в плазме крови 60
пострадавших
3.2 Изменение формы и размеров эритроцитов, наноструктур мембран эритроцитов у пострадавших с травмой
3.2.1. Группа контроля. Размеры и формы эритроцитов. Оптическая микроскопия и АСМ. 62
3.2.2. Группа пострадавших. Размеры и формы эритроцитов. Оптическая микроскопия и АСМ. 63
3.2.3. Наноструктура мембран эритроцитов в группе пострадавших. АСМ. 69
Заключение 78
Выводы 82
Список литературы 84
- Исследование повреждений ДНК, апоптоза, некроза
- Исследование гематологических и биохимических показателей
- Двунитевые разрывы в молекулах ДНК белых клеток крови
- Группа пострадавших. Размеры и формы эритроцитов. Оптическая микроскопия и АСМ
Введение к работе
Актуальность исследования
Согласно данным ВОЗ, черепно-мозговая (ЧМТ) и тяжелая скелетная травмы (ТСТ) причиняют вред здоровью и приводят к смерти более пяти миллионов людей в год во всем мире [Ермаков С.П., 1995]. Массивная кровопотеря, связанная с травмой, приводит к гипоксии – кислородному голоданию тканей [Рябов Г.А. 1988, Решетняк В.И. 2010; Loiacono L. A. 2010]. Повреждающий эффект гипоксии проявляется в первую очередь на уровне мембран клеток, приводя в дальнейшем к расстройству функций всех органов и систем организма, вызывая каскад патологических процессов [Мороз В.В. 2003].
Гипоксия и вызываемые ею нарушения клеточного метаболизма сопровождаются повреждением мембранных структур клеток и нарастанием процессов апоптоза и некроза. При травме или длительном воздействии патологических факторов может наступать необратимое повреждение клеток. При массивной кровопотере происходят изменения в структуре и составе красных клеток крови. Изменение структуры мембраны эритроцита влияет на выполнение им основной функции – доставка кислорода [Мороз В. В. 2012, Голубев А.М. 2012, Brckner U.B. 1990], что может приводить к усилению гипоксии. Для исследования форм и размеров красных клеток крови в настоящее время широко используются оптическая и атомно-силовая микроскопии (АСМ), [Черныш А.М. 2008; Hekele O. 2008, Kozlova E. К. 2012, Wegerhoff R. 2008]. Изучение наноповерхности мембран эритроцитов с помощью атомно-силовой микроскопии позволяет получать информацию о состоянии их наноструктуры. [Kozlova E.K. 2013, TakeuchiM. 1998]
На сегодняшний день нет четких представлений влияния гипоксии на повреждения ДНК, процессы апоптоза, некроза белых клеток крови, изменение наноструктуры мембран эритроцитов при развитии критического состояния, в частности, у пострадавших с тяжелой травмой [Мороз В. В. 2008]. Знание закономерностей развития повреждений ДНК белых клеток крови и изменения наноструктуры эритроцитов при тяжелой травме с массивной кровопотерей позволит расширить представления о влиянии гипоксии на развитие патологического процесса при критических состояниях.
Цель исследования:
Выявление механизмов развития повреждений клеток крови, обусловленных тяжелой травмой и кровопотерей, путем исследования повреждений ДНК белых клеток крови и наноструктуры мембран эритроцитов.
Задачи исследования:
1. Выявить виды повреждений ДНК и механизмы разрушения белых клеток крови у пострадавших с травмой и кровопотерей.
-
Изучить повреждения ДНК, показатели некроза и апоптоза, а также изменение содержания каспаз в плазме крови пострадавших с травмой и кровопотерей в первые две недели.
-
Выявить предикторную значимость показателей повреждения ДНК, апоптоза и некроза в развитии осложнений у пострадавших с травмой и кровопотерей.
-
Исследовать содержание 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина (суммарного показателя окислительного дистресса) и уровень супероксиддисмутазы в плазме крови пострадавших с травмой и кровопотерей.
-
Выявить динамику изменений наноструктуры мембран эритроцитов у больных с тяжелой травмой и массивной кровопотерей в первые две недели после травмы.
Научная новизна
Впервые выявлена взаимосвязь различных видов повреждений ДНК от степени выраженности гипоксии. Количество некротических ДНК-комет, значения интегрального показателя, а также суммарный показатель (одно-, двунитевые разрывы ДНК + апоптотические ДНК кометы + некротические ДНК кометы) на третьи сутки после травмы у пострадавших с выраженной гипоксией могут быть использованы в качестве прогностических признаков развития инфекционных осложнений.
Установлены различия в уровнях повреждений ДНК, апоптоза и некроза в клетках крови пострадавших с травмой и кровопотерей, обусловленные видом, объемом и тяжестью травмы.
Показана возможность использования 8-гидрокси-2-дезоксигунозина и
супероксиддисмутазы для обоснования назначения антиоксидантной терапии.
Впервые с помощью атомно-силовой микроскопии у пострадавших с травмой показано возрастание показателя высоты первого порядка (h1), характеризующего изменение состояния фосфолипидного бислоя мембран эритроцитов, что является компенсаторной реакцией эритроцита в ответ на гипоксию и сниженное содержание кислорода в плазме.
Впервые с помощью атомно-силовой микроскопии у пострадавших с различными видами тяжлой травмы выявлено около 8% дискоцитов с аномальным углублением пэллора и выростом в центре (мишеневидные клетки). Отмечена взаимосвязь их появления с pH, BE, уровнем напряжения кислорода и содержанием лактата в крови пострадавших.
Выявлены и показаны механизмы развития посттравматических изменений клеток крови.
Практическая значимость
Количество некротических ДНК-комет белых клеток крови на 3-и сутки после травмы может использоваться в качестве прогностического признака возможного развития инфекционных осложнений у пострадавших с травмой и гипоксией: ниже 9.8% может служить прогностически неблагоприятным фактором риска развития инфекционных осложнений; выше 9.8% – могут служить хорошим прогностическим признаком, позволяющим предположить, малую степень вероятности развития инфекционных осложнений, не смотря на наличие гипоксии у пострадавших сразу после травмы
Значения интегрального (одно-, двунитевые разрывы ДНК) показателя белых клеток крови на 3-и сутки после травмы может использоваться в качестве прогностического признака возможного развития инфекционных осложнений у пострадавших с травмой и гипоксией: ниже 18.6% может служить прогностически неблагоприятным фактором риска развития инфекционных осложнений; выше 18.6% – могут служить хорошим прогностическим признаком, позволяющим предположить, малую степень вероятности развития инфекционных осложнений, не смотря на наличие гипоксии у пострадавших сразу после травмы.
Значения суммарного показателя повреждений ДНК лейкоцитов (одно-, двухнитевые разрывы ДНК+апоптотические повреждения ДНК+некротических повреждений ДНК), выявляемых на третьи сутки после травмы может использоваться в качестве прогностического признака возможного развития инфекционных осложнений у пострадавших с травмой и гипоксией. Чувствительность показателя составляет 100%, специфичность 75%. Значения суммарного показателя повреждений ДНК лейкоцитов ниже 47,3 % (точка «cut-оff») свидетельствует о высоком риске развития инфекционных осложнений у пострадавших с травмой и кровопотерей.
Количество 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина может служить биомаркером
«окислительного дистресса», у пострадавших с травмой и кровопотерей и использоваться для обоснования целесообразности назначения антиоксидантной терапии этим больным
Динамика изменений параметров наноповерхности эритроцитов у пострадавших с травмой и кровопотерей может быть использована для оценки процессов восстановления красных клеток крови в посттравматическом периоде.
Основные положения, выносимые на защиту
1. При тяжелой травме наблюдаются изменения динамики повреждений ДНК, процессов
апоптоза и некроза белых клеток крови и их зависимость от объема потери крови и
гипоксии, что может использоваться для прогноза и диагностики развития
инфекционных осложнений.
-
Снижение концентрации 8-гидрокси-2-дезоксигунозина в плазме крови пострадавших с травмой, сопровождающееся и, возможно обусловленное, увеличением количества супероксиддисмутазы может использоваться для обоснования целесообразности назначения антиоксидантной терапии этим больным.
-
Установлена динамика изменения уровня каспаз 3 и 9, а также содержания sAPO-1/Fas у пострадавших с травмой и массивной кровопотерей и их взаимосвязь с развитием апоптотических механизмов альтерации белых клеток крови.
-
Атомно-силовая микроскопия может использоваться наряду с оптической микроскопией для оценки формы и размеров эритроцитов, а также для изучения наноструктуры мембран красных клеток крови у пострадавших с тяжелой травмой.
-
При тяжелой травме выявлено влияние объема потери крови и гипоксии на форму, размер и наноструктуру мембраны эритроцитов у пострадавших с тяжелой травмой и массивной кровопотерей в первые две недели после травмы, что, вероятнее всего, связано с компенсаторно-приспособительными механизмами в ответ на снижение уровня кислорода в плазме крови пострадавших. Выявленные изменения направлены на обеспечение жизнедеятельности самих эритроцитов и выполнения ими газотранспортной функции.
Апробация работы
Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт общей реаниматологии имени В.А. Неговского» Российской академии медицинских наук.
Результаты работы были представлены на Российско-испанском инновационном Бизнес-форуме, 12-14 мая, 2011, Испания, Мадрид; на IX, Х, ХII научно-практических конференциях «Безопасность больного в анестезиологии и реаниматологии», 2011, 2012, 2014, Москва, Россия; на XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», 23-27 апреля, 2012, Москва, Россия; на Научно-практической конференции «Актуальные проблемы криобиологии и криомедицины», Харьков, Украина, 18-19 октября 2012; на 10-м международном симпозиуме «Критические состояния: патогенез, диагностика, лечение» в рамках 19 конгресса Словацкого общества анестезиологии и интенсивной медицины, 12-19 мая, 2012, Москва-Вена-Пиештяны, Россия-Австрия-Словакия; на симпозиуме "Жизнеобеспечение при критических состояниях" в рамках XII Международного медицинского конгресса EURO MEDICA, июнь, 2013, 2014, Ганновер, Германия; на Европейском конгрессе «Клиническая наномедицина и целевая медицина», Clinam, ETPN Summit, 24-26 июня 2013, Базель, Швейцария; на 1-ой конференции
российского общества по изучению шока, 3 октября, 2013, Москва, Россия; на IV Съезде анестезиологов и реаниматологов Узбекистана «Современные технологии в анестезии и интенсивной терапии критических состояний», 24-25 октября, 2013, Ташкент, Узбекистан; на Научно-практической конференции молодых ученых 13 декабря 2013 «Современные методы диагностики и лечения в реаниматологии», Москва, Россия.
Структура работы
Исследование повреждений ДНК, апоптоза, некроза
Все 18 пострадавших поступали в реаниматологическое отделение в состоянии травматического шока, сопровождавшемся гемодинамическими нарушениями (АДср. 75 мм.рт.ст.), коматозным состоянием ( 8 баллов по шкале Глазго), снижением напряжения кислорода (50,35 (72,85; 43,27) мм.рт.ст) в артериализированной капиллярной крови, смещением рН крови (7,36 (7,40; 7,29)) в сторону ацидоза, нарастанием дефицита оснований (ВЕ= -3,15 (-0,47; -6,72)ммоль/л), уменьшением уровня гемоглобина (102 (124,2; 95,2) г/л), гематокрита (29 (37; 27) %), количества эритроцитов (3,49 (4,23; 3,13) х1012), повышенным содержанием глюкозы (10,70 (12,75; 8,25) ммоль/л), лактата (4,17 (6,55; 1,98) ммоль/л), сниженным содержанием 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина в плазме крови (1,2 (1,5; 1,1) нг/л).
В таблице 7 представлены лабораторные данные исследуемой группы пострадавших.
Адекватность лечения оценивали по нормализации напряжения кислорода, рН, величины буферных оснований, концентрации лактата. Таблица 7
Значения кислотно-основного состояния, гематологические и биохимические показатели (Md (q3;q1)) пострадавших в общей группе на этапах исследования.
Из рисунка 1 видно, что ВЕ у выживших больных с третьего дня наблюдения держалась выше нулевых значений, в то время как в группе умерших – отмечали выраженный дефицит оснований (- 5ммоль/л – 3-и сутки), который сохранялся ниже нулевых значений и на дальнейших этапах исследования. Представленные данные свидетельствуют о том, что сохранение значения ВЕ ниже – 4 ммоль/л в первые три дня наблюдения является неблагоприятным прогностическим признаком и требует тщательной коррекции буферной емкости крови.
В первые сутки после травмы у всех пострадавших отмечали увеличение относительно контроля уровня глюкозы (10,70 (12,75; 8,25) ммоль/л) и лактата (4,17 (6,55; 1,98) ммоль/л) в крови в 2 раза. Получены достоверные различия по концентрации лактата в крови между 1-й (2,41 (4,37; 1,80) ммоль/л) и 2-й (4,9 (10,6; 2,1) ммоль/л, р 0.05) группами пострадавших.
Повышенное содержание глюкозы в крови пострадавших в первые две недели после травмы является ответной компенсаторной реакцией организма на травму, кровопотерю и гипоксию. Глюкоза является основным и быстрым источником пополнения организма энергией, необходимой для восстановления повреждений, вызванных травмой. Кроме того, возникающий дефицит кислорода (рО2= 50,35 (72,85; 43,27) мм.рт.ст.) в организме пострадавших, обусловленный кровопотерей, приводит к гипоксии в связи с изменением соотношения аэробного и анаэробного дыхания в тканях и клетках. Последнее тесно сопряжено с окислением глюкозы до молочной кислоты (гликолиз). Лактат является конечным продуктом гликолиза и гликогенолиза при анаэробном пути окисления глюкозы и его содержание в крови является одним из показателей адекватной доставки кислорода эритроцитами к органам и тканям, что позволяет оценить «кислородное голодание» тканей. Увеличение уровня лактата в момент поступления пострадавших в реаниматологическое отделение свидетельствует об усилении анаэробного пути метаболизма глюкозы в организме в условиях гипоксии. Количество АТФ, образующегося при анаэробном пути окисления глюкозы, в 19 раз меньше, чем при е окислении до СО2 и Н2О в аэробном пути [73]. При гипоксии повышенное содержание глюкозы в крови у пострадавших с травмой направлено на компенсаторное восполнение клеток и тканей энергией АТФ, в связи с переходом на анаэробный путь гликолиза. Усиление анаэробных процессов в тканях и клетках пострадавших приводит к накоплению лактата в крови пострадавших.
Повышенное количество глюкозы в крови пострадавших необходимо и для поддержания жизнеспособности эритроцитов, оставшихся в кровотоке после кровопотери. Увеличение уровня глюкозы в крови пострадавших способствует ее активному использованию эритроцитами в глюкозо-6-фосфатном цикле с выработкой энергии АТФ необходимой для поддержания жизнеспособности эритроцита и выполнения им газотранспортной функции в условиях гипоксии.
На 3-и и 5-е сутки после травмы, у всех пострадавших отметили достоверное снижение уровня гликозы, гемоглобина, гематокрита и количества эритроцитов относительно первых суток, что обусловлено гемодилюцией, за счет проведения массивной инфузии и трансфузии препаратов.
Проведение искусственной вентиляции легких и введение буферных растворов пострадавшим, на 3-и – 5-е сутки после травмы отмечали нормализацию напряжения кислорода, коррекцию дефицита оснований, смещение рН в щелочную сторону (табл. 7). Несмотря на проводимую искусственную вентиляцию легких пострадавшим с травмой, отмечено на 7 сутки снижение (относительно 5-х суток) напряжения кислорода в крови и увеличение концентрации лактата, что обусловлено развитием нозокомиальной пневмонии. Повышенное содержание в крови пострадавших молочной кислоты на 7-й день после травмы связано с гипоксией и обусловлено присоединением инфекционных осложнений, приводящих к снижению рО2 до нижней границы нормы на фоне проведения ИВЛ.
К концу второй недели после травмы под наблюдением оставались в основном выжившие пострадавшие. Изменение на 15-е сутки напряжения кислорода (71,4 (83,2; 58,7) мм.рт.ст.) обусловлено переводом выживших больных на самостоятельное дыхание. Уровень лактата у них достигал нормальных значений – 1,93 (2,09; 1,77) ммоль/л.
В динамике лабораторные показатели у пострадавших с КП I СТ в период наблюдения стремились к нормализации, в то время как во 2-й группе больных (КП IV СТ) на 15 сутки наблюдения оставались измененными напряжение кислорода (44,75 (45,37; 44,12) мм.рт.ст) и концентрация лактата (3,21 (3,51; 2,92) ммоль/л) в плазме крови.
Лабораторно-инструментальные исследования осуществляли при поступлении пострадавших в реаниматологическое отделение, на 3-и, 5-е, 7-е и 15-е сутки. Забор 20 мл венозной крови проводили из катетеризированной центральной вены во время нахождения больных в реаниматологическом отделении или из локтевой вены при обследовании пострадавших в профильных отделениях. Забор крови в группе контроля для исследования ДНК повреждений, процессов апоптоза, некроза, а также для исследования эритроцитов под оптическим микроскопом и методом атомно-силовой микроскопии проводили однократно из локтевой вены.
Исследование гематологических и биохимических показателей
Атомный-силовой микроскоп (АСМ) (рис. 5) — сканирующий зондовый микроскоп высокого разрешения. Используется для определения рельефа поверхности с разрешением от десятков ангстрем вплоть до атомарного. АСМ создали 1982 году два швейцарских физика Герд Бинниг и Гейнрих Рорер (Нобелевская премия 1986 года). Его достоинством является возможность изучать поверхности непроводящих структур, в частности, биологических мембран и других биологических объектов. В последнее время с помощью атомного силового микроскопа физики стали интенсивно изучать биологические объекты, например молекулы ДНК и другие макромолекулы, главным образом для целей перспективного направления – биомолекулярной технологии[10, 21].
Принцип действия атомного силового микроскопа основан на использовании сил атомных связей, действующих между атомами вещества. На малых расстояниях между двумя атомами (около одного ангстрема, 1 = 10–8 см) действуют силы отталкивания, а на больших – силы притяжения (рис. 6). Сканирование осуществляется, как правило, в режиме постоянной силы, когда система обратной связи поддерживает постоянной величину изгиба кантилевера. Кантилевер (от англ. cantilever – консоль, балка) — одна из основных составных частей сканирующего зондового микроскопа представляет собой прямоугольное основание, на нижнем конце которого располагается зонд, взаимодействующий с образцом.
При исследовании образцов перепадами высот порядка единиц ангстрем применяют режим сканирования при постоянном среднем расстоянии между зондом и поверхностью образца. В этом случае кантилевер движется на некоторой средней высоте над образцом. Изгиб консоли Z, пропорциональный силе, действующей на зонд со стороны поверхности, записывается для каждой точки. Изображение в таком режиме представляет собой пространственное распределение силы взаимодействия зонда с поверхностью.
Наноповерхность мембран красных клеток крови представляет собой сложную, неоднородную, динамичнуюповерхность. Поэтому, для анализа наноповерхности мембран красных клеток крови, изображения, полученные с помощью АСМ, обрабатывали методом математического анализа – «пространственное преобразование Фурье». Этот метод позволяет выделять количественно собственные параметры наноструктуры мембраны и проводить анализ наноповерхности [75].
Для получения информативных характеристик изучаемых процессов из исходной поверхности были выделены поверхности трх порядков. Для этого использовали пространственное Фурье-преобразование исходной поверхности с тремя спектральными окнами. Спектральное окно с низкими частотами дает возможность получить изображения мембранных структур с большими пространственными периодами, а с высокими частотами -изображения мембранных структур с малыми пространственными периодами. I порядок поверхности соответствовал пространственному спектральному окну с периодом L1 в диапазоне 1000 – 600 нм.II порядок: L2 - 600 – 80 нм и III порядок L3 – 80 – 10 нм. При установлении порядков поверхностей, высоты впадин и выступов исходно не задавались - они измерялись в процессе исследования. Их диапазоны в контроле имели следующие параметры: h1 в диапазоне 5,0 – 2,0 нм, h2 – 1,9 - 0,8 нм и h3 – 0,7 – 0,2 нм. При обратном сложении профилей I, II и III порядка и всех трех изображений восстанавливается исходный профиль и исходное изображение поверхности. [148].
Пространственные периоды выбраны таким образом, чтобы их величина была близка к размерам структур мембраны эритроцитов.
Из литературных данных известно, что высота первого порядка (h1) отображает хаотичные колебательные движения мембраны эритроцитов, высота второго порядка (h2) несет информацию о состоянии спектринового матрикса, изменения высоты третьего порядка (h3) соответствуют изменениям характеристик белковых молекул и/или белковых кластеров. [75, 148].
Для каждого пострадавшего строили изображения фрагментов поверхностей мембран трех порядков, измеряли пространственные периоды Li и высоты hi для каждого порядка данной клетки. [148].
Сканирование поверхности мембраны эритроцитов методом АСМ проводили в полуконтактном резонансном режиме. В качестве зондов использовали стандартные кантилеверы NSG01-A, с углом при вершине 220, радиусом 10 нм. Сила взаимодействия между зондом и образцом при сканировании была в диапазоне 0.1-5 наноньютонов.
Полуконтактный метод включает следующие основные операции:
1. Построение резонансной кривой. Рабочая частота пьезодрайвера должна быть равна резонансной частоте кантилевера.
2. Установка параметров сканирования. Число точек сканирования – 512 и 1024, поля сканирования: 100х100 мкм, 10х10 мкм. Выбор оптимального значения скорости сканирования зависит от свойств поверхности исследуемого объекта.
3. Получение изображения начинается с построчного сканирования поверхности образца. Область сканирования может отображаться как в 2D, так и в 3D форматах.
Для анализа наноструктуры мембраны эритроцитов было исследовано по три мазка крови от каждого пострадавшего. Из каждого изображения монослоя крови было выделено по три поля размером 100х100 мкм, где было просканировано для исследования наноповерхности по три эритроцита. Для проведения Фурье-преобразования на каждом из трех эритроцитов было выделено три участка по 1500 нм, было построено по три профиля для каждого поля.
Концентрация супероксиддисмутазы, sAPO-1/Fas, каспазы-9 и каспазы-3 определялась с помощью иммуноферментного метода с использованием тест-систем фирмы Bender MedSystems (Австрия).
Всем пострадавших проводили гематологическое (гематологический анализатор – ABX Micros 60, Heriba ABX Diagnostics, Франция) исследование крови: эритроциты, гемоглобин, гематокрит, лейкоциты. Концентрацию глюкозы и лактата в плазме крови определяли электрохимическим методом на анализаторе Biosen-S-Line (EKF Diagnostics, Германия) с использованием чип-сенсоров (EKF Diagnostics, Германия). Определение биохимических показателей плазмы крови (общий белок, мочевина, креатинин, аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), производили на биохимическом анализаторе SAPPHIRE-400 (Tokyo Boeki, Япония).
Статистическую обработку проводили с помощью пакета программ Microsoft Excel и Statistica 10.0 с использованием современных принципов математического анализа медико-биологических исследований и согласно современным требованиям к обработке медицинских данных [22, 100, 129]. При сравнении данных использовали критерий Колмогорова-Смирнова. Для полученных данных, распределение которых в вариационном ряду носило нормальный характер, были использованы среднее арифметическое (M) и стандартное отклонение (), а для данных, не отвечающих нормальному распределению, определяли медиану (Мd) и междуквартильный размах (q3; q1). Для проверки статистических гипотез был использован непараметрический критерий Вилкоксона. Для построения модели прогноза вероятности развития инфекционных осложнений использовали логистическую регрессию. Статистически значимыми считали показатели при вероятности ошибки р 0,05.
Двунитевые разрывы в молекулах ДНК белых клеток крови
С помощью щелочного электрофореза были оценены одно-, двунитевые разрывы (интегральный показатель) в молекуле ДНК белых клеток крови, происходящие, как правило, с участием эндонуклеаз.
Из рисунка 10 видно, что в группе пострадавших с травмой на всех этапах исследования имеет место достоверное повышение значения интегрального показателя относительно группы контроля. Увеличение интегрального показателя в первые две недели наблюдения соизмеримо с повышением количества апоптотических ДНК-комет и появлением некротических ДНК-комет белых клеток крови в этот период (рис.10).
Повышенное значение интегрального показателя у пострадавших с травмой может отражать увеличение гидролиза ДНК по механизму одно-, двунитевых разрывов погибающих по апоптотическому и некротическому механизмам белых клеток крови.
Максимальное значение одно-, двунитевых разрывов в молекуле ДНК отмечено на 3-и сутки после травмы [18,04 (13,52; 22,20)%]. С 3-х по 15-е сутки наблюдения происходит постепенное снижение интегрального показателя практически до первоначального значения [16,02 (12,54; 18,95) % на 15-сутки].
У пострадавших в группе гипоксия «+» количество одно-, двунитевых разрывов ДНК в первый день после травмы составило 12,90 (11,53; 16,40) %, и было достоверно меньше, чем в группе гипоксии «-» [18,35 (12,78; 19,77) %, p 0,05].
В группе пострадавших гипоксия «+» и инфекция «+» показатель количества одно-, двунитевых разрывов ДНК на протяжении всего периода наблюдения остается ниже показателя значений одно-, двунитевых разрывов ДНК в группе пострадавших гипоксия «+» и инфекции «-» (рис. 10).
Выявлено значительное увеличение интегрального показателя на третий день после травмы в группе гипоксия «+» + инфекции «-» [27,3 (21,4; 32,5) %] относительно группы контроля [6,85 (7,75; 4,4) %] и гипоксия «+» + инфекция «+» [13,44 (10,28; 18,64) %].
С помощью построения ROC-кривых проведн анализ прогностической ценности развитии инфекционных осложнений при повышенном интегральном показателе на 3-й, 5-й и 7-й день после травмы в группе пострадавших гипоксия «+».
Значение площади под ROC кривой, построенной для 3-го дня наблюдения, составило 0.788 (рис.10). Эти данные свидетельствуют о том, что высокие [27,3 (21,4; 32,5)%] значения одно-, двунитевых разрывов ДНК на 3-и сутки после травмы могут служить хорошим прогностическим признаком, позволяющим предположить, малую степень вероятности развития инфекционных осложнений не смотря на наличие гипоксии у пострадавших сразу после травмы. Оптимальной величиной для оценки вероятности правильного распознавания положительных и отрицательных примеров в ROC-анализе является точка (порог) отсечения кривой (cut-offpoint), дающая в сумме максимальные величины чувствительности и специфичности. В нашем наблюдении точка отсечения составила 18,6%, при этом чувствительность составила 83,3%, а специфичность – 75,0%. Данную величину можно рекомендовать как пороговую для пострадавших на 3-и сутки с момента травмы, ниже которой риск развития инфекционных осложнений резко увеличивается. По-видимому, активная альтерация лейкоцитов по некротическому механизму сопровождающемуся одно-, двунитевыми разрывами определяет предупреждение развития гнойно-септических осложнений у этих больных. Значения интегрального показателя в первый день после травмы не зависели от исхода [выжившие – 14,69 (12,67; 19,89) %, умершие – 17,0 (11,72; 22,2)%] травмы и объема потери крови [КП I и II СТ – 17,0 (12,8; 20,3) %, КП III и IV СТ – 14,2 (12,22; 21,0) %]. Полученные данные свидетельствует о влиянии гипоксии на гидролиз ДНК белых клеток крови по механизму одно-, двунитевых разрывов.
На 3-й день после травмы у пострадавших с травмой, кровопотерей, выраженной гипоксией без инфекционных осложнений, значения показателей некротических ДНК–комет, апоптотических ДНК-комет и одно-, двунитевых разрывов ДНК были более высокие, чем те же значения показателей в группе пострадавших с травмой, кровопотерей, выраженной гипоксией, но с инфекционными осложнениями (рис. 11 а). В связи с чем значения всех трх показателей у каждого пострадавшего были суммированы для проведения ROC-анализа, с целью выявления значимости суммарного (некротические ДНК-кометы + апоптотические ДНК-кометы + одно-, двунитевые разрывы ДНК) показателя в качестве прогностического признака вероятности развития инфекционных осложнений. ROC-анализ суммарного показателя, полученного на 3-й день после травмы в группе пострадавших гипоксия «+» выявил (рис. 11 б):
1. Значение площади под ROC кривой, построенной по суммарному показателю на 3-й день после травмы, составило 0.923 (чувствительность - 100%, специфичность – 75,0%). Точка отсечения (cut-off point) составила 47,3% суммарного показателя
2. Уровень суммарного показателя выше данной точки может служить хорошим прогностическим признаком, позволяющим предположить, малую степень вероятности развития инфекционных осложнений.
3. Значения суммарного показателя ниже 47,3% свидетельствует о высоком риске развития инфекционных осложнений у пострадавших с травмой и выраженной гипоксией
Двунитевые разрывы в молекулах ДНК белых клеток крови Значения показателя двунитевых разрывов ДНК в первый день после травмы были в пределах нормы [5,44 (3,39; 8,77) %], не зависели от вида [ТСТ – 4,44 (3,35; 6,48) %, ЧМТ – 5,97 (3,70; 8,97) %, ТСТ+ЧМТ – 4,96 (3,48; 8,39) %] травмы, объема потери крови [КП I и II СТ – 5,5 (3,6; 8,9) %, КП III и IV СТ – 5,1 (3,1; 8,4) %] и развития инфекционных осложнений [инфекция «+» – 4,84 (3,24; 8,94) %, инфекции «-» – 5,50 (4,20; 7,64) %].
В динамике отмечено увеличение выше нормы показателя двунитевых разрывов ДНК белых клеток крови на 3-и [7,11 (3,50; 9,43) %], 5-е [6,5 (3,74; 10,01) %] и 15 [7,11 (5,79; 9,01) %] сутки наблюдения (рис.12).
Динамика изменения показателя двунитевых разрывов ДНК (рис.12) в группе пострадавших гипоксии «-» в первую неделю после травмы напоминает изменения показателя апоптотических ДНК комет (рис.8) в той же группе. Можно предположить, что повышенная альтерация белых клеток крови за счт апоптоза у пострадавших с травмой без гипоксии идт с гидролизом ДНК по механизму двунитевых разрывов. У пострадавших из группы гипоксия «+» при поступлении в реаниматологическое отделение показатель двунитевых разрывов ДНК был в пределах нормальных значений [4,60 (2,29; 7,90) %, p 0.05] и был достоверно ниже, чем в группе пострадавших гипоксии «-» [8,18 (3,40; 11,41)%]. На 3-и сутки уровень двунитевых разрывов ДНК увеличивается в обеих группах, но остатся выше в группе гипоксии «-» (рис. 12).
Группа пострадавших. Размеры и формы эритроцитов. Оптическая микроскопия и АСМ
Распределение эритроцитов по размерам и форме [Md (q3;q1)] в группах контроля и пострадавших (при поступлении в реаниматологическое отделение), полученное с помощью оптической (ОМ) и атомно-силовой микроскопии (АСМ) в поле 100х100 мкм ( 100 клеток)
Процентное распределение эритроцитов в группах при оптической и атомно-силовой микроскопии В таблице 9 представлено распределение эритроцитов по размерам в группе контроля, полученное с помощью оптической микроскопии и АСМ в поле 100х100 мкм ( 100 клеток). Количество различных по размерам эритроцитов достоверно не отличалось при подсчете методом оптической и атомно-силовой микроскопии.
В группе контроля при оптической микроскопии и АСМ в поле 100х100 мкм выявили следующие формы эритроцитов: дискоциты, эхиноциты, плоские клетки, стоматоциты (табл. 10).
Высокая разрешающая способность метода АСМ позволила выявить на порядок большее количество плоских клеток у здоровых добровольцев, чем при оптической микроскопии.
Исследование мазков крови пострадавших с травмой методом АСМ и оптической микроскопии в поле 100х100 мкм при поступлении в реаниматологическое отделение показало, что количество эритроцитов на 42,6±11,8% меньше, чем в группе контроля.
В первые сутки после травмы и кровопотери в группе пострадавших отмечено недостоверное снижение количества нормоцитов, увеличение количества макроцитов и количества микроцитов по отношению к контролю (табл. 11).
Увеличение количества макроцитов сразу после травмы отражает выход молодых форм эритроцитов из красного костного мозга и кровяных депо в ответ на кровопотерю, а повышение количества микроцитов является следствием снижения рН, нарастания дефицита оснований и увеличения уровня лактата в крови. Отмечена различная выраженность анизоцитоза у пострадавших 1-й и 2-й групп наблюдения при поступлении в реаниматологическое отделение, выявленная методом АСМ: количество нормоцитов при КП I СТ тяжести составило 58.0 (43.5; 62.5) %, а при КП IV СТ – 39 (30; 54) %; количество макроцитов при КП I СТ составило 22.0 (20.5; 45.5) %, а при КП IV СТ – 27.0 (23.0; 37.5) %; количество микроцитов при КП I СТ составило 11.0 (6.5; 17.0) %, а при КП IV СТ – 29 (19; 32) % (табл. 11). При атомно-силовой микроскопии в поле 100х100 мкм мазков крови пострадавших с травмой в день поступления в реаниматологическое отделение выявили достоверные отличия относительно контроля в количестве различных по форме эритроцитов: дискоцитов, эхиноцитов, стоматоцитов, плоских клеток (рис. 14).
Количество дискоцитов в группе пострадавших с травмой на 5-е сутки уменьшалось при одновременном увеличении количества плоских клеток. С 5 по 15 сутки отмечается постепенное увеличение количества дискоцитов при одновременном уменьшении количества плоских клеток.
На рисунке 15 представлены графики, отражающие динамику изменения содержания плоских клеток и макроцитов (считающихся разновидностью молодых форм эритроцитов) в первые 7 дней после травмы.
Характер кривых на этих графиках имеет одинаковую направленность. Размеры плоских клеток (8.5-9.5 мкм) и увеличение их количества в период компенсаторного активирования эритропоэза в ответ на кровопотерю (5-е сутки) в результате травмы [29] позволяют с большой долей вероятности отнести их к разновидности молодых форм эритроцитов.
Увеличение количества плоских клеток (рис. 16а) при кровопотере I степени тяжести начинается с 3-х суток и достигает максимума к 5 суткам наблюдения, отражая, по всей видимости, усиление процессов эритропоэза. На 7-е и 15-е сутки количество плоских клеток линейно уменьшалось, при одновременном увеличении количества дискоцитов, что, по-видимому, отражает переход молодых форм эритроцитов в дискоциты.
При КП IV СТ имело место линейное увеличение количества плоских клеток при одновременном снижении количества дискоцитов в период с 5 по 15 сутки наблюдения (рис. 16б). Полученные данные, косвенным образом свидетельствуют о позднем и более длительном, по отношению к 1-й группе пострадавших, возрастании процессов эритропоэза в ответ на массивную (по сравнению с первой группой) кровопотерю. На рисунке 16 представлены кривые, отражающие количество плоских клеток и дискоцитов в период наблюдения при КП I СТ (рис 16а) и КП IV СТ (рис. 16б). В динамике число плоских клеток и дискоцитов различалось у пострадавших с кровопотерей I степени тяжести (в основном пострадавшие с ЧМТ) и КП IV СТ (в основном пострадавшие с ТСТ).
Как видно из таблицы 12 при поступлении пострадавших в отделение реаниматологии значения Red cell Distribution Width (RDW, распределение эритроцитов по объему) находится в пределах верхней границы нормы. Несмотря на гемодилюцию на протяжении двух недель после травмы отмечается рост данного показателя, свидетельствующий об увеличении разнообразных по объему эритроцитов[142]. Возможно, это связано с выбросом из костного мозга и депо крови молодых форм эритроцитов в ответ на кровопотерю, в первые дни после травмы и активацией процессов эритропоэза на более поздних этапах наблюдения. Отмечено повышение значений RDW выше нормы у пострадавших с ЧМТ.
В группе умерших больных отмечается увеличение данного показателя выше нормы на 5, 7 и 15-е сутки, что косвенным образом может свидетельствовать о сохранении активного процесса эритропоэза у пострадавших данной группы до летального исхода.
При этом в группе умерших пострадавших с КП I СТ (преимущественно больные с ЧМТ) эритропоэз активизируется раньше - на 3-й день наблюдения, а с КП IV СТ - позже, на 7-й. В группе пострадавших в первые сутки после травмы в поле 100х100 мкм методом АСМ было выявлено около 8% эритроцитов с углубленным пэллором и выростом в центре (мишеневидные клетки, target cells) (рис.17).
