Введение к работе
Актуальность проблемы
Канцерогенез – длительный многоступенчатый процесс накопления в клетке дефектов генов, ответственных за деление, репарацию ДНК, апоптоз и ряда других функционально значимых генов. Некоторые из этих генетических дефектов можно рассматривать в прикладном аспекте, - не как факторы патогенеза, а как опухолевые маркеры, и использовать их в диагностических целях. Значимость дефекта как маркера определяется не его функциональными последствиями, а такими факторами, как степень ассоциации с онкологической патологией (насколько часто встречается при разных опухолях), простота и надежность выявления. Детекция ДНК-маркеров может служить разным целям: как собственно диагностики, так и мониторинга роста опухоли (т.е., оценки эффективности лечения, своевременного обнаружения рецидива или метастаза), а также, в перспективе, скрининга (выявления процесса на доклинической его стадии, формирования групп риска).
Апоптоз (или программируемая клеточная гибель) – фундаментальный феномен, суть которого заключается в клеточном «самоубийстве», индуцированном либо различными внешними стимулами, либо неразрешимыми внутренними конфликтами (например, невозможностью репарации поврежденной ДНК). В организме взрослого человека ежесуточно погибает около 1011 клеток, количество высвобождаемой во внеклеточную среду ДНК может достигать 1 г. В случае возникновения в организме опухоли некоторая часть опухолевых клеток также погибает по механизму апоптоза или некроза.
Ключевой момент клеточной гибели, знаменующий необратимость процесса, - деградация ДНК до низкомолекулярных фрагментов. Большая их часть реутилизируется в организме, меньшая - попадает в кровеносное русло (циркулирующие ДНК). Выявление в их составе специфических мутантных аллелей свидетельствует об онкологическом процессе.
Возникает вопрос относительно дальнейшей судьбы внеклеточной ДНК в кровеносном русле. По всей видимости, она подвергается дальнейшей деградации и экскретируется с мочой. В этом случае особое значение имеют размеры экскретируемых продуктов (основания, моно- или олигонуклеотиды, полинуклеотиды). Имеется в виду возможность использования мочи в качестве источника ДНК, происходящей из внутренней среды организма. Благодаря неинвазивности и легкодоступности такая «трансренальная» (т.е., преодолевшая почечный барьер) ДНК могла бы оказаться предпочтительной альтернативой циркулирующей ДНК плазмы при выявлении генетических опухолевых маркеров.
Цели и задачи исследования
Цель работы - исследование возможности использования трансренальной ДНК как нового неинвазивного способа генодиагностики рака.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
-
На модели экспериментальных животных исследовать:
а) метаболическую судьбу ДНК гибнущих клеток;
б) возможность использования трансренальной ДНК для ПЦР-анализа.
-
На модели женщин-«химер» (женщин, вынашивающих плод мужского пола, и женщин-реципиентов мужской донорской крови) оценить:
а) проницаемость почечного барьера человека для циркулирующих полимерных фрагментов ДНК;
б) пригодность трансренальной ДНК человека для ПЦР.
-
У онкологических больных определить возможность выявления в трансренальной ДНК опухолевых генетических маркеров.
-
В методических исследованиях:
а) исследовать различные возможности повышения чувствительности ДНК-диагностики;
б) разработать метод гибридизации-элонгации полинуклеотидов для вовлечения в ПЦР сверхмалых фрагментов циркулирующей ДНК;
в) оптимизировать метод плавления ДНК для сканирования мутаций в коротких ампликонах.
Научная новизна и практическая значимость работы
В настоящей работе впервые обнаружена проницаемость почечного барьера экспериментальных животных и человека для фрагментированной ДНК гибнущих клеток. Показано, что эта ДНК, названная нами трансренальной, т.е. преодолевшей почечный барьер, способна служить матрицей в ПЦР. При исследовании мочи больных с опухолями поджелудочной железы и толстого кишечника обнаружены мутантные последовательности онкогена K-RAS. Впервые показана принципиальная возможность использования трансренальной ДНК для диагностики злокачественных новообразований.
Разработан неинвазивный метод генодиагностики рака посредством анализа трансренальной ДНК. Его премущества по сравнению с анализом ДНК плазмы: неинвазивный характер, возможность получения больших количеств биопробы, отсутствие сильных ингибиторов ПЦР.
Разработан оригинальный метод гибридизации-элонгации фрагментированных ДНК, составляющих основную массу циркулирующей ДНК. По данным ПЦР в реальном времени, этот метод существенно повышает чувствительность генодиагностического анализа.
Оптимизирован «открытый формат» плавления ДНК. Этот метод позволяет, во-первых, применять для мутационного сканирования стандартные амплификаторы для ПЦР-РВ вместо дорогостоящего высокотехнологичного оборудования, используемого для анализа плавления ДНК с высоким разрешением, и, во-вторых, повысить чувствительность детекции мутанций гена K-RAS, часто обнаруживаемого в опухолевой ткани. Выявление мутаций этого онкогена имеет большое значение, поскольку определяет прогноз заболевания и стратегию лечения больных колоректальным раком и немелкоклеточным раком легких. Чувствительность разработанного метода превышает таковую секвенирования по Сэнгеру, его применение должно способствовать снижению числа ложноотрицательных результатов тестирования мутантного гена K-RAS и повышению эффективности таргетной терапии.
Апробация работы
Диссертационная работа была апробирована 26 декабря 2011 года на совместной научной конференции лабораторий биохимии опухолей, онкогеномики, молекулярной биологии вирусов, вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН.
По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 12 статей опубликованы в журналах, рекоменованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата биологических наук.
Структура и объем работы
