Содержание к диссертации
Введение
Часть I. Обзор литературы 7
Глава 1. Липосомы: строение, свойства и области их применения 7
Глава 2. Липосомы как средство доставки биологически активных молекул к клеткам-мишеням 11
Глава 3. Лиганды для направленного транспорта липосом 22
Глава 4. Модификация поверхности липосом 29
Часть II. Собственные исследования 43
Глава 1. Материалы и методы исследования 43
Глава 2. Получение лиганд-полиэтиленгликоль-липидного коньюгата 58
Глава 3. Получение 1СО80-иммунолипосом, нагруженных доксорубицином 76
Глава 4. Проверка специфической активности 1СО80-иммунолипосом, нагруженных доксорубицином, в системе in vitro 82
Выводы 91
Список литературы 93
- Липосомы: строение, свойства и области их применения
- Липосомы как средство доставки биологически активных молекул к клеткам-мишеням
- Материалы и методы исследования
- Получение лиганд-полиэтиленгликоль-липидного коньюгата
Введение к работе
Актуальность проблемы
Известно, что лекарственные препараты, применяемые в традиционных
формах, лишь ограниченно и медленно проникают в клетки через барьер биологических мембран, а после попадания в организм нередко разрушаются за счет действия различных защитных систем, что уменьшает желаемый терапевтический эффект. Эти проблемы в ряде случаев затрудняют применение или же делают невозможным медицинское применение многих весьма эффективных препаратов.
Основной задачей экспериментальной и клинической химиотерапии является доставка лекарственного препарата как можно ближе к опухолевой клетке. Оптимальным вариантом является доставка лекарства внутрь клетки опухоли. Еще в конце XIX века немецкий бактериолог Пауль Эрлих предложил термин "волшебная пуля", подразумевающий химиопрепарат, который находит в организме и избирательно убивает клетки-мишени без повреждения окружающих здоровых тканей. С тех пор селективный транспорт химиотерапевтических препаратов к опухоли in situ остается предметом многочисленных исследований. Одним из способов достижения этой цели является разработка липосомальной лекарственной формы противоопухолевых препаратов.
Использование липосом для транспорта и целенаправленной доставки противоопухолевых препаратов - цитостатиков является одним из перспективных направлений в медицине. Применение цитостатиков для лечения онкологических больных часто сопровождается токсическими осложнениями, обусловленными поражением быстро обновляющихся, с высоким темпом пролиферации клеток кроветворных и иммунокомпетентпых органов (в первую очередь костного мозга, эпителия желудочно-кишечного тракта, сердечной мышцы, почек и др.). Кроме того, малое непосредственное влияние на опухолевый рост также ограничивает использование цитостатиков в свободном виде. Данные, накопленные
специалистами за последние годы подтверждают способность липосом транспортировать лекарственное средство, снижать его токсическое действие, увеличивать терапевтический эффект [5;7].
Для обеспечения направленного транспорта липосом к клеткам-мишеням было предложено модифицировать поверхность липосом различными лигандами, способными специфически связываться с антигенами или рецепторами на поверхности клетки. Выбор лиганда зависит от антигена/рецептора, экспрессированного на поверхности клетки, куда необходимо доставить липосомы. В качестве векторных молекул могут выступать, например, моноклональные антитела (МКА) или их фрагменты (Fab'-фрагменты МКА), пептиды, факторы роста, углеводы, гликопротеины, лиганды к специфическим рецепторам на поверхности клеток-мишеней и др. Липосомы, к поверхности которых присоединены МКА или Fab'-фрагменты МКА, назвали иммунолипосомами [19].
На протяжении последних 20 лет не ослабевал интерес ученых к липосомальным системам доставки лекарственных препаратов, что позволило добиться значительных успехов в этой области науки. На сегодняшний день известен целый ряд «адресных» липосомальных систем доставки, способных специфически связываться с антигеном/рецептором на поверхности клетки-мишени. Так, например, были получены иммунолипосомы, избирательно действующие, на клетки головного мозга [60], легкого [67], молочной железы [63], ВИЧ-инфицированные клетки [54;83;84], клетки иммунной системы [46], а также на другие клетки-мишени. Однако, ни один лекарственный препарат на основе иммунолипосом или других «адресных» липосом не разрешен еще для клинических испытаний.
Разработка нового поколения лекарственных препаратов на основе иммунолипосом является стратегически важным, поскольку это позволит решить многие задачи, связанные с направленной доставкой лекарственных веществ. Хотя иммунолипосомы - это сложная биохимическая система, создание и разработка которой требует участия специалистов из многих
областей науки, есть надежда, что иммунолипосомы займут достойное место среди лекарственных препаратов.
Цель исследования
Целью исследования являлось создание конструкции иммунолипосомы
и изучение иммунолипосомальной формы противоопухолевого препарата доксорубицин.
Задачи исследования
1. Разработать методику получения активированного ПЭГ-липидного
коньюгата.
Подобрать условия присоединения лигандов (циклический RGD-содержащий пептид, моноклональное антитело ICO80) к активированному ПЭГ-липидному коньюгату.
Получить 1СО80-иммунолипосомы и проверить их специфическую активность в системе in vitro.
Получить иммунолипосомальную форму доксорубицина, а также проверить иммунологическую специфичность и цитотоксическую активность полученной иммунолипосомальной формы доксорубицина в системе in vitro.
Научная новизна исследования
Разработана методика получения активированного полиэтиленгликоль-
липидного коньюгата. Подобраны условия присоединения лигандов (циклический RGD-содержащий пептид, моноклональное антитело ICO80) к активированному ПЭГ-липидному коньюгату. Отработана методика получения 1СО80-иммунолипосом и проверена их специфическая активность в системе in vitro. Отработана методика получения иммунолипосомальной формы доксорубицина. Проведено тестирование иммунологической
специфичности и цитотоксической активности полученной иммунолипосомальной формы доксорубицина в системе in vitro.
Практическая значимость исследования
Разработанная технология получения «адресных» липосом на основе п-
нитрофенилкарбонил-ПЭГ-липидного коньюгата является универсальной для любых лигандов, содержащих аминогруппу. Получение «адресных» липосом путем встраивания лиганд-ПЭГ-липидного коньюгата в липосомальный бислой дает возможность встраивать множество различных лиганд-ПЭГ-липидных коньюгатов в предварительно приготовленные липосомы, содержащие различные лекарственные препараты. Этот метод не требует разработки отдельной технологии производства направленных липосом для каждого из множества лигандов в сочетании с лекарственным препаратом.
Липосомы: строение, свойства и области их применения
Липосомы представляют собой закрытые сферические пузырьки, образованные из липидов, которые состоят из гидрофильной головки и гидрофобного хвоста [4]. В ходе образования липосом гидрофильные вещества попадают во внутреннее водное пространство пузырьков, а гидрофобные вещества встраиваются в липидный бислой. Термин «липосомы» относится к любым липидным бислойным структурам, имеющим водное содержимое. Липосомы впервые были описаны около 30 лет назад и названы «фосфолипидными сферулами».
Первоначально липосомы использовались как модельные системы биологических мембран для научных исследований. Фосфолипиды и другие амфифильные молекулы способны самостоятельно формировать бислойные липидные мембраны (БЛМ), отделяющие внутреннее пространство липосомы от внешней среды [6]. БЛМ по многим параметрам сходны с клеточными мембранами, что даёт возможность использовать их в качестве моделей для изучения структуры и функций последних, а также внутримембранного белок-липидного взаимодействия. На сегодняшний день липосомы широко используются как транспортное средство для доставки множества биологически активных молекул, таких как ДНК, олигонуклеотиды, белки, пептиды и различные лекарственные препараты (антибиотики, цитостатики и др.) [2;22].
До недавнего времени внутривенно вводили только истинные растворы. Присутствие частиц эмульсии или суспензий может привести к закупорке капилляров - эмболии. Однако можно теоретически рассчитать, какими размерами должны обладать частицы дисперсий, чтобы избежать эмболии. Диаметр эритроцитов, которые свободно проходят через любые сосуды, - 7 мкм. С учетом их деформируемости, с запасом считается, что безопасными могут быть дисперсии с размером частиц менее 1 мкм, то есть нанодиапазона [7]. Кроме того, частицы должны быть настолько маленькими, чтобы свободно проходить через фильтрационные барьеры в селезенке и печени. Таким образом, размер наночастиц для доставки биологически активных молекул к клеткам-мишеням не должен превышать 150 - 200 нм.
Какие свойства липосом делают их привлекательными для доставки биологически активных молекул? ? Способность включать гидрофильные молекулы во внутреннее водное пространство, а гидрофобные молекулы - в липидный бислой. ? Защита биологически активных молекул, встроенных в липосомы, от захвата клетками ретикуло-эндотелиальнои системы и от метаболической деградации. ? Возможность доставки гидрофобных и гидрофильных соединений к различным органам и тканям организма, и, более того, способность доставлять эти соединения в цитоплазму клетки-мишени. ? Возможность изменить размер, заряд и модифицировать поверхность липосом различными лигандами путем добавления соответствующих компонентов к липидной смеси до приготовления липосом или после.
Так, включение в состав «классических» липосом полиэтиленгликоль-липидного коньюгата способствует увеличению времени циркуляции липосом в кровотоке, делая их невидимыми для клеток ретикуло-эндотелиальнои системы (Рис. 2). Включение в состав липосом катионных липидов позволяет использовать такие положительно заряженные липосомы для доставки генетического материала. Присоединение к поверхности липосом различных специфических лигандов дает возможность использовать их для направленного транспорта [47; 137].
Липосомальные системы доставки широко применяются в противоопухолевой терапии, т.к. способствуют повышению терапевтического эффекта и снижению токсичности лекарственного препарата по сравнению с его свободной формой. В настоящее время ряд липосомальных препаратов успешно применяется в клинике (табл.1) [145]. Первоначальный успех, достигнутый в работе с липосомальными формами многих лекарственных препаратов, послужил толчком для дальнейших клинических исследований. Так, например, результатом применения противоопухолевого препарата доксорубицина, включенного в пэгилированные липосомы, для лечения больных метастатическим раком молочной железы стало увеличение продолжительности жизни [64;90;109]. Положительные результаты были получены при комбинированной терапии, состоящей из доксила и цисплатина [89], мицета и паклитаксела [131] или келикса и карбоплатина [58]. Клинические исследования показали впечатляющий результат при терапии кожной Т-клеточной лимфомы [152] и саркомы [135] доксорубицином в пэгилированных липосомах в сравнении со свободным препаратом.
Липосомы как средство доставки биологически активных молекул к клеткам-мишеням
Первое поколение липосом, так называемые «классические липосомы», имело один существенный недостаток: быстрый захват и удаление из кровотока липосомальных препаратов клетками ретикуло-эндотелиальной системы, что затрудняло доставку препаратов к опухоли. Для увеличения времени циркуляции липосом в кровотоке было предложено покрыть поверхность липосом инертными биосовместимыми полимерами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ), которые формируют защитный слой и препятствуют распознаванию белками плазмы крови (опсонинами) и, следовательно, дальнейшему клиренсу [26;77;111].
Включение противоопухолевых препаратов в пространственно стабилизированные липосомы увеличивает их накопление в тканях с повышенной проницаемостью сосудов (Рис. 3) [5;50;53]. Наличие прерывистого эндотелия и другие капиллярные аномалии, найденные в сосудистой сети опухоли во время неоангиогенеза, способствуют проникновению и накоплению липосом во внутритканевом пространстве солидных опухолей, где они действуют как система, непрерывно высвобождающая лекарственный препарат [29; 154]. Это явление получило название «эффект повышенной проницаемости сосудов» (EPR effect) [91; 107]. В последнее время пространственно стабилизированные липосомы подробно изучаются и широко используются в биомедицинских исследованиях in vitro и in vivo; также они нашли применение в клинической практике [58;64;89;90;109;131;135;152].
Важным свойством защитных полимеров является их гибкость, которая позволяет относительно небольшому количеству присоединенных молекул создавать непроницаемый слой на липосомальной поверхности. Несмотря на
то, что ПЭГ по-прежнему остается лидером среди защитных полимеров, продолжаются попытки найти другие соединения, которые могли бы быть использованы для получения пространственно стабилизированных липосом. Было описано приготовление пространственно стабилизированных липосом с применением поли[1Ч-(2-гидроксипропил)метакриламида] [151], поли-N-винилпирролидонов [148], биорасщепляемых полимер-липидных коньюгатов [105] и поливинилового спирта [142].
Роль липосом в противоопухолевой терапии не ограничивается доставкой лекарственных препаратов. Известно, что липосомы также могут быть использованы в боро-захватывающей терапии (boron neutron capture therapy (BNCT)) для селективной доставки терапевтических количеств атомов 10В в опухолевые клетки [83].
В последнее десятилетие отмечается повышенный интерес к использованию фталоцианинов в качестве фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии (ФДТ) злокачественных новообразований. Фотосенсибилизаторы обладают большим терапевтическим потенциалом, но их действие сопряжено с отрицательными побочными эффектами, которые обусловлены недостаточной избирательностью действия [10]. Одним из путей решения этой проблемы является создание липосомальной формы фотосенсибилизаторов. Так в лаборатории Оборотовой Н.А. была разработана липосомальная лекарственная форма Фотосенса. Фотосенс, отечественный фотосенсибилизатор II поколения, представляет собой смесь натриевых солей сульфированного фталоцианина алюминия. Использование Фотосенса при проведении ФДТ позволило снизить терапевтическую дозу препарата в 4 раза и уменьшить степень его накопления в коже [9; 11; 13].
Несмотря на достигнутые результаты в использовании ненаправленных липосомальных систем доставки лекарственных препаратов, были проведены исследования с целью повышения эффективности и селективности действия липосомальных противоопухолевых препаратов посредством лиганд-опосредованного транспорта липосом. Это достигается присоединением направляющих векторных молекул к поверхности липосом. Лиганды способствуют селективному связыванию с опухоль ассоциированными антигенами или рецепторами и доставке лекарственных препаратов непосредственно к месту их назначения. В качестве векторных молекул могут выступать, например, моноклональные антитела (МКА) или их фрагменты (Fab -фрагменты МКА), пептиды, лиганды к специфическим рецепторам на поверхности клеток-мишеней и др [81;85;86;101;108;110;133;139]. Тип А Тип В Тип С
Первые эксперименты были сделаны посредством простой иммобилизации антитела на поверхности «классической» липосомы - тип А [36; 102; 141] (Рис. 4), но такие липосомы быстро захватывались клетками РЭС и выводились из кровотока. «Классические липосомы», к поверхности которых были присоединены одновременно молекулы антител и ПЭГ - Тип В [28;63], обладали способностью циркулировать в русле крови в течение более длительного времени. Однако выяснилось, что защитный полимер может создавать пространственные препятствия для специфического связывания антител с клеткой-мишенью [146].
Материалы и методы исследования
Для предотвращения экранирования молекул антител цепями полимера (mPEGiooo), расположенного на поверхности липосомы и защищающего ее от действия клеток РЭС, было предложено использовать полимерный линкер между липидом и молекулой лиганда PEG3000-3400, превышающий по своей длине полимерные нити mPEG2ooo [65;76]. Опубликованная ранее схема с использованием п-нитрофенилового эфира полиэтиленгликоль-липидного коньюгата для получения иммунолипосом позволяет присоединять лиганд к пэгилированному липиду в одну стадию, т.е. не требует предварительной модификации, а также не подразумевает использование токсичных реагентов. При рН среды, близком к нейтральному, скорость гидролиза pNP-PEG-Lipid сопоставима со скоростью аминолиза (присоединения лиганда к PEG-Lipid) [76;82]. При щелочных значениях рН реакция протекает преимущественно с образованием лиганд-ПЭГ-липидного коньюгата. Однако не все антитела сохраняют свою специфическую активность при щелочных значениях рН среды. Химическая модификация антител также может привести к снижению их специфической активности, что будет отрицательно сказываться на способности иммунолипосом осуществлять направленную доставку лекарственных препаратов к клеткам.
Традиционный химический синтез липидов и их производных часто представляет собой трудоемкую задачу, связанную с несколькими стадиями синтеза и очисткой промежуточных соединений. Твердофазный метод синтеза пептидов, предложенный Меррифилдом еще в 1963 году [104], в настоящее время находит свое применение при синтезе других классов органических соединений. Так группой Сурового А.Ю. был предложен твердофазный метод для полного химического синтеза катионных липидов с целью системного изучения структурно-функциональных связей [16]. При этом варьировались многие параметры, включая гидрофильную, спейсерную, якорную и гидрофобные группировки. В других работах группы Сурового А.Ю. было показано, что катионные липосомы, приготовленные на основе лизина в качестве гидрофильной группировки, способны эффективно трансфецировать клетки in vitro [141].
Был разработан простой оригинальный метод получения полиэтиленгликоль-липидного коньюгата твердофазным методом на основе орнитина в качестве гидрофильной группировки. Синтез осуществляли в ручном варианте путём наращивания цепи с С-конца на Tenta Gel PAP смоле (RAPP Polymere). Преимуществом данного метода является простота выделения и очистки получаемого продукта. Наличие полиэтиленгликоля, присоединенного к смоле, делает синтез гидроксиполиэтиленгликоль-JV [дистеароил-орнитин] (HO-PEG-Orn-St2) простым двух стадийным процессом. Первая стадия заключается в последовательном присоединении к смоле орнитина и стеариновой кислоты, а вторая - в снятии готового продукта со смолы. Присоединение diFmoc-орнитина к концевой аминогруппе полиэтиленгликоля проводили при помощи диизопропилкарбодиимида. Карбоксильную группу активировали гидроксибензотриазолом и вводили в реакцию с избытком диизопропилэтиламина. Далее присоединение стеариновой кислоты по Net- и NE- аминогруппам орнитина проводили аналогичным образом при помощи диизопропилкарбодиимида. Полиэтиленгликоль-липидную производную удаляли со смолы обработкой смесью трифторуксусной кислоты и триметилбромсилана. Полученный продукт HO-PEG-Orn-St2 характеризовали методом масс-спектрометрии (Рис. 20). Ожидаемая молекулярная масса составила 3679 Да. Молекулярный йон, соответсвующий искомому соединению, являлся доминирующим при масс-спектрометрическом анализе. Отклонения по молекулярной массе объясняются неоднородностью полиэтиленгликоля.
Активированный РЕвзооо-липидный коньюгат (в данном случае - п-нитрофениловый эфир ПЭГ-липида) получали обработкой исходного НО-PEG-Orn-St2 10-ти кратным избытком п-нитрофенилхлорформиата (Рис. 21). Реакцию вели в присутствии эквивалентного количества триэтиламина. Контроль за ходом реакции осуществляли с помощью ТСХ на пластинках с силикагелем (Silica gel 60 F2545 Merck, Germany) до исчезновения исходного реагента в смеси (HO-PEG-Orn-St2) (Рис. 22), для проявления пластин использовали водный раствор бромфенолового синего и раствор аммиака, который позволяет детектировать pNP-группу. Как видно из приведенных хроматограмм, в условиях реакции и в хроматографической системе п-нитрофенилхлорформиат частично гидролизуется с образованием неактивного п-нитрофенола. Тем не менее, использование большого избытка п-нитрофенилхлорформиата позволяет проводить реакцию до конца.
Продукт реакции выделяли из реакционной смеси путем высаживания охлаждённым диэтиловым эфиром (из расчёта 10-12-кратного избытка эфира по объёму) с последующей промывкой эфиром для удаления п-нитрофенилхлорформиата. Полученный продукт pNP-PEG-Orn-St2 характеризовали методом ТСХ (Рис. 23) и масс-спектрометрии (Рис. 24). Отклонения по молекулярной массе объясняются неоднородностью полиэтиленгликоля.
Ожидаемая молекулярная масса составила 3844 Да. Молекулярный йон, соответсвующий искомому соединению, являлся доминирующим при масс-спектрометрическом анализе. Отклонения по молекулярной массе объясняются неоднородностью полиэтиленгликоля. На рисунке 25 показан результат наложения масс-спектров HO-PEG-Orn-St2 и pNP-PEG-Orn-St2. Сдвиг молекулярного иона по массе свидетельствует о присоединении п-нитрофенильной группы к PEG-Orn-St2.
Получение лиганд-полиэтиленгликоль-липидного коньюгата
Липосомы используются как лекарственная форма при лечении онкологических, инфекционных и др. заболеваний [7], в диагностике для визуализации очагов поражения, сосудистых систем [144] и т.п. В этих случаях очень важно достичь максимальной эффективности загрузки липосом лекарственными или диагностическими субстанциями. Как правило, для введения в организм используют липосомы размером 100 нм для уменьшения захвата липосом клетками ретикулоэндотелиальной системы, для увеличения эффекта "пассивного нацеливания". Степень включения полярных веществ в такие липосомы невелика ( 20%). Как следствие, низкой оказывается и удельная загрузка липосом, т.е. соотношение внутрилипосомные субстации/липиды. Чтобы увеличить удельную загрузку, липосомы получают в более концентрированных растворах субстанции или загружают вещество в липосомы с помощью ионных градиентов (активная загрузка). Увеличение концентрации ограничено растворимостью вещества; кроме того, эффективность включения вещества при этом не изменяется, что приводит к повышению себестоимости препарата. Таким образом, предпочтительнее использовать методики активной загрузки. Часто для активной загрузки липосом слабыми основаниями используют трансмембранный протонный градиент [100], но, как правило, градиент рН нестабилен во времени, что приводит к высвобождению содержимого везикул в течение нескольких часов и даже минут. Кроме того, градиент рН не может быть использован для концентрирования веществ, нестабильных в кислотных или щелочных средах, а также для загрузки цвиттерионов [14].
Активную загрузку слабых амфифильных оснований в липосомы можно осуществить с помощью ионных градиентов неорганических солей аммония. Градиент концентраций соли между внутренним и внешним объемами липосомной дисперсии образуется при удалении соли из внешней среды. Ионный градиент, создаваемый сульфатом аммония, стабилен во времени, не требует изменения рН внешней среды, а также подходит для липосом различного состава и независимо от метода их получения. Действующая сила градиента (NH SC обусловлена значительной разницей в коэффициентах проницаемости через липидный бислой (Р) для различных соединений и ионов: P(NH4)2SO4 042 PNH4+ С РН+ « Рынз- Очень высокий коэффициент проницаемости для молекулы аммиака (Р 0.13 см/с) приводит к быстрой диффузии нейтральных молекул NH3, образующихся при диссоциации катионов аммония во внутреннем пространстве липосом. Диффузия аммиака из липосом по градиенту концентраций (в начальный момент концентрация NH3 вне липосом пренебрежимо мала) приводит к понижению рН во внутреннем объеме липосом. В свою очередь, загружаемое основание в нейтральной форме способна проникать через бислой, однако, приобретая положительный заряд в кислой среде внутреннего объема липосом, оно почти полностью теряет эту способность, т. к. коэффициент проницаемости для заряженной молекулы значительно меньше, чем для незаряженной. Кратко этот процесс можно описать как обмен через мембрану аммиака и загружаемого основания (антипорт). В зависимости от концентрации липидов и активного вещества, а также Кр загружаемого основания эффективность загрузки меняется от 40 до 99% [14;37;51].
Для загрузки слабых кислот можно использовать градиент ацетата кальция; в этом случае движущей силой активной загрузки является антипорт уксусной кислоты и загружаемой слабой кислоты.
Включение доксорубицина в липосомы осуществляли с помощью ионного градиента сульфата аммония. Для этого липидную пленку суспендировали в буферном растворе, содержащем 250 мМ сульфата аммония (NH SO рН 5.5. с последующим пропусканием липосомальной через поликарбонатные мембраны с диаметром пор 200 и 100 нм (Nuclepore) посредством мини-экструдера (Avanti Polar Lipids) [77]. Полученные липосомы диализовали против раствора, содержащего 150 мМ NaCl. Общая концентрация липидов составляла 22.82 мг/мл, размер полученных частиц был 115±5 нм. К липосомальной дисперсии добавляли раствора доксорубицина в воде (концентрация 5 мг/мл) из расчета 0.2 мг доксорубицина на 1 мг липидов и инкубировали в течение 1 часа при 60С. Температура, до которой необходимо нагревать липосомы для включения лекарственного препарата определяется Тфп липидов, образующих липосомальную частицу. Температура должна быть выше Тфп. При Т Тфп липидный бислой переходит из состояния «геля» в состояние «жидкий кристалл», что облегчает прохождение молекул лекарства через липосомальный бислой. Нейтральная молекула доксорубицина, попав во внутрь липосомы, приобретает положительный заряд и остается там в виде соли - гидрохлорида доксорубицина. Для удаления невключившегося доксорубицина липосомы диализовали против буферного раствора, содержащего 5 мМ Hepes, 140 мМ NaCl, рН 7.4 в течение ночи при 4С при постоянном перемешивании.
Количество доксорубицина, включившегося в липосомы, определяли по оптической плотности раствора при длине волны 480 нм с помощью спектрофотометра (Hitachi U-1500, Япония) в присутствии 90%-ного изопропанола, содержащего 0.075 М НС1. Для этого строили калибровочную кривую зависимости оптической плотности раствора при длине волны 480 нм от концентрации доксорубицина. Затем по калибровочной кривой, измерив оптическую плотность исследуемых образцов, определяли концентрацию доксорубицина. Концентрация доксорубицина в липосомах - 1.2 мг/мл, что составляет 95% от теоретически возможного.
