Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Липосомальные лекарственные формы 13
1.1.1. Липосомальные препараты в медицинской практике 13
1.1.2. Технология изготовления липосомальных лекарственных форм 21
1.1.2.1. Методы изготовления липосомальных дисперсий 21
1.1.2.2. Повышение эффективности включения лекарственных веществ в липосомы 28
1.1.2.3. Стабилизация липосомальных дисперсий 31
1.1.3. Фармацевтический анализ липосомальных лекарственных форм 35
1.2. Общая характеристика производных бис-(Р-хлорэтил)-амина 40
1.2.1. Представление о сарколизине 43
1.2.2. Представление о цифелине 45
Заключение 48
Экспериментальная часть
Глава 2. Материалы и методы исследований 49
2.1. Материалы 49
2.2. Оборудование 54
2.3. Методы исследований 55
2.3.1. Изготовление липосомальной дисперсии цифелина 55
2.3.2. Изготовление липосомальной дисперсии сарколизина 56
2.3.3. Стерилизация липосомальных дисперсий цифелина и сарколизина 58
2.3.4. Лиофилизация липосомальных дисперсий цифелина и сарколизина 58
2.3.5. Определение размера и формы липосом 59
2.3.6. Определение значения рН липосомальных дисперсий 60
2.3.7. Определение потери в массе при высушивании 60
2.3.8. Количественное определение содержания цифелина и сарколизина в липосомальных лекарственных формах 60
2.3.9. Определение эффективности включения лекарственных веществ в липосомы 61
2.3.9.1. Определение эффективности включения цифелина в липосомы 61
2.3.9.2. Определение эффективности включения сарколизина в липосомы 62
2.3.10. Определение перекисного окисления липидов в липосомальных формах цифелина и сарколизина 63
2.3.11. Качественный анализ липосомальных лекарственных форм методом тонкослойной хроматографии 64
2.3.12. Изучение противоопухолевой активности липосомальных лекарственных форм цифелина и сарколизина 66
2.3.12.1. Изучение цитотоксической активности липосомальных лекарственных форм цифелина и сарколизина в опытах in vitro 66
2.3.12.2. Изучение противоопухолевой активности липосомальной лекарственной формы цифелина в опытах in vivo 68
2.3.13. Статистический анализ полученных результатов 70
Заключение 70
Глава 3. Разработка состава и технологии изготовления липосомальных лекарственных форм цифелина и сарколизина 71
3.1. Оптимизация состава липосомальных дисперсий 71
3.1.1. Выбор состава липосомальной дисперсии цифелина 72
3.1.2. Выбор состава липосомальной дисперсии сарколизина 75
3.2. Сравнение методов изготовления липосомальных дисперсий 86
3.2.1. Сравнение методов изготовления липосомальной дисперсии цифелина 86
3.2.2. Сравнение методов изготовления липосомальной дисперсии сарколизина 89
3.3. Лиофилизация липосомальных дисперсий 90
3.3.1. Выбор условий лиофилизации липосомальной дисперсии цифелина 92
3.3.2. Выбор условий лиофилизации липосомальной дисперсии сарколизина 95
3.4. Влияние добавления антиоксиданта в состав липосомальной формы на перекисное окисление липидов 98
3.4.1. Влияние антиоксиданта на свойства липосомальной формы цифелина 98
3.4.2. Изучение перекисного окисления липосомальной формы сарколизина 100
3.5. Состав и технология изготовления лиофилизированных липосомальных форм цифелина и сарколизина 101
Заключение 103
Глава 4. Фармацевтический анализ липосомальных лекарственных форм цифелина и сарколизина 104
4.1. Количественное определение цифелина и сарколизина в лекарственных формах методом спектрофотометрии 104
4.1.1. Разработка и валидация методики количественного определения цифелина в липосомальной лекарственной форме методом спектрофотометрии 105
4.1.1.1. Разработка методики количественного определения цифелина в липосомальной лекарственной форме 105
4.1.1.2. Валидация методики количественного определения цифелина в липосомальной лекарственной форме 110
4.1.2. Разработка и валидация методики количественного определения сарколизина в липосомальной лекарственной форме методом спектрофотометрии 116
4.1.2.1. Разработка методики количественного определения сарколизина в липосомальной лекарственной форме 116
4.1.2.2. Валидация методики количественного определения сарколизина в липосомальной лекарственной форме 120
4.2. Определение эффективности включения сарколизина в липосомы 126
4.3. Тонкослойная хроматография липосомальных лекарственных форм 129
4.3.1. Тонкослойная хроматография липосомальной лекарственной формы цифелина 129
4.3.2. Тонкослойная хроматография липосомальной лекарственной формы сарколизина 133
4.4. Стабильность лиофилизированных липосомальных лекарственных форм 135
4.4.1. Изучение стабильности лиофилизированной липосомальной лекарственной формы цифелина при хранении 136
4.4.2. Изучение стабильности лиофилизированной липосомальной лекарственной формы сарколизина при хранении 136
Заключение 139
Глава 5. Изучение цнтотоксической активности и противоопухолевого действия липосомальных лекарственных форм цифелина и сарколизина 140
5.1. Изучение цнтотоксической активности липосомальных лекарственных форм сарколизина и цифелина в опытах in vitro 140
5.2. Изучение противоопухолевого действия липосомальной лекарственной формы цифелина в опытах in vivo 146
Заключение 150
Обсуждение результатов 151
Общие выводы 155
Список литературы 156
Приложения 174
- Фармацевтический анализ липосомальных лекарственных форм
- Изучение противоопухолевой активности липосомальной лекарственной формы цифелина в опытах in vivo
- Выбор состава липосомальной дисперсии сарколизина
- Валидация методики количественного определения цифелина в липосомальной лекарственной форме
Введение к работе
Актуальность темы
Диагноз «рак» стал приговором для многих людей. В мире ежегодно фиксируется 12 миллионов новых случаев онкологических заболеваний (международная некоммерческая организация «Всемирный фонд исследований рака»). По данным ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН за последние 10 лет число онкологических больных в России увеличилось в полтора раза.
Наряду с хирургическими и лучевыми методами лечения широко применяется химиотерапия злокачественных опухолей, которая получила научное обоснование в 40-х гг. ХХ в. Проведенные исследования первого цитостатического препарата алкилирующего действия – эмбихина – позволили продвинуть его в клинику для лечения лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы и мелкоклеточного рака легкого. В это время выдающийся отечественный ученый Л.Ф. Ларионов предложил использовать аминокислоты, обеспечивающие селективность действия препаратов на ДНК раковых клеток, в качестве «носителей» цитотоксической химической группы бис-(-хлорэтил)-амина. В соответствии с этой идеей в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН синтезированы первые отечественные препараты: сарколизин и его пептидное производное – цифелин. Но терапевтический эффект сарколизина сопряжен с рядом побочных действий, а менее токсичный цифелин в силу нерастворимости в воде обладает низкой биодоступностью.
Сохранение и продление жизни многих онкологических больных прямо зависит от применения инновационных лекарственных форм (ЛФ). Одно из наиболее интересных и быстро развивающихся направлений современных исследований в области медицины и фармации – применение липосом в качестве носителей для доставки лекарственных веществ (ЛВ) к патологически измененным клеткам. В отличие от регулярной, упорядоченной васкуляризации нормальных тканей сосуды опухолей представляют собой аномальные, деформированные капилляры с проницаемыми стенками и замедленным кровотоком. Так, благодаря эффекту повышенной проницаемости капилляров и удерживания ЛВ в тканях организма с нарушенным лимфатическим дренажом, липосомы накапливаются в опухоли, способствуя повышению терапевтического эффекта лекарственных препаратов. В мире зарегистрированы известные (Daunoхome, Doxil, Caelyx, Myocet, Lipodox, Липодокс) и активно разрабатываются новые противоопухолевые липосомальные препараты. В многочисленных клинических исследованиях продемонстрировано преимущество инкапсулирования цитотоксичных ЛВ в везикулы за счет более мягкого действия и снижения побочных эффектов на здоровые клетки.
В связи с вышеизложенным актуальной является разработка новых ЛФ известных противоопухолевых веществ – стерически стабилизированных липосом производных бис-(-хлорэтил)-амина – цифелина и сарколизина.
Цель и задачи исследования
Целью настоящего исследования являлось создание стерически стабилизированных липосомальных лекарственных форм (ЛЛФ) сарколизина и цифелина, повышающих их биодоступность и избирательность противоопухолевого действия.
Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие основные задачи:
-
Разработать оптимальный состав стерически стабилизированных ЛЛФ сарколизина и цифелина.
-
Оптимизировать технологию и провести сравнение методов изготовления липосомальных дисперсий сарколизина и цифелина.
-
Экспериментально обосновать условия получения устойчивых при хранении лиофилизированных липосомальных лекарственных форм (ЛЛЛФ) сарколизина и цифелина.
-
Разработать методики качественного и количественного анализа ЛЛЛФ сарколизина и цифелина.
-
Определить показатели качества и изучить стабильность ЛЛЛФ сарколизина и цифелина.
-
Оценить цитотоксическую активность ЛЛЛФ сарколизина и цифелина в опытах in vitro и противоопухолевое действие в опытах in vivo.
Научная новизна
Впервые разработан состав стерически стабилизированных ЛЛФ сарколизина и цифелина. На основании комплексных исследований установлена методика загрузки сарколизина в липосомы. Выбрана оптимальная технология изготовления липосомальных дисперсий. Изучено действие различных криопротекторов на показатели качества ЛЛФ производных бис-(-хлорэтил)-амина в процессе лиофилизации.
Разработаны методики качественного и количественного анализа новых ЛФ. Определены показатели качества ЛЛЛФ сарколизина и цифелина и исследуется их изменение при хранении. Валидированы методики количественного определения сарколизина и цифелина в ЛЛЛФ методом спектрофотометрии.
В опытах in vitro и in vivo установлено преимущество противоопухолевого действия стерически стабилизированных ЛЛЛФ по сравнению с субстанциями сарколизина и цифелина.
Практическая значимость
Технология изготовления ЛЛЛФ цифелина и сарколизина внедрена в работу лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН и в учебный процесс кафедры фармацевтической технологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова. Методики фармацевтического анализа новых ЛФ внедрены в работу лаборатории химико-фармацевтического анализа НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН. Методики получения и анализа ЛЛЛФ могут быть переданы в другие организации.
Подготовлены проекты ФСП на ЛП: «Цифелин липосомальный лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 17 мг» и «Сарколизин липосомальный лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 2 мг». В лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН утверждены лабораторные регламенты на производство указанных препаратов.
Более высокий противоопухолевый эффект ЛЛЛФ цифелина и сарколизина по сравнению с нелипосомальными позволяет начать производство новых ЛФ для углубленного доклинического изучения.
Положения, выносимые на защиту
-
Результаты исследований по разработке состава и технологии изготовления липосомальных дисперсий цифелина и сарколизина.
-
Выбор криопротектора для лиофилизации липосомальных дисперсий цифелина и сарколизина.
-
Методики качественного и количественного анализа и показатели качества ЛЛЛФ цифелина и сарколизина, изучаемые в процессе хранения.
-
Результаты изучения цитотоксического действия ЛЛЛФ цифелина и сарколизина в опытах in vitro и противоопухолевого эффекта in vivo.
Апробация работы
Материалы проведенных исследований представлены на конференциях: IХ и Х Всероссийских научно-практических конференциях «Отечественные противоопухолевые препараты» (Нижний Новгород, 18-19 мая 2010г.; Москва, 22-23 марта 2011г.), II и III Всероссийских научных конференциях с международным участием «Наноонкология» (Тюмень, 26-28 сентября 2010г.; Саратов, 6-7 сентября 2011г.), Итоговой всероссийской научной конференции молодых исследователей с международным участием «Татьянин день» (Москва, январь 2011г.), IV Архангельской международной медицинской научной конференции молодых ученых и студентов (Архангельск, 26-27 апреля 2011г.), IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием: Биомедицинская инженерия и биотехнология (Курск, июнь 2011г.), Rusnanotech nanotechnology international forum (Moscow, October 26-28 2011г.), Научно-методической конференции с международным участием «Сандеровские чтения» (Санкт-Петербург, 3 февраля 2012г.), Научно-практической конференции «Аспирантские и докторантские чтения: Дерзания нового времени – поиск инноваций» (Москва, 8 февраля 2012г.), XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 23-27 апреля 2012г.), Межлабораторных конференциях НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, Межкафедральной научной конференции на кафедре фармацевтической технологии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (Москва, 30 мая 2012 г.).
Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрения в практику.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.01 – технология получения лекарств. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1, 3 и 4 паспорта специальности технология получения лекарств.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с комплексной научной темой ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (номер государственной регистрации 01.2.006 06352). Тема включена в план научных исследований кафедры фармацевтической технологии «Разработка научных основ технологии, стандартизации и организации производства лекарственных средств».
Публикации
По материалам диссертационной работы опубликована 21 печатная работа, включая 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 174 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, общих выводов, обсуждения результатов, библиографии и приложений. Работа содержит 43 таблицы и 32 рисунка. Библиографический список включает в себя 183 источника литературы, из которых 98 зарубежных.
Фармацевтический анализ липосомальных лекарственных форм
В зависимости от свойств ЛВ и метода получения, липосомальные дисперсии образуются моно- или гетерогенные относительно размера везикул, ламеллярности и отличаются по эффективности включения ЛВ. Для стандартизации ЛЛФ в соответствии с [63, 70, 104, 119, 138] используют параметры качества, представленные в таблице 2.
Важными показателями качества липосомальных форм на этапе разработки являются:
Определение размера везикул
Наиболее широко представлены методы определения размера липосом, а именно, спектроскопия статического и динамического светорассеяния, некоторые виды микроскопии, эксклюзионная хроматография (ЭХ, гель-фильтрация), фракционирование в потоке при наличии поля и аналитическое центрифугирование.
Электронная микроскопия (ЭМ) (трансмиссионная ЭМ (ТЭМ) с негативным окрашиванием, ТЭМ методом замораживания-скалывания и крио ТЭМ) дает значительную информацию о ЛЛП, включая внешний вид везикул различного размера. Однако этот метод не является рутинным, поскольку в данном случае требуется сложная пробоподготовка, удаление внешней среды жидких образцов липосом и время, затрачиваемое на получение изображения размеров популяции.
Другой вид микроскопии - атомно-силовая микроскопия позволяет изучать морфологию, размер и стабильность липосом. Последнее обусловлено минимизацией влияния иммобилизации заданной поверхности на образец и тем, что собственная сила образца не разрушает везикулы.
Зависимая от времени квалификация липосомальных везикул ВЭЖХ с использованием гель- хроматографии может использоваться для разделения липосом, определения размеров липосом до 0,8 мкм и молекулярного веса. Однако длительность процесса может приводить к увеличению адсорбции везикул на материале колонки за счет электростатических взаимодействий и сил Ван-дер-Ваальса, обнаруживаемых по изменениям графика элюирования. Точность определения зависит от хорошо подобранных наборов стандартов.
Широко используемый метод анализа распределения липосом по размерам - динамическая спектроскопия рассеяния света (ДСР), известная также как квазиэластичное рассеяние или фотонно-корелляционная спектроскопия. В ходе измерения определяют зависимые от времени колебания света, рассеиваемого от частиц, претерпевающих Броуновское движение, которое является результатом столкновений между взвешенными частицами и растворенными молекулами. Преимущества методики заключаются в проведении измерений в исходной жидкой среде, его чувствительности к небольшим количествам высокомолекулярных молекул, коммерческой доступности оборудования, минимальном расходе образца и не требует длительной подготовки. Применим в большом диапазоне размеров, от нескольких нанометров до микрометра.
В то время как ДСР полагается на определение рассеяния света (угол рассеяния 90), используя зависимые от времени колебания рассеянного света, в методе статического рассеяния измеряют зависимую от времени усредненную интенсивность рассеяния как функцию колебаний. В отличие от ЭХ, определение много углового рассеяния света (МРС) обеспечивает точное измерение молекулярного веса без использования стандартных образцов.
Фракции полидисперстных липосом, собранные после разделения ЭХ или фракционирования в потоке при наличии поля, могут быть проанализированы ДСР или МРС для более точного разделения частиц по размерам.
Менее распространенными методами анализа размеров липосом являются спектроскопия ЯМР, проточная цитометрия, прямоугольное рассеяние света и капиллярный зонный электрофорез [39,104, 138].
Определение ламеллярности липосом
Степень ламеллярности зависит от используемых липидных компонентов и метода изготовления. Определение ламеллярности проводят методом 31Р ЯМР. По методике, добавление Мп2+ гасит 31Р ЯМР сигнал от ФЛ на внешней поверхности везикул. При этом Мп2ь взаимодействует с отрицательно заряженными фосфатными группами ФЛ и вызывает уширение и снижение определяемого сигнала. Степень ламеллярности определяют по отношению сигналов до и после добавления Мп2+. Помимо того, что эта методика часто используется, недавно обнаружили её достаточную чувствительность к концентрации Мп2+ и буфера, а также типу анализируемых липосом.
Другими методами определения ламеллярности являются: электронная микроскопия по методу замораживания-скалывания, малоугловое рассеяние рентгеновских лучей и метод, основанный на изменении видимого или флюоресцирующего сигнала маркера липидов при добавлении реагентов. Последний широко освящен в литературе в связи с простотой исполнения в условиях обычной лаборатории. В зависимости от используемой реакции образования окрашенного продукта определяют аминогруппы липидов, внешние реактивные группы липидов. При анализе предполагают равномерность распределения липидов в бислое, скорость инверсии между слоями незначительна и используемые реагенты непроницаемы для мембраны во время проведения измерений [104].
Определение эффективности включения
Методы количественного определения инкапсулированного в липосомы ЛВ основаны на разрушении липидного бислоя с последующим анализом высвободившегося вещества. При этом сигнал интактных липосом определяют до разрушения бислоя. Возможен количественный анализ спектрофотометрией, флюоресцентной спектроскопией, ферментный анализ и электрохимические методы.
В случае применения таких методов как ВЭЖХ или фракционирование в потоке при наличии поля, процент включения может быть выражен отношением пика невключенного ЛВ по отношению к стандарту, представленному ЛЛП в исходной концентрации. Данный метод может применяться, если липосомы не подвергают очистке (ЭХ, диализ) перед последующим изготовлением. Каждая из методик подходит для отделения свободного ЛВ, которое остается во внешнем пространстве и может быть использовано для контроля стабильности при хранении по «вытеканию» или влияния различных разрушительных условий на удержание ЛВ в везикулах. В последнем случае общий лизис может быть вызван добавлением сурфактанта. В некоторых работах представлено совместное определение размеров и эффективности включения ЭХ с последующим много угловым рассеянием света, объединенным с детектором определения концентрации.
Поскольку методы, используемые для отделения свободного ЛВ могут способствовать «вытеканию» его из липосом, а в некоторых случаях наблюдается неопределенность в степени разделения, исследователи используют способы, не предполагающие разделение. К ним относятся:
Н ЯМР, где обнаруживают рН чувствительный сдвиг резонанса свободного маркера во внешней среде по сравнению с инкапсулированным;
Диффузия с последовательной двумерной ЯМР, основанной на различии коэффициентов диффузии включенных и свободных молекул маркера;
Флуоресцентные методы, в которых сигнал невключенного флуорофора гасится веществами, находящимися во внешнем растворе;
Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР), предполагающий уширение сигнала неинкапсулированного маркера при добавлении вещества, не проходящего через мембрану.
ЭВ (процент инкапсулирования, эффективность инкорпорирования) определяют сравнением общего количества отделенного инкапсулянта с исходным количеством внесенного в раствор вещества. Величина инкорпорирования определяется не только способностью липосом захватывать молекулы ЛВ, что зависит от состава липидов и буфера, типа липосом, метода изготовления, но и исходным количеством инкапсулянта. При характеристике липосом с целью повышения степени включения, для возможности сравнения необходимо поддерживать постоянный уровень концентрации липида и ЛВ. В случае использования показателя «степень включения» для сравнения методов изготовления обязательным требованием является гарантированное отсутствие потери инкапсулянта в процессе изготовления [68,104, 138].
Изучение противоопухолевой активности липосомальной лекарственной формы цифелина в опытах in vivo
Противоопухолевую активность ЛЛЛФ цифелина изучали на двух опухолях: лейкоцитарной лейкемии Р-388 и аденокарциноме молочной железы Са-755.
Опухоли перевивали мышам-самкам гибридам первого поколения BDFl (C57Bl/6 DBA/2) внутрибрюшинно асцитной жидкостью по 106 клеток при разведении в среде 199. Животные были получены из питомника ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, содержались в одинаковых условиях вивария с брикетированным режимом кормления. В опытах использованы мыши массой 20-25 г в возрасте 1,5-2 месяца в количестве: 10 особей в контрольных и 6 - в опытных группах.
В случае лейколейкоза Р-388 лечение мышей начинали через 24 часа после внутрибрюшинной перевивки опухоли. Из субстанции гидрофобного цифелина (противоопухолевая активность аналогична таблетированной ЛФ) получали суспензию в 1% крахмальном клейстере ex tempore и вводили мышам перорально в дозе 80 мг/кг в течение 5 дней. ЛЛЛФ цифелина регидратировали в воде для инъекций ex tempore и вводили внутрибрюшинно мышам с опухолью Р-388 в дозах 10, 20 и 30 мг/кг ежедневно в течение 5 дней.
Критерием оценки противоопухолевого действия ЛЛЛФ цифелина на лейкоцитарный лейкоз Р-388 принято увеличение продолжительности жизни (УПЖ, %) животных, которое рассчитывали по формуле:
УПЖ = Пк"П 100 % (9), "к где Пк и П0— средняя продолжительность жизни мышей (дни) в контрольной и опытной группах, соответственно.
Лечение мышей с аденокарциномой молочной железы Са-755 начинали через 48 часов после подкожной перевивки. Субстанцию гидрофобного цифелина вводили перорально в 1% крахмальном клейстере ex tempore в дозе 80 мг/кг в течение 5 дней. ЛЛЛФ цифелина регидратировали в воде для инъекций ex tempore и вводили внутрибрюшинно мышам с опухолью Са-755 в дозе 20 мг/кг ежедневно в течение 5 дней. Размер опухоли измеряли через 7, 10, 14 и 17 дней после перевивания.
Критерием оценки противоопухолевой активности ЛФ цифелина в данном случае служило торможение роста опухоли (ТРО, %) которое рассчитывали по формуле, где VK и V0 — средний объем опухоли (мм3) в контрольной и опытной группах, соответственно.
Выбор состава липосомальной дисперсии сарколизина
Сарколизин в отличие от цифелина, являющегося его дипептидом, практически нерастворим в хлороформе, но легко растворим в воде при нагревании. Поскольку сарколизин невозможно инкорпорировать в липидный бислой, его включали во внутреннюю среду липосомальных везикул с липидной мембраной, представленной различными молярными соотношениями «ФХ: Хол: ДСФЭ-ПЭГ-2000». Выбор оптимального соотношения проводили по показателям: эффективность включения (методика в п.4.2), размер везикул (методика в п.2.3.5) и значение рН (методика в п.2.3.6).
На первом этапе разработки состава липосомальной дисперсии изучили возможность применения пассивной загрузки сарколизина. Для этого липиднуга пленку, полученную упариванием хлороформного раствора, содержащего ФХ, Хол и ДСФЭ-ПЭГ-2000, на роторном испарителе под вакуумом, гидратировали раствором ЛВ (методика в п.2.3.2). Ранее установлено, что присутствие хлорид ионов стабилизирует сарколизин, поэтому его растворяли в 0,9 % растворе натрия хлорида при нагревании до 60 С. Получали липосомальные дисперсии с 0,2 % концентрацией ЛВ, имеющие значение рН - 2,9. В представленных в таблице 5 композициях показан низкий процент ЭВ с максимальной величиной - 31 % и незначительными различиями по размеру везикул.
Для растворения сарколизина в ЛФ — «сухая рассыпка» использовали 0,9 % раствор натрия хлорида. В ходе создания ЛФ — «Сарколизин лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,02 г» изучена стабильность сарколизина и разработан состав растворителя Н (состав в п.2.3.2), который способствует снижению скорости гидролиза и значительно повышает растворимость ЛВ без образования геля (характерно для 2 % водного раствора) [49, 62, 74].
Поскольку загрузка сарколизина, растворенного в 0,9 % растворе натрия хлорида, оказалась малоэффективной, в качестве растворителя стали использовать растворитель Н. В результате получили липосомальные дисперсии с низким значением рН - 1,5. ЭВ в данном случае не определяли, потому что такое значение рН стимулирует окислительный процесс в липидной мембране.
Вследствие малой величины инкапсулирования сарколизина в липосомы методом пассивной загрузки, сделан вывод о необходимости разработки способа включения сарколизина методом активной загрузки по градиенту рН.
Существуют различные варианты системы «внешняя-внутренняя среда» везикул с ЛВ, являющимися солями сильных кислот и слабых оснований. Однако в нашем случае, учитывая низкую растворимость ЛВ, начали с изучения растворимости в наиболее часто используемых для создания градиента рН растворах: 20 мМ HEPES; 300 мМ раствор аммония сульфата, 150 мМ раствор натрия хлорида (0,9 %) и в цитратном буфере с величиной рН 3,0 и 6,0. В результате добавления 20 мг сарколизина к 10 мл одного из указанных выше растворителей при комнатной температуре и при нагревании до 60 С наблюдали растворение только в растворе натрия хлорида.
Исходя из изучения растворимости, пришли к следующему: 1) в качестве растворителя для сарколизина можно использовать 0,9 % раствор натрия хлорида или растворитель Н; 2) загрузка ЛВ за счет градиента ионов аммония невозможна так как сарколизин не растворим в растворе аммония сульфата, и в процессе загрузки не будет достаточного градиента рН из-за нестабильности сарколизина при подщелачивании, необходимом для протонирования ЛВ; 3) выбрать подходящий буферный раствор для создания рН-градиента.
Экспериментальную часть по разработке методики активной загрузки сарколизина в состав везикул путем создания рН-градиента начали с выбора внутренней среды везикул (табл.6). В опыте использовано два липосомальных состава: 1) с молярным соотношением липидов, аналогичным составу 3 (табл. 5), для которого определена максимальная ЭВ ЛВ и 2) с молярным соотношением «ФХ: Хол: ДСФЭ-ПЭГ-2000» равным 75:15:1. Гидратирующая жидкость представляла собой сарколизин, растворенный в 0,9 % растворе натрия хлорида (составы 1-2, табл.6) или в растворителе Н (составы 3-4, табл.6). Дисперсии проэкструдированных липосом смешивали с цитратным буфером с величиной рН 6,0 в соотношении 2:1.
В результате отмечено увеличение значения рН полученных дисперсий в 2 раза по сравнению с рН липосом без добавления цитратного буфера. ЭВ при гидратации 0,9 % раствором натрия хлорида менялась незначительно (1-4 %), тогда как с растворителем Н в составе 4 (табл.6) добились инкапсулирования 41 %. Малый процент ЭВ в составах 1 и 2 объясняется низким градиентом величины рН между внешней и внутренней средой. Из-за этого, сарколизин - слабое основание - во внутренней среде липосом преобладает в непротонированной форме, способной диффундировать сквозь липидную мембрану до уравновешивания концентрации внутри и снаружи везикул. В составах 3 и 4 установлено, что сильно кислое значение рН внутренней среды способствует протонированию нейтральной формы основания, приводя к захвату соединения внутрь. В случае с растворителем Н также наблюдали большую стабильность размеров везикул при хранении дисперсии при +4 С, поэтому он выбран в качестве внутренней среды.
Стандартный рН-градиентный метод, представленный в работах, посвященных загрузке гидрофильных веществ, состоит из внешней среды с растворенным ЛВ со значением рН 7,5 (20 мМ HEPES +150 мМ NaCl) и внутренней - с величиной рН 4,0 (цитратный буфер) [65,120]. Применили подобный подход и в данной работе. Так как спектрофотометрически установлено, что при значениях рН 7,0-11,0 подщелачивание раствора сарколизина приводит к резкому необратимому повышению интенсивности поглощения в УФ области в результате гидролиза ЛВ [83], использовать описанную выше методику недопустимо. Метод, применимый в эксперименте, модифицировали: липидную пленку гидратировали цитратным буфером с величиной рН 6,0. В качестве внешней среды использовали раствор сарколизина в растворителе Н (рН 1,5), добавляемый к дисперсии «пустых» липосом в объемном соотношении «липосомы: сарколизин» 2:1 в составе 5 и 1:1 в составе 6 (табл.6). Как и ожидалось, несмотря на достаточную величину АрН 4,0 (градиент создается при разнице рН между внешней и внутренней средой не менее 3,0), молекулы основания не задерживаются во внутренней слабокислой при внешней сильнокислой среде. В составах 5 и 6, помимо низкой ЭВ -21 и 26 %, соответственно, также наблюдали более крупные размеры везикул -190 нм. В результате для дальнейших исследований выбран состав 4 (табл.6).
Загрузку по градиенту рН можно создавать добавлением как цитратного, так и фосфатного буфера с различным значением рН. Исследования по выбору буферного раствора для смешения с липосомальной дисперсией сарколизина проводили на составе с молярным соотношением «ФХ: Хол: ДСФЭ-ПЭГ-2000» 75:15:1 и «суммарный липид: сарколизин» 34:1 (состав 4 табл. 6). При добавлении к липосомальной дисперсии в объемном соотношении 2:1 различных буферных растворов наилучшая буферная емкость выявлена для цитратного буфера (рН 6,0) с которым получали липосомы со значением рН 3,7, тогда как везикулы с фосфатным буфером (рН 6,0 и 8,0) были большего диаметра, с лучшим значением ЭВ и величиной рН дисперсии 2,3 (табл. 7). Также в процессе хранения липосом с фосфатным буфером при +4 С в течение нескольких недель обнаружили выпадение белого хлопьевидного осадка, не встречавшегося в других составах. По результатам эксперимента для дальнейшего изучения выбрали цитратный буфер с величиной рН 6,0.
Валидация методики количественного определения цифелина в липосомальной лекарственной форме
Для подтверждения специфичности разработанной методики оптическую плотность спиртовых разведений измеряли в диапазоне длин волн от 200 до 400 нм, а для установления линейности, правильности и прецизионности анализ проводили при длине волны 260 ± 2 нм.
Специфичность
При подтверждении специфичности аналитической методики сравнивали электронные спектры поглощения вспомогательных веществ («пустых» липосом с криопротектором), стандартного раствора субстанции и ЛЛЛФ цифелина. Как видно на рисунке 18 кривая 1 и 3 схожи, а оптическая плотность вспомогательных веществ в области максимума - 260 ± 2 нм -близка к нулю и не оказывает значительного влияния на показание содержания действующего вещества в ЛФ, поскольку липидные компоненты поглощают в области менее 240 нм (кривая 2), а натрия хлорид и сахароза, входящие в состав прописи, не изменяют форму кривой.
Линейность
Линейность методики количественного определения цифелина доказывали в диапазоне от 80 до 120 % концентрации действующего вещества в ЛЛЛФ.
Для опыта изготавливали модельные смеси ЛЛЛФ, представляющие собой разведения вспомогательных веществ с точными навесками субстанции цифелина на 5 уровнях, составляющих 80, 90, 100, ПО и 120 % концентрации, что соответствует навескам ЛВ: 13,66; 15,32; 17,06; 18,75 и 20,43 мг (табл.25). На каждом уровне проводили 3 определения. Значения оптической плотности разведений представлены в таблице 26.
С помощью коэффициента корреляции (R) установлено, что зависимость между концентрацией цифелина и оптической плотностью в диапазоне от 80 до 120 % концентрации имеет линейный характер и описывается линейным уравнением (рис.19).
Правильность
Для установления правильности определяли ошибку фактора отклика методом с плацебо. Изготавливали спиртовые разведения модельных смесей вспомогательных веществ с добавлением навески цифелина, соответствующей 80, 100 и 120 % концентрации ЛВ (табл.25). На каждом уровне проводили 3 определения.
Спектрофотометрическая методика определения содержания цифелина признана правильной, так как получаемые результаты близки к истинному значению и относительная погрешность среднего результата не превышает ±1 % (табл.27).
Прецизионность
1) При установлении сходимости проводили испытание 6 образцов одной серии ЛЛЛФ цифелина, содержащих 100 % ЛВ. Сходимость результатов оценивали путем вычисления среднего значения, стандартного отклонения, коэффициента вариации и доверительного интервала (табл.28).
При сравнении результатов определения оптической плотности, полученных в разные дни, вычисленное значение критерия Фишера (Fnp = 0,78) не превышало табличного значения (FT= 5,05) (табл.29). Следовательно, различие дисперсий S і и S 2 статистически незначимо. Величина критерия Стьюдента (tnp= 1,72) также не превышала табличное значение (tr= 2,228). На основании этого можно сделать вывод об отсутствии статистически значимых различий между результатами анализов. Поскольку F„p FT(5 %) и t np tr (5 %), то различия между средними значениями и стандартными отклонениями результатов, полученных в разные дни, случайны. Таким образом, при определении прецизионности установлена сходимость и промежуточная прецизионность спектрофотометрической методики количественного определения цифелина в ЛЛЛФ.
По результатам установления специфичности, линейности, правильности и прецизионности, валидированная методика количественного определения содержания цифелина в ЛЛЛФ методом СФМ при 260 ±2 нм может применяться в диапазоне 80-120 % концентрации анализируемого вещества в лекарственной форме.
