Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время заболевания сердечнососудистой системы являются одной из основных проблем государственных, медицинских и общественных организаций в индустриально развитых странах (Шалыюва С.А., 2006).
Одним из важных аспектов в патогенезе и клинике этих заболеваний, а также сахарного диабета, ожирения, гиперлипидемии и ряда распространенных патологических состояний считается нарушение структуры и функции эндотелия (Баранова Е.И., 2009; Марголис Л.Б., 1986; Сергиенко В.Б., 1999), сопровождающееся изменением соотношения между медиаторами, обеспечивающими в норме оптимальное течение эндотелиизависимых процессов. В норме в ответ на определенные виды стимуляции эндотелий реагирует усилением синтеза веществ, вызывающих расслабление гладкомышечных клеток сосудов, и в первую очередь оксида азота (N0) (Марков Х.М., 2000; Ко А., 1999; Vallance Р., 2004).
При большинстве метаболических нарушении в результате оксидативно-го стресса происходит накопление асимметричных метиларгинов, нарушающих синтез оксида азота за счет блокирования действия NO-синтазы (NOS) и ее разрушения (Stuhlinger М.С., 2001; Lin K.Y., 2002; Ito А., 1999). Наиболее распространенным в природе является асимметричный диметиларгинин (ADMA). Схожую с ним структуру и свойства имеет также и N-нитро-Ь-аргинин метиловый эфир (L-NAME) (Vallance Р., 2004). В экспериментальных условиях введение животным L-NAME вызывает развитие эндотелиальной дисфункции. При этом заметные функциональные и морфологические изменения происходят уже через семь дней введения L-NAME (Покровский М.В., 2006). Модель L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота воспроизводит универсальные механизмы, лежащие в основе повреждения эндотелия. В то же время разработка новых моделей может предоставить возможность детального изучения отдельных метаболических нарушений, приводящих к развитию эндотелиальной дисфункции, и методов их коррекции.
Сравнительно недавно к потенциальным факторам риска сердечнососудистых заболеваний стали относить гипергомоцистеинемию. Гипергомо-цистеинемия может являться независимым фактором развития эндотелиальной дисфункции или усиливать уже имеющееся повреждение эндотелия (Zhou J., 2008; Weiss N., 2001; MacAllister R.J., 1996). Доказано, что гипергомоцистеи-немия оказывает неблагоприятное влияние на механизмы, участвующие в регуляции сосудистого тонуса, обмена липидов и коагуляционных процессов. Эти патогенетические изменения, по-видимому, обусловливают большую частоту сердечно-сосудистых заболеваний на фоне высокого уровня гомоцистеина (ГЦ) в плазме крови.
Предполагается, что эффекты гомоцистеина связаны с влиянием на NOS и со снижением биологической активности NO (Zhou J., 2008; Weiss N., 2001; MacAllister R.J., 1996). Причины, приводящие к повышению концентрации гомоцистеина, к настоящему моменту достаточно хорошо изучены, в то же время известных факторов коррекции гипергомоцистеинемии не так много. Поэтому
на данном этапе изучение гипергомоцистеинемии в первую очередь должно быть направлено на поиск путей коррекции нарушений, связанных с этим состоянием. Наиболее походящим для такого рода исследований является использование экспериментальных моделей.
Большинство из описанных ранее моделей гипергомоцистеинемии основывается на добавлении метионина или гомоцистеина в корм и питьевую воду животных, при этом достаточно сложно обеспечить получение животными в разных сериях одинаковых доз веществ. Поэтому особого внимания заслуживает разработка моделей, основанных на внутрижелудочном и инъекционном введении, так как такие модели благодаря точному дозированию обеспечивают возможность воспроизведения полученных результатов в дальнейшем. Использование этих моделей позволит более точно оценить развитие эндотелиальной дисфункции и изучить эндотелиопротективные эффекты лекарственных препаратов, а также отдельных химических и лекарственных веществ при гипергомоцистеинемии.
Для изучения эндотелиопротективиой активности наше внимание привлек препарат "Фосфоглив". В его состав входит фосфатидилхолин (ФХ), являющийся основным структурным элементом мембран клеток. Фосфатидилхолин способен восстанавливать структуру и функции мембран при повреждении, оказывая цитопротекторное действие. Вторым компонентом является глицират, представляющий собой смесь глицирризиновой кислоты (ГК) и ее солей. Гли-цирризиновая кислота обладает иммуномодулирующим, противовоспалительным, антиоксидантным действием. Благодаря разработке оригинальной технологии производства инъекционной формы была получена нанопартикулиро-ванная система, обладающая высокой биодоступностыо. Интересным представляется изучение эндотелиопротективиой активности пероралыюй и инъекционной нанопартикулированной форм препарата "Фосоглив" именно при ме-тионин-индуцированной гипергомоцистеинемии и L-NAME-индуцировашюм дефиците оксида азота, так как защитное действие препарата "Фосфоглив" может проявиться именно при этих состояниях, в первую очередь благодаря антиоксидантному и мембранопротекторному влиянию.
Номер государственной регистрации темы - 01.2.009 50646.
Цель исследования. Сравнительное изучение эндотелио- и кардиопро-тективных свойств пероралыюй и инъекционной нанопартикулированной лекарственных форм препарата "Фосфоглив" при метионин- и L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции в эксперименте.
Задачи исследования.
-
Оценить развитие эндотелиальной дисфункции и нарушение функциональных возможностей миокарда при метионин-индуцированной модели эндотелиальной дисфункции в эксперименте с использованием результатов функциональных проб и биохимических исследований.
-
Оценить развитие эндотелиальной дисфункции и нарушение функциональных возможностей миокарда при L-NAME-индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.
-
Изучить эндотелиопротективные и кардиопротективные свойства пе-роральной и инъекционной нанопартикулировашшй лекарственных форм препарата "Фосфоглив" при метионин-индуцированной эндотелиалыюй дисфункции.
-
Изучить эндотелиопротективные и кардиопротективные свойства пе-роральной и инъекционной нанопартикулированной лекарственных форм препарата "Фосфоглив" при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO в эксперименте.
-
Изучить эндотелиопротективные и кардиопротективные свойства липоида С80 и глицирата в эквивалентных по содержанию в препарате "Фосфоглив" (капсулы) дозах при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO в эксперименте.
Научная новизна исследования. В работе впервые предложен способ моделирования метионин-индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс с помощью внутрижелудочного введения метионина в дозе 3 г/кг 1 раз в сутки в течение 7 дней. Впервые изучены эндотелио- и кардиопротективные эффекты препарата "Фосфоглив" и входящих в его состав липоида С80 и глицирата на моделях метионин- и L-NAME-индуцировашюй эндотелиальной дисфункции в эксперименте. Научная новизна подтверждается получением двух патентов РФ.
Практическая значимость. В работе обоснована эффективность применения препарата "Фосфоглив" для коррекции метионин- и L-NAME-индуцированной ЭД в эксперименте. Показано, что его использование позволяет нормализовать изменение соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация), предотвратить изменение биохимических показателей (концентрации гомоцистеина), а также добиться положительной динамики функциональных показателей сердечно-сосудистой системы (прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением, снижение адренореактивности).
Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания препарата "Фосфоглив" при заболеваниях, сопровождающихся развитием эндотелиальной дисфункции.
Внедрение результатов научных исследований.
Материалы диссертационного исследования, касающиеся эндотелиопро-тективной активности препарата "Фосфоглив" производства ОАО «Фармстан-дарт-Лексредства» используются в лекционных курсах кафедры фармакологии Орловского государственного университета, Белгородского государственного университета, Курского государственного медицинского университета.
Апробация работы. Материалы исследования были представлены на 74-й итоговой межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современность» (Курск, 2009), конференции «Молодежная наука: от фундаментальной идеи до инновационных проектов» (Курск, 2009), III Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2009), Всероссийской научно-практической конференции «Биомедицинская инженерия и биотехнология» (Курск, 2009), XVI Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009).
Апробация диссертации проведена на межкафедральной научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии, акушерства и гинекологии ФПО, инфекционных болезней и эпидемиологии, внутренних болезней ФПО, анатомии, акушерства и гинекологии, фармацевтической технологии, фармацевтической, токсикологической и аналитической химии, мобилизационной подготовки здравоохранения и медицины катастроф-ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, кафедры фармхимии и фармакогнозии БелГУ, НИИ экологической медицины Курского государственного медицинского университета.
По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 4 в изданиях, рекомендуемых ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.
Положения, выносимые на защиту.
-
Внутрижелудочное введение метионина в дозе 3 г/кг 1 раз в сутки в течение 7 дней вызывает у крыс-самцов Wistar увеличение концентрации гомоци-стеина в 6,2 раза, сопровождающееся нарушением функции эндотелия сосудов, усилением адренореактивности и снижением резерва сократимости. Показатели САД и ДАД остаются при этом в пределах нормы. Длительное, в течение 7 суток, внутрибрюшинное введение L-нитро-аргинин-метилоЕого эфира (L-NAME) в дозе 25 мг/кг характеризуется выраженным нарушением функции эндотелия, развитием выраженной артериальной гипертензии (191/145 мм рт.ст.), повышением адренореактивности и снижением резервов сократимости, снижением NO TOTAL и гипертрофией миокардиоцитов.
-
"Фосфоглив" (капсулы) в дозе 2,2 г/кг и "Фосфоглив" (лиофилизат) в дозе 0,5 мл/ кг, однократно в течение 7 суток, показали выраженное эндотелио-протективное и кардиопротективное действие на модели метионин-индуцированной эндотелиальной дисфункции, проявляющееся в нормализации соотношения эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой вазодилатации, уменьшении адренореактивности, повышении резерва сократимости, снижении концентрации гомоцистеина. При этом инъекционная нанопартикулированная лекарственная форма препарата "Фосфоглив" (лиофилизат) проявляла сопоставимое кардио- и эндотелиопротективное действие в дозе на порядок меньшей, чем пероральная форма.
-
"Фосфоглив" (капсулы) в дозе 2,2 г/кг и "Фосфоглив" (лиофилизат) в дозе 0,5 мл/ кг, однократно в течение 7 суток, проявляли выраженное эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота, что выражалось в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции. Результаты нагрузочных проб выявили предотвращение повышения адренореактивности и развития скрытой сердечной недостаточности на фоне повышения реакции на реоксигенацию. Инъекционная нанопартикулированная лекарственная форма "Фосфоглив" (лиофилизат) проявляла сопоставимое кардио-и эндотелиопротективное действие в дозе на порядок меньшей, чем пероральная форма.
4. Компоненты препарата "Фосфоглив" липоид С80 и глицират в эквивалентных дозах проявляли выраженное эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита N0, что выражалось в нормализации соотношения эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой вазодилатации. При этом в комплексном препарате наблюдалась адциция эндотелиопротектив-ной активности, что свидетельствует о целесообразности сочетаний компонентов с различной патогенетической направленностью действия.
Структура її объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 253 источника, из них 95 отечественных и 154 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 125 страницах машинописи, содержит 18 таблиц, 19 рисунков и 2 схемы.
МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Моделирование метионин-индуцнрованной гипергомоцистеинемии и определение уровня гомоцистеина крови.
Эксперименты выполнены на белых крысах-самцах Wistar массой 180-250 г.
С целью моделирования эндотелиальной дисфункции метионин (000 «Полисинтез», г. Белгород) вводили по следующим схемам: 1) ежедневное, 2 раза в сутки, внутрижелудочное введение метионина в дозе 5 г/кг в течение 7 дней (п=10 животных); 2) ежедневное, 1 раз в сутки, внутрижелудочное введение метионина в дозе 5 г/кг в течение 14 дней (п=10 животных); 3) ежедневное, 1 раз в сутки, внутрижелудочное введение метионина в дозе 3 г/кг в течение 7 дней (п=10 животных); 4) ежедневное, 1 раз в сутки, в течение 7 дней внутрижелудочное введение 10% раствора ТВИН 80 в дозе 1 мл/кг (контроль, п=10 животных).
Степень развития гипергомоцистеинемии оценивали по содержанию гомоцистеина в сыворотке крови экспериментальных животных. Концентрацию гомоцистеина определяли методом иммунотурбодиметрии с помощью набора фирмы Pliva-Lachema Diagnostika s.r.o.
Моделирование L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота.
Опыты проводились на белых крысах-самцах Wistar массой 180-250 г. N-нитро-Ь-аргинин метиловый эфир (L-NAME) вводился ежедневно один раз в сутки, внутрибрюшинно, в дозе 25 мг/кг в течение 7 дней.
Проведение функциональных проб в острых экспериментах на наркотизированных крысах.
По окончании моделирования дисфункции, на 15-е и 8-е сутки от начала эксперимента выживших животных наркотизировали (хлоралгидрат 300 мг/кг), вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей артериального давления (АД), болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли непрерывно посредством датчика P23ID Gould (США) и компьютерной программы Bioshell.
Помимо измерения артериального давления (АД) проводили ряд функциональных тестов с последующей оценкой изменения параметров гемодинамики (САД, ДАД, ЧСС): эндотелийзависимая вазодилатация (ЭЗВД) в ответ на внутривенное введение раствора ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг из расчета 0,1 мл на 100 г массы тела животного, а также эндотелийнезависимая вазодилатация (ЭНВД) в ответ на внутривенное введение раствора нитропруссида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг из расчета 0,1 мл на 100 г массы тела животного. Степень эндотелиальной дисфункции у экспериментальных животных оценивали по расчетному коэффициенту эндотелиальной дисфункции (КЭД), представляющему собой отношение площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение НП (ЭНВД) к площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение АХ (ЭЗВД) (Покровский М.В., 2006).
Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца и посредством датчика P231D Gould, США, АЦП L-154 и компьютерной программы Bioshell регистрировали показатели кардиогемодинамики (левожелудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dt max), максимальную скорость расслабления (-dp/dt max), частоту сердечных сокращений (ЧСС) и интенсивность функционирования структур (ИФС) (произведение частоты сердечных сокращений и давления, развиваемого левым желудочком (мм рт.ст. х уд. мин) (Покровский М.В., 2006).
Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности:
-
Проба на адренореактивность (внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида 1*10'бмоль/л, из расчёта 0,1 мл на 100 г) (Покровский М.В., 2006).
-
Нагрузка сопротивлением (пережатие восходящей аорты на 30 сек) (Покровский М.В., 2006).
-
Трехминутная гипоксия с последующей реоксигенацией (Петрищев Н.Н., 2000)
Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции. Использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO, позволяющая после депротеинизации сыворотки крови проводить одноэтапное количественное определение суммарных нитратов и нитритов (Метельская В.А., Туманова Н.Г., 2005). Принцип метода заключается в одновременном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии хлористого ванадия и реакции диазотирова-ния с последующим развитием окраски.
Для морфологического подтверждения развития моделируемых патологических процессов и комплексной оценки эффективности препаратов проведено гистологическое исследование сердца (во всех сериях эксперимента). Материал фиксирован в 10% формалине с последующей заливкой в парафин. Использованы окраски гематоксилином Рего и эозином. Морфометрия сердца проводилась с использованием окулярмикрометра.
Обоснование доз и дизайн эксперимента. Дозу препаратов рассчитывали исходя из содержания фосфатидилхолина, так как добиться эквивалентной дозировки обоих компонентов невозможно ввиду их разного соотношения в разных лекарственных формах препарата "Фосфоглив". Доза препарата "Фос-фоглив" (капсулы) рассчитывалась исходя из содержания фосфатидилхолина в наиболее распространенных препаратах-аналогах препарата "Фосфоглив" при применении их в двойной терапевтической дозе.
Так как препарат "Фосфоглив" лиофилизат имеет значительные отличия в фармакокинетике, эндотелиопротективные свойства этого препарата изучались в более низкой дозе (по содержанию фосфатидилхолина). В соответствии с данными литературы (Kato Т., 2008) была выбрана наиболее оптимальная доза препарата "Фосфоглив" лиофилизат, достаточная для достижения необходимой концентрации действующих компонентов в крови и обеспечивающая наиболее оптимальное эндотелиопротективное действие. Доза препарата "Фосфоглив" в форме лиофилизата с учетом высокой биодоступности была снижена в десять раз по сравнению с дозой препарата "Фосфоглив" в форме капсул (по содержанию фосфатидилхолина). Липоид С80 и глицират вводились в эквивалентных дозах. Расчет дозы для введения крысам производился с помощью коэффициента межвидового пересчета доз Улановой.
Действие препарата "Фосфоглив" оценивали при метионин-индуцированной эндотелиальной дисфункции. "Фосфоглив" (капсулы) в дозе 2,2 г/кг вводили внутрижелудочно в течение 7 суток, "Фосфоглив" (лиофилизат) в дозе 0,5 мл/кг вводили внутрибрюшинно однократно на фоне введения метионина в течение 7 суток.
Исследование эндотелиопротективной активности компонентов препарата "Фосфоглив" (глицират и липоид) проводилось с использованием L-NAME-индуцированной модели эндотелиальной дисфункции, так как данная модель является более универсальной.
На фоне введения L-NAME различные группы животных получали "Фосфоглив" (капсулы) в дозе 2,2 г/кг, и входящие в его состав глицират в дозе 0,2 г/кг, липоид С80 в дозе 0,3 г/кг внутрижелудочно 1 раз в сутки в течение 7 суток, "Фосфоглив" (лиофилизат) в дозе 0,5 мл/кг внутрибрюшинно 1 раз в сутки в течение 7 суток.
Статистическая обработка результатов исследования.
Результаты подвергали статистической обработке путем расчета средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (±т) и вероятности возможной ошибки (Р) по таблицам Стьюдента. Различия оценивали как достоверные, начиная с р<0,05.
