Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Характеристика липосомальных препаратов 12
1.1.1. Липосомы 12
1.1.2. Строение липосом 13
1.1.3 Свойства липосом 15
1.1.4. Преимущества липосом для применения в медицине 20
1.1.5. Методы получения липосом 21
1.1.6. Способы приготовления липосом 22
1.1.7. Стабильность липосом 25
1.1.8. Контроль качества липосомальных препаратов 26
1.2. Препараты из класса N-алкил-N-нитрозомочевины 30
1.2.1. Метилнитрозомочевина 30
1.2.2.Зарубежные противоопухолевые препараты на основе нитрозоалкимочевины 31
1.2.3.Отечественные противоопухолевые препараты из класса нитрозоалкимочевины 34
Заключение 38
Экспериментальная часть 40
Глава 2. Материалы и методы исследований 40
2.1. Материалы и Оборудование 40
2.2. Методы исследований 47
2.2.1. Методика получения многослойных OR-2011 47
2.2.2. Методика получения малых однослойных липосом OR-2011 47
2.2.3. Методика сублимационной сушки липосомальной дисперсии OR-2011 48
2.3.Химико-фармацевтические методы, используемые при разработке ипосомальных лекарственных форм OR-2011 48
2.3.1. Метод лазерной спектроскопии для определения размеров липосом OR-2011 48
2.3.2. Определение включившегося и невключившегося в липосомы OR-2011 51
2.3.3.Определение эффективности включения OR-2011 в «свежеприготовленных» липосомах 52
2.3.4.Определение перекисного окисления липидов в липосомальной лекарственной форме OR-2011 54
2.4. Изучение противоопухолевой активности липосомальных лекарственных форм OR-2011 55
2.4.1 Изучение активности липосомальных лекарственных форм OR-2011 в опытах in vitro 55
2.4.2. Изучение противоопухолевой активности липосомальной лекарственной формы OR-2011 в опытах in vivо 57
Глава 3. Обоснование и разработка липосомальной формы OR-2011 и изучение ее биофармацевтических характеристик 58
3.1. Разработка состава и технологии получения многослойных стерически стабилизованных липосом OR-2011 58
3.1.1.Получение многослойных липосом OR-2011 60
3.1.2. Получение малых однослойных липосом OR-2011 61
3.1.3. Количественное определение OR-2011 в липосомальной форме 62
3.1.4. Количественное определение OR-2011 в липосомах после лиофилизации .67
3.1.5. Определение эффективности включения OR-2011 68
3.2. Химико-фармацевтический анализ липосом OR-2011 70
3.2.1. Стандартизация малых однослойных липосом OR-2011 по размеру и внешнему виду 70
3.2.2. Определение содержания OR-2011 в липосомальной лекарственной форме.71
3.2.3. Определение эффективности включения OR-2011 в липосомы 72
3.2.4. Разработка технологии лиофилизации липосомальной дисперсии OR-2011..73
3.2.5. Стандартизация липосом OR-2011 после лиофилизации 77
3.2.5.1. Определение содержания OR-2011 в липосомальной лекарственной форме после лиофилизации 79
3.2.5.2. Определение эффективности включения OR-2011 в липосомы после лиофилизации 80
Глава 4. Разработка методики тонкослойной хроматографии и изучение стабильности лиофилизированной липосомальной лекарственной формы OR-2011 в процессе хранения 81
4.1. Тонкослойная хромотография действующего вещества и вспомогательных веществ, входящих в состав в липосомальной лекарственной форме 82
4.2. Изучение стабильности лиофилизированной липосомальной лекарственной формы OR-2011 при хранении 87
4.3. Изучение перекисного окисления липидов липосомальной формы OR-2011...89
Заключение 90
Глава 5. Изучение цитотоксической активности и противоопухолевого действия лиофилизированной липосомальной лекарственной формы OR-2011
5.1. Изучение активности липосомальной лекарственной формы OR-2011 в опытах in vitro 91
5.2. Изучение противоопухолевого действия липосомальной лекарственной формы OR- 2011 в опытах in vivo .95
Общие выводы 100
Список литературы
- Преимущества липосом для применения в медицине
- Методика получения малых однослойных липосом OR-2011
- Получение малых однослойных липосом OR-2011
- Изучение стабильности лиофилизированной липосомальной лекарственной формы OR-2011 при хранении
Преимущества липосом для применения в медицине
Липосомы обладают огромным количеством преимуществ по сравнению с другими лекарственными формами. Наиболее значимые из них:
1. способность доставки лекарственных препаратов внутрь клеток. На рисунке 3 представлены возможные варианты взаимодействия липосом с клетками. Формы взаимодействия могут быть самыми разными. Наиболее простая: липосомы адсорбируются (прикрепляются) на поверхности клетки. Процесс на этом может закончиться, а может пойти дальше: при определенных условиях клетка может поглотить липосому, и тогда вместе с ней внутрь клетки попадают вещества, находящиеся внутри липосомы и могут слиться с мембранами клеток и стать их частью. При этом свойства клеточных мембран могут изменяться: например, их вязкость и проницаемость, величина электрического заряда. Может также увеличиваться или уменьшаться количество каналов, проходящих через мембраны. Таким образом, благодаря липосомам появился новый способ направленного воздействия на клетку, который называется мембранной инженерией.
Способы проникновения содержимого липосом в клетку: I-увеличение проницаемости мембран образованием дополнительных каналов (облегченная диффузия); II-прикрепление к мембране (адсорбция); III –поглощение липосомы клеткой (эндоцитоз) и попадание лекарственного вещества, принесенного липосомой, непосредственнов клетку; IV- обмен липидами между клеточной мембраной и липосомой;V-слияние мембран клетки и липосомы.
2. Биосовместимость: сродство с мембранами клеток по химическому составу. С точки зрения биологической совместимости липосомы идеальны как переносчики лекарственных препаратов, так как их мембрана состоит из природных фосфолипидов, составляющих от 20 до 80 % их массы.
3. Отсутствие аллергических реакций: липосомы, лишенные свойств антигена, надежно укрывают свой груз от контакта с иммунной системой и, соответственно, не вызывают антигенной стимуляции.
4. Защита лекарственного препарата от деградации в организме. Как уже отмечалось, липосомы выступают в качестве своеобразного контейнера, надежно защищая свое содержимое от повреждающего воздействия внешних факторов, в частности от разрушения в желудочно-кишечном тракте, что обеспечивает доставку препарата к месту назначения и продление времени его действия. Как оказалось, липосомы обладают уникальной способностью изменять свою форму и размер в зависимости от окружающей среды. Пластичные мембранные сферы, имеющие микроскопические размеры, легко проникают в межклеточные промежутки. Свойства липосом и их поведение определяются, прежде всего, наличием у них замкнутой мембранной оболочки. Несмотря на молекулярную толщину около 4 нм, липидный бислой отличается исключительной механической прочностью и гибкостью. В жидкокристаллическом состоянии бислоя его компоненты обладают высокой молекулярной подвижностью, так что в целом мембрана ведет себя как достаточно жидкая, текучая фаза, в которой происходит броуновское движение молекул липидов. Благодаря этому липосомы сохраняют целостность при различных повреждающих воздействиях, а их мембрана обладает способностью к самозалечиванию возникающих в ней структурных дефектов. Вместе с тем гибкость бислоя и его текучесть придают липосомам высокую пластичность. Так, липосомы меняют размеры и форму в ответ на изменение осмотической концентрации внешнего водного раствора. При сильном осмотическом стрессе целостность бислоя может нарушиться и липосомы могут раздробиться на частицы меньшего размера.
5. Повышение фармакокинетики препаратов и их терапевтической эффективности. Это свойство напрямую связано с предыдущим. Известно, что во многих случаях лекарственный препарат при введении в организм может быстро терять активность под действием инактивирующих агентов. Включение таких препаратов в липосомы значительно повышает их терапевтическую эффективность, поскольку, с одной стороны, препарат, находящийся в липосоме, защищен ее мембраной от воздействия неблагоприятных факторов, в том числе ферментов, что увеличивает эффективность препаратов, подверженных биодеструкции в биологических жидкостях, а с другой — та же мембрана не позволяет токсичному препарату превысить допустимую концентрацию в биологических жидкостях организма. Липосома в данном случае играет роль хранилища, из которого препарат высвобождается постепенно, в нужных дозах и в течение требуемого промежутка времени.
Методика получения малых однослойных липосом OR-2011
Принципом работы сублимационной сушки является разность давлений паров растворителя над объектом и в окружающей его газовой атмосфере, При достаточно низких температурах возможно проведение сублимационной сушки и при атмосферном давлении, однако скорость такого процесса весьма невелика.
Установка состоит из следующих базовых частей: сублиматор, десублиматор (вертикальный), вакуумный насос (вакуумная станция), холодильная установка и приборы. Внутри сублиматора помещен блок стандартных полок (двухъярусный). Температура полки управляется отдельными электронными регуляторами температуры. pH-метр HANNA pH 211 (Hanna Instruments, Германия) предназначен для измерения активности ионов водорода (pH), ЭДС электродных систем, окислительно-восстановительного потенциала (Eh) и температуры различных водных сред.
Система очистки воды Elix (Millipore S.A.S., Франция). Производительность – 5 л/час (± 15 % при 7C T 30 C). Объединяет несколько технологий очистки воды. По международной классификации (стандарты CAP, CLSI и ISO 3696/BS 3997) вода, произведенная системой, относится к типу II (вода аналитической степени чистоты). Весы Adventurer Pro- AV264 C (Ohaus, США) - аналитические весы
Точные навески липидов ФХ, Хол , ДСФЭ-ПЭГ-2000 переносятся в колбу вместимостью 150 мл и растворяются в 8 мл хлороформа. Раствор упаривают на роторном испарителе при температуре 35 ± 2С и под вакуумом 24 мм рт.ст. до образования пленки на стенках колбы и сушат в течение 40 мин под вакуумом. Отдельно берут навеску субстанции OR-2011 и растворяют в 10 мл 0,9 % раствора натрия хлорида. С помощью этого раствора смывают липидную пленку со стенок колбы.
Так как липосомальные дисперсии представляют собой весьма благоприятную среду для размножения бактерий для преодоления микробной контаминации необходимо соблюдать жесткие требования по стерильности. Существуют разные методы стерилизации липосом, в данной работе использовали метод стерилизации липосомальных дисперсий – это метод мембранной фильтрации [69, 71, 72, 73].
Методика получения малых однослойных липосом OR-2011 10 мл дисперсии многослойных липосом OR-2011, полученной на роторном испарителе пропускают через мембранные фильтры фирмы “Nucleopor" с уменьшающимся размером пор (0,4; 0,2; 0,1 мкм) и экструдируют в среднем от 7 до 11 раз с помощью ручного мини-экструдера (Avanti Polar Lipids) и получают малые однослойные липосомы. [75, 77]. Полученную липосомальную дисперсию разбавляют буфером до создания pH=7,0 и добавляют криопротектор – 4% раствор сахарозы. Далее полученные дисперсии разливают в стеклянные флаконы емкостью 10 мл. После этого липосомальную лекарственную форму лиофилизируют. 2.2.3. Методика сублимационной сушки липосомальной дисперсии OR-2011
Липосомальную дисперсию OR-2011 дозируют по 2 мл во флаконы вместимостью 10 мл и помещают для замораживания в морозильную камеру с температурой внешней среды быстрого замораживания – 80С. Замороженный препарат выдерживают в течение 5 часов, после этого переносят на полку лиофильной сушки и выдерживают сначала при температуре – 50C в течение 30 мин. Далее повышают температуру от – 50С до –10С под давлением 0,525 мБар на 3 ч, после этого еще повышают температуру до – 5С и оставляют на 1 ч, потом опять повышают температуру уже до 0С и выдерживают еще 1 ч. Далее повышают температуру до +20 С под давлением 0,852 мБар и оставляют на 17 ч досушиваться в лиофильной сушке. После этого вынимают флаконы, закрывают их пробками и ставят на хранение в морозильную камеру при температуре –18 С. Общее время сушки препарата составляет 22-23 часа.
Размер липосом определяли на спектрофотометре "Наносайзер" (Submicron Particale Sizer Nicomp 380, США). Метод заключается в измерении среднего размера липосом в проходящем лазерном луче. Принцип работа прибора
Излучаемый свет от лазера в наносайзере фиксируется внутри кюветы с определенной частотой около 1015 Гц. При встрече с частицей, это поле заставляет все свободные электроны колебаться с той же частотой. Все эти волны перемешиваются, или интерферируют на удаленном участке передней поверхности детектирующего фотоумножителя, измеряющего результирующую интенсивность света под определенным углом рассеяния (90 для Nicomp 380). Размер липосом зависит от метода их получения, липидного состава и химической природы инкапсулируемого ЛВ [27, 51, 189].
Под фиксированным углом определяется отраженный свет от ансамбля частиц, суспендированных в растворителе. Интенствность этого света колеблется во времени благодаря диффузии частиц. Эти частицы движутся или диффундируют в случайном порядке в результате процесса, известного как броуновское движение, вызванного столкновениями соседних молекул растворителя. Концентрацию везикул подбирают таким образом, чтобы частота импульсов, поступающих на фотоэлектронный умножитель, составляла 200-600 кГц. Малые частицы относительно быстро перемещаются в растворе, давая быстро флуктуирующий сигнал интенсивности света, а большие частицы диффундируют медленнее и дают медленно меняющуюся интенсивность света. Существует четко определяемое характеристическое время жизни этих колебаний, которое обратно пропорционально диффузивности частиц. Коэффициент диффузии частиц (D) определяется, исходя из константы времени затухания т. Наконец, с помощью уравнения Стокса-Эйнштейна рассчитывается радиус частиц (R): D = k/6- ]-R где к - постоянная Больцмана (1,38 10–16 эрг K–1), Т - абсолютная температура (К = С + 273), г\ - вязкость растворителя (г\ = 1,002 10–2 пуаз для воды при 20 C). Таким образом, скорость перемещения частиц суспензии, определяемая коэффициентом диффузии, обратно пропорциональна радиусу частиц.
Получение малых однослойных липосом OR-2011
В соответствии с действующей в РФ нормативной документацией не требуется количественного определения вспомогательных веществ, входящих в ЛФ, однако желательно показать их присутствие. Для этой цели предлагаем также использовать метод ТСХ.
Лецитин. Содержимое флакона растворяют в 2 мл воды, переносят в мерную колбу на 50 мл и доводят до метки хлороформом. На линию старта хроматографической пластинки Сорбфил или аналогичного качества размером 10х15 см наносят 5 мкл (14 мкг) испытуемого раствора и 5 мкл (14 мкг) 0,28 % раствора лецитина. Пластинку с нанесенными пробами подсушивают на воздухе в течение 5 мин, помещают в хроматографическую камеру со смесью растворителей хлороформ – спирт метиловый – вода – аммиак водный (45:27:2,8:2,8) и хроматографируют восходящим способом. Когда расстояние старт – фронт достигнет 12 см, пластинку вынимают из камеры и подсушивают на воздухе до полного исчезновения запаха растворителей. Помещают пластинку в йодную камеру. При проявлении парами йода на хроматограмме в пробе испытуемого раствора наблюдают пятно желтого цвета по положению и интенсивности окрашивания соответствующее пятну СОВС-2.
Сахароза. Содержимое флакона растворяют в 10 мл воды, переносят в мерную колбу на 25 мл и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 95 %. На линию старта хроматографической пластинки Сорбфил или аналогичного качества размером 10х15 см наносят 5 мкл (16 мкг) испытуемого раствора и 5 мкл (16 мкг) 0,32 % раствора сахарозы (СОВС-3). Пластину с нанесенными пробами выдерживают на воздухе в течение 15-20 мин, затем помещают в камеру со смесью растворителей спирт изопропиловый – ацетон – эфир – вода (35 : 35 : 10 : 20) и хроматографируют восходящим способом. Когда расстояние старт – фронт достигнет 12 см, пластинку вынимают из камеры и выдерживают на воздухе в течение 10-15 мин и опрыскивают раствором 1-нафтола в смеси 95 % этилового спирта и серной кислоты концентрированной. Далее хроматограмму высушивают при температуре 130 ± 2 C в течение 3-5 мин. В пробе испытуемого раствора наблюдают пятно фиолетового цвета по положению и интенсивности окрашивания соответствующее пятну СОВС-3. Раствор должен быть свежеприготовленным.
Холестерин. К содержимому флакона добавляют 5 мл хлороформа. На линию старта хроматографической пластинки Сорбфил или аналогичного качества размером 15х10 см наносят 20 мкл (120 мкг) испытуемого раствора и 20 мкл (120 мкг) 0,6 % раствора холестерина (СОВС-4). Пластинку с нанесенными пробами подсушивают на воздухе в течение 5 мин, помещают в хроматографическую камеру со смесью растворителей хлороформ – спирт метиловый – аммиак водный (88:1:1) и хроматографируют восходящим способом. Когда расстояние старт – фронт достигнет 12 см, пластинку вынимают из камеры и подсушивают на воздухе до полного исчезновения запаха растворителей.
Помещают пластинку в йодную камеру, насыщенную парами йода. На хроматограмме в пробе испытуемого раствора наблюдают пятно зеленого цвета по положению и интенсивности окрашивания соответствующее пятну СОВС-4.
Результаты испытания считаются достоверными, если на хроматограмме видно пятно 0,01 % (0,5 мкг) раствора РСО. Примечание. 1. Приготовление 0,28 % раствора лецитина в хлороформе (СОВС-2). 140 мг лецитина помещают мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора хлороформом до метки. 2. Подготовка йодной камеры. 1 г йода помещают на дно камеры и прибавляют 7 мл эфира.
Приготовление 0,32 % раствора сахарозы (СОВС-3). 80 мг сахарозы растворяют в 10 мл, воды переносят в мерную колбу на 25 мл и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 95 %.
Приготовление раствора 1-нафтола в смеси 95 % этилового спирта и серной кислоты. 250 мг 1-нафтола растворяют в 25 мл смеси спирта этилового 95 % и кислоты серной концентрированной (19:1), переносят в мерную колбу 50 мл и доводят до метки тем же растворителем.
Результаты определения стабильности лиофилизированной лекарственной формы OR-2011 представлены в таблице 9. Из данных таблицы видно, что при хранении лекарственной формы 4 серий в течение срока хранения в указанных выше условиях существенных изменений качества препарата не наблюдалось.
В отчетный период проведен химико-фармацевтический анализ ЛЛЛФ четырех серий препаратов, заложенных на хранение для определения срока годности. Препарат хранили в сухом, защищенном от света месте при температуре –18 0С. Анализ серий ЛЛЛФ проводили по основным показателям: описание, рН, размер липосомальных везикул, потеря в массе при высушивании, количественное определение в ЛЛЛФ. Результаты анализа представлены в таблице 9.
Разработана методика ТСХ – подтверждение компонентного состава ЛЛЛФ и спектрофотометрия – соответствие электронного спектра ЛЛЛФ спектру субстанции, и количественного анализа спектрофотометрии при 229±2 нм.
Изучали при хранении на четырех сериях по параметрам качества: описание, растворимость, подлинность, средняя масса во флаконе, размер везикул, значение pH, потеря в массе при высушивании, количественное определение и эффективность включения. Разработаны проекты ФСП на ЛП «OR-2011 липосомальный лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 40 мг» согласно требованиям ГФ XII и ОСТ 91500.05.001-00 к препаратам для инъекций. Исследуется продолжительность хранения серий ЛЛЛФ при температуре -18 C для установления максимального срока годности.
Цитотоксическую активность ЛЛЛФ OR-2011 изучали в опытах in vitro на клеточных линиях меланомы кожи человека: Mel Ibr и Mel Kor. в лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН. Исследование проводили с использованием МТТ-теста. Изучение цитотоксической активности ЛЛЛФ OR-2011 проводили в сравнении с субстанцией этого препарата. В эксперименте изучали активность ЛЛЛФ и субстанции в концентрациях: 0,015, 0,031, 0,062, 0,125, 0,25, 0,5 и 1 мг/мл. Гибель клеток определяли после инкубации клеток с препаратами в течение 24, 48 и 72 ч. Каждый опыт повторяли 5 раз. Результаты опытов представлены на рисунках 26, 27, 28, 29, 30 и 31.
На рисунке 26 представлены результаты цитотоксического действия субстанции OR-2011 и ЛЛЛФ OR-2011 на клетки линии Mel Ibr после инкубации в течение 24 ч. IC50 для ЛЛЛФ OR-2011 было достигнуто в концентрации 0,1 мг/мл, а для субстанции 0,2 мг/мл. На пустых липосомах эффекта не было. Таким образом, ЛЛЛФ OR-2011 оказывала более сильный цитотоксический эффект чем субстанция этого препарата. Аналогичный эффект проявился и через 48 ч инкубации (Рис. 27). После инкубации клеток с препаратами в течение 72 ч было обнаружено, что IC50 для ЛЛЛФ OR-2011 составило 0,08 мг/мл, а для субстанции – 0,2 мг/мл. Для пустые липосомы не появлялся не какого эффекта. (Рис.28).
Из этих рисунков видно, что при всех использованных концентрациях препаратов цитотоксическое действие ЛЛЛФ OR-2011 было более эффективное. Из этого можно сделать заключение, ЛЛЛФ OR-2011 по своей эффективности превосходит субстанцию этого препарата.
Изучение стабильности лиофилизированной липосомальной лекарственной формы OR-2011 при хранении
Цитотоксическую активность ЛЛЛФ OR-2011 изучали в опытах in vitro на клеточных линиях меланомы кожи человека: Mel Ibr и Mel Kor. в лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН. Исследование проводили с использованием МТТ-теста. Изучение цитотоксической активности ЛЛЛФ OR-2011 проводили в сравнении с субстанцией этого препарата. В эксперименте изучали активность ЛЛЛФ и субстанции в концентрациях: 0,015, 0,031, 0,062, 0,125, 0,25, 0,5 и 1 мг/мл. Гибель клеток определяли после инкубации клеток с препаратами в течение 24, 48 и 72 ч. Каждый опыт повторяли 5 раз. Результаты опытов представлены на рисунках 26, 27, 28, 29, 30 и 31.
На рисунке 26 представлены результаты цитотоксического действия субстанции OR-2011 и ЛЛЛФ OR-2011 на клетки линии Mel Ibr после инкубации в течение 24 ч. IC50 для ЛЛЛФ OR-2011 было достигнуто в концентрации 0,1 мг/мл, а для субстанции 0,2 мг/мл. На пустых липосомах эффекта не было. Таким образом, ЛЛЛФ OR-2011 оказывала более сильный цитотоксический эффект чем субстанция этого препарата. Аналогичный эффект проявился и через 48 ч инкубации (Рис. 27). После инкубации клеток с препаратами в течение 72 ч было обнаружено, что IC50 для ЛЛЛФ OR-2011 составило 0,08 мг/мл, а для субстанции – 0,2 мг/мл. Для пустые липосомы не появлялся не какого эффекта. (Рис.28).
Из этих рисунков видно, что при всех использованных концентрациях препаратов цитотоксическое действие ЛЛЛФ OR-2011 было более эффективное. Из этого можно сделать заключение, ЛЛЛФ OR-2011 по своей эффективности превосходит субстанцию этого
Изучение цитотоксической активности ЛЛЛФ OR- 2011проводили также на меланомных клетках Mel Kor . В эксперименте изучали активность ЛЛЛФ и субстанции в концентрациях: 0,015, 0,031, 0,062, 0,125, 0,25, 0,5 и 1 мг/мл. Кривые цитотоксичности, полученные на линии Mel Kor , были схожими с кривыми цитотоксичности, полученными на линии Mel Ibr. ЛЛЛФ OR-2011 была более активна по сравнению с субстанцией. После инкубации клеток с препаратом в течение 24 ч IC50 для ЛЛЛФ OR-2011 было 0,125 мг/мл, а для субстанции препарата 0,2 мг/мл. Для пустых липосом не было эффекта. (рис. 29)
Цитотоксический эффект субстанции и ЛЛЛФ OR-2011 и пустых липосом на клетки Mel Kor в опытах in vitro, время инкубации 48 ч. IC50 для ЛЛЛФ OR-2011 после инкубации с клетками Mel Kor в течение 48 ч составило 0,08 мг/мл, а для субстанции 0,150 мг/мл. Для пустые липосомы не появлялся не какого эффекта. (Рис. 30).
Цитотоксический эффект субстанции и ЛЛЛФ OR-2011 на клетки Mel Kor в опытах in vitro, время инкубации 72 ч
После инкубации клеток в течение 72 ч составило 0,02 мг/мл для ЛЛЛФ OR-2011 и для субстанция около 0,03 мг/мл а для пустых липосом не появлялся не какого эффекта (Рис.31). Таким образом, исследование цитотоксической активности ЛЛЛФ OR-2011 показало, что препарат более эффективно убивает опухолевые клетки пор сравнению с субстанцией. Изучение противоопухолевого действия липосомальной лекарственной формы OR- 2011 в опытах in vivo:
Противоопухолевую активность ЛЛЛФ OR-2011 изучали в опытах in vivo на мышах в лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН. Для изучения противоопухолевой активности ЛЛЛФ OR-2011 использовали карциному легкого Льюис, растущую подкожно у мышей у мышей BDF1 (C57Bl/6 x DBA/2). Субстанцию OR-2011 и ЛЛЛФ OR-2011 вводили мышам внутривенно, однократно на 2 сутки после перевивки опухоли в дозах 150, 200 и 300 мг/кг. Оценивали средний объем опухоли, торможение роста опухоли, средню продолжительность жизни мышей с опухолью и удлинение продолжительности жизни. Размер опухоли начинали определять с 8 дня после перевивки опухоли. В контрольной интактной группе опухоль экспотенциально росла, достигая к 40 дню наблюдения 18283,3+/- 3419 мм3. (Таблица 11, рисунок 32). Средняя продолжительность жизни (СПЖ) в контрольной группе составила 39,6+/-2,8 дней. Субстанция OR-2011 в дозе 150 мг/кг немного замедляла рост опухоли. Опухолевый узел стал определяться на 12 сутки после инокуляции опухолевых клеток. УПЖ бало 8 %, а СПЖ – 42,6+/-3,5 дня. Увеличение дозы субстанции до 200 мг/кг усилила противоопухолевое действие препарата. Опухолевые узла у всех мышей появились ч 23 дню после перевивки. СПЖ в этой группе составило 40,9_/-7,3 дня, а УПЖ – 26 дней. Ни одна мышь не погибла от токсиеских проявлений. Похожие результаты были получены при введении ЛЛЛФ OR-2011 в дозе 200 мг/кг. Опухоли возникли у всех мышей на 23 сутки после перевивки, СПЖ – 45,7+/-3,9 дней, а УПЖ – 15 %. Различия между группами статистически не знасимы. Токсических проявлений не вывлено. Результаты от дозы субстанции OR-2011 300 мг/кг отличались от предыдущих. Торможение роста опухоли было более выражено. Однако, СПЖ была ниже контроля, а УПЖ – с отрицательными значениями (Табл.11). ЛЛЛФ OR-2011 в дозе 300 мг/кг показало аналогичные значения. Влияние OR-2011 на рост подкожно привитой карциномы лёгкого Льюис /LLC/ у мышей BDF1
В графах указано:Торможение роста опухоли в % (в группе Контроль - указаны средние объёмы опухолей (в мм3) на данные сутки опыта); в ( ) - количество мышей с опухолью / количество мышей в группе на данные сутки опыта; в [ ] -суммарное количество мышей павших от токсичности к данным суткам опыта / исходное количество мышей в группе. знак « - » обозначает, что в данных группах из-за высокой гибели мышей-опухоленосителей от токсического действия OR-2011 указан % уменьшения (а не увеличения) продолжительности жизни леченных животных по сравнению с контрольной (не леченной) группой. Проценты гибели мышей от токсичности OR-2011 в виде субстанции и в виде ЛЛЛФ были сходными (14-40% на 8 сутки опыта, и 71 – 86% на 23 сутки опыта, соответственно). (Табл. 11).
Таким образом, OR-2011 в виде субстанции, введенный мышам терапевтических групп внутривенно, однократно на 2 сутки опыта в дозах 150 -200 мг/кг дозозависимо значительно ( на 53-100%) и продолжительно (до 23- 40 суток опыта, соответственно) ингибировал рост подкожных опухолевых узлов. (Табл.11 и Рис.32). ЛЛЛФ OR-2011, введенная мышам внутривенно, однократно на 2 сутки опыта в дозе 200 мг/кг дозозависимо значительно (на 74-100%) и продолжительно (до 30 суток опыта) ингибировала рост подкожных опухолевых узлов. (Табл. 11 и Рис.32).
Кроме того, OR-2011 как в виде субстанции так и в виде ЛЛЛФ в использованных дозах (150- 200 мг/кг) и режиме введения (однократно, внутривенно) вызывал у леченных мышей значительное (до 12- 16 дней) удлинение латентного периода (времени до появления видимых подкожных опухолевых узлов) развития опухоли LLC. (Табл. 11 и Рис.32) И если в контрольной группе опухоли возникали у всех животных практически одновременно, то у мышей, леченных OR-2011 (и субстанцией и ЛЛЛФ) наблюдались значительные вариации в длительности латентного периода. (Табл. 11.)
При этом профили кинетических кривых роста подкожных опухолевых узлов у леченных OR-2011 мышей был сходен с таковыми в контрольной группе. ( Рис.32) .
OR-2011 как в виде субстанции так и в виде ЛЛЛФ в использованных дозах (150- 200 мг/кг) и режиме введения (однократно, внутривенно) не увеличивал продолжительность жизни леченных мышей с LLC. (Табл. 11).
