Введение к работе
; .
-М''-mv'i Актуальность проблемы. Участие ДНК-содержащих онкогенных ви--^--русав в образовании опухолей у животных и j» трансформации первичных культур убедительно доказано на разных экспериментальных но-делях. Также имеется достаточно данных в пользу того, что некоторые из них, такие как вирус герпеса П типа, вирус папилломы, вирус гепатита В, являются кофакторами в этиологии злокачественных новообразований человека (Epeteia М,А.,1987{ Ostrow E.S., 1987).
Исследования в современной молекулярной биологии и генной инженерии дали возможность идентифицировать вирусные гены и их продукты, ответственные за трансформации и туморогенез. На модели вирусного онкогенеза с использованием как РНК-содеркащих, так и ДНК-содержащих вирусов, благодаря возможности манипулировать отдеяышми вирусными генами, были изучены функции белков - продуктов этих генов, что внесло некоторую ясность во взаимоотношениях вирусов и клеток-мишеней.
В настоящее время механизм трансформации и опухолеобразова-иия рассматривается как многоступенчатый процесс, в котором участвуют и клеточные, и вирусные гены. На различных экспериментальных вирусных моделях показано, что для приобретения клетками трансформированного фенотипа в культуре требуется как минимум два этапа: I ахал - приобретение клетками свойств имиортализации (способности к бессмертии, что обеспечивает им неограниченное число делений), О этап - приобретение клетками свойств трансформированных.. В трансфориированных клетках появляются н^ые фено-тнпические признаки: независимость от сывороточных ростовых факторов морфологические изменения» способность делиться без -ри-крепления к подложке, экспрессия эмбриональных антигенов и опу-ходеспецифических трансплантационных антигенов, низкую организации цитоскелета, опуходеродность для животных и другие. Все выыё перечисленные признаки грансформированных в культуре клеток свойственны и опухолевый кдеткаи, образующимся в организме.
Были идентифицированы группы клеточных генов, называете протоонкогенами, экспрессирующиеся при онкогенезе и экспериментально продемонстрировано их участие в имиортализации и трансфор-
нации стабильных клеточных линий. Груши клеточных протооккоге-нов является аналогами ретровирусаых генов, участвующих в трансформации. К группе шшорталиэуюцих клеточных генов относятся про-тоонкогены шус и шуъ и их аналоги ре-сровирусные вус и шуъ. Например, клеточный онкоген шус наиболеэ сильно эксдреосирован во. иногих В-клеточных лимфоиах человека, в той числе и в димфоив Беркита (Kleia g. et al., 1985). К группе трансформирующих генов относятся клеточные онкогены группы гае. Гены 8хой группы были выделены из иногих опухолей человека, в той числе из легких, поджелудочной железы, из карциноиы мочевого пузыря (Bisbop J.и., 1983).
Подобное разделение функций стало известно и для ДНК-оодер-хащих вирусов. Так для аденовирусов четко показана способность раннего гена Е1А иммортализовать первичные клетки, Установлена большая степень гомологии структуры гена Е1А аденовирусов и ге-. нов ретровирусов туе и myb (Ralston Е. et al.,"1983). Функция трансформации кодируется у аденовирусов геном 1В, его продукты определяют и опухолеродноеть трансформированных клеток для грызунов (Van dea Elsen P. et al., 1982$ Bernards R, et al., 1983).
Применяя различные сочетания иммортализующих и трансформирующих генов, полученных как из ДКК-содержачих, так и из РБК-оодер-кащих вирусов, а такае из опухолей человека, исследователи получили доказательства необходимости участия обеих групп генов в получении эффективной трансформации первичной культуры.
Аденовирусы - перспективная модель для изучения особеннрегей трансформирующего действ д днк-сддерхаида' вирусов. Достаточно подробно изучен лишь один онкогениый аденовирус - Ad 12. Что ка-гчется обезьяньего аденовируса SA7, данные о механизмах его трансформирующего'действия скудны, Нежду тем, этот вирус представляет, пожалуй, особый интерес, так как является единственный известным в настоящее время вирусом э;'ОГО семейства, индуцирухщим опухоли у природного вида хозяев.
Использование аденовирусов для иаучения механизмов онкогене-за, с одной стороны, является удобным, так как для них генетически идентифицированы участки ДНК, транскрибируемые с них ыРйК и белки, осуществлявпще и иымортализацию, и трансформацию, кроме того, вирусные гены не имеют аналогов с клеточными генами, как у ретровирусов.-.
С другой стороны, использование аденовирусов для изучения механизмов оюсогенеза мгдруднено из-за множества функциональных активности каждого продукта трансформирующих генов вируса.
Для достижения эффективной трансформации, помимо вирусных генов требуется, по-видимому, определенны.1*-' набор функциональных изменений клетки-мишени. Исследования последних лет показали, что ДКК-содершцие вирусы актиЕйруют те же клеточные гены, что и рет-ровирусы и химические канцерогены, а также индуцируют появление новых ЫРНК (Sohutzbank Т. et al., 1982{ Scott U.RJ). et al», 1983).
Используя ДНК-синтезирующув систему клетки-мишени, аденовирусы после интеграции в геном клетки индуцируют начальные этапы генетических изменений, которые сопровождают конверсию нормальной клетки л трансформированную. Экспрессия вирусных генов на ранних этапах лнфекции приводит к активации генетического аппарата клетки, что, по-видимому, является важнейшим условием для обеспечения возможности дальнейших эпигеноиных изменений) позволяющих клетке проходить все ступени трансформации и поддерживать трансформированной фенотип.
Изменения функций генетического аппарата трансформированных клеток являются объектом исследования как в эксперименте, так и в опухолях человека. В настоящее время получено много данных, указыьаюцих на большое сходство начальных этапов развития опухоли в организме и при трансформации клеток in vitro, что наводит на мысль об универсальности механизма'онкогенеза.
Большинство работ данного направления в экспери^-нте выполнены на стабильно трансформированных клеточных линиях и не дают представления о ранних событиях взаимодействия вируса с непер-миссив'ной клеткой.
Цель работы; изучение экспрессии аденовирусных ДНК, соответствующих областям 1А и Е1В, на ранних сроках после инфекции ^р-вичвых культур эмбриональных клеток мыши аденовирусом обезьян SA7<.'C8) и сопутствующих изменений прблиферативного статуса и макромолекулярных синтезов в клетках-мишенях.
Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи: '1, Изучить возможности оценки реакции клеток на вирусное заражение в условиях культивирования в среде без сывороточных фак-' торов.
_ 4 -
-
Оценить спектр мРНК, соответствующих ранний генам Е1І к Е1Б. .'-,.
-
Долучить данные о параметрах клеточной пролиферации в . культурах при лишении их сыворотки и после заражения вирусом
А7(С8).
-
Исследовать реакцию хроматина клеток на заражение опухо-леродныц вирусом s&7(C8).
-
изучить реакцию нукдеолярного аппарата клетки и активность рибосомных генов в ответ на вирусное воздействие.
Научная новизна.
-
В работе представлена новая научная информация об экспрессии на уровне мРНК аденовирусных ДНК, соответствующих областях Е1А и Е1В аденовируса SA7 в первичных недермисснвных клетках. Показано, что экспрессия этих мРНК резко нарастает на протяжении первых 48 часов после адсорбции варуса.
-
Показано митогенное действие вируса в культурах, содержащихся в условиях полного отсутствия сыворотки в течение нескольких суток.
-
Установлено, что вступление клеток ИЗ СОСТОЯНИЙ покоя в митотичеокий цикл под действием вируса сопровождается необычной реакцией хроматина - повышением степени его компактности.
-
Получены доказательства активации рибосомных генов клетки непосредственно после заражения культури вирусом»
-
Выявлены количественные морфологические изменения нуклео-дярного аппарата клеток мишеней в ответ на вирусную инфекцию.
Теоретическая и практическая ?на,чимдахь рафщ» Установлены закономерности ранних этапов аденовирусного онкогенеза, хронолога экспрессии матричных РНК вируса, ответственных за опухолевую трансформацию кветок-миаевей. Получены уникальные факты о функционировании генома клеток на уровне синтеза макромолекул в условиях воздействия оя.чхолеродного аденовируса, позволяющие лучше понять механизмы феномена опухолевой «рансфор-мации.-
Разработана экспериментальная моделі для изучения взаимодействия вирус-клетка в уодовиях отсутствия воздействия сывороточных факторов. Адаптированы методы современной компьатеркзоваяноа цитологии для изучения пролифератяваого стагуса, структуры хромати-
— э -
на и активности рибоаогиых генов на уровне отдельных клеток. Эти методы могут быть использованы как в эксперименте, так и в клинической практике для оценки эффективности различных воздействий на опухолевые клетки.
Дпробааия диссертации. Диссертация апробирована на объединенной научной конференции экспериментального отдела ЫНИОИ имени П.А.Герцена. Основные материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых 1981 г., на Всесоюзной научной конференции "Структура и функция хроматина", г.Ленинград, 1985} на 3-й Республиканской конференции "Автоматизация цитологических исследований", г.Киев, 1988. , ...
Дхбликации. По материалам диссертации опубликовано 6.научных работ, включая 4 отатьи в центральных журналах.
Объем п структура диссертации. Диссертация состоит из введеная, обзора литературы, глава "Материал и методы", главы "Результаты собственных исследований и их обсуждение", заключения, выводов л указателя литературы. Диссертация изложена на 86 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 таблицами, 15 рисунками. Список литературы содержат 192 источника, ив которых'8 отечественных в 184, иностранных.
Диссертация выполнена в лаборатории вирусологии ИНИИОИ имени П.А.Герцена (руководитель - доктор медицинских наук, профессор А.Й.Агоенко) в соответствии о планом НИР, является фрагментом темы "Опухолевый рост - как механизм иммунологического распознавания своих соботвенных поверхностных эмбриональных антигенов". Фрагмент А. "Исоледованив механизмов оикогенеза". Ота лыше фрагменты работы выполнялись в лабораториях гемоцатологии (руководителе - проф.Г.И.Козинец) и генных диагностикумов (руководитель -к.б.в^Г.Я.Соловьев) Всесоюзного гематологического научного центра МЗ СССР,.
