Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1 Активность теломеразы в различных опухолях 10
1.2 Амплификация генов hTR и hTERT 13
1.3 Регуляция транскрипции TERT 13
1.3.1 Структура промотора обратной транскриптазы теломеразы 14
1.3.2 Метилирование промотора hTERT 15
1.3.3 Метилирование гистонов промотора hTERT 17
1.3.4 Ацетилирование и деацетилирование 17
1.3.5 Каскад МАРК 18
1.3.6 Онкоген Мус и его антипод Mad 18
1.3.7 Транскрипционные факторы Spl и Sp3 19
1.3.8 Ядерный фактор NF-kappaB 21
1.3.9 Транскрипционные факторы API и АР2 22
1.3.10 Онкосупрессор р53 22
1.3.11 Белки pRB, E2F и р16 23
1.3.12 Вс12 25
1.3.13 Онкосупрессор WT1 26
1.3.14 Миелоидный клеточно-специфичный белок MZF-2 26
1.3.15 Транскрипционные факторы ETS 27
1.3.16 Стероидные гормоны 28
1.3.17 Вирусная регуляция экспрессии hTERT 30
1.3.18 Влияние гипоксии на экспрессию hTERT 35
1.4 Посттранскрипционная регуляция hTERT 36
1.4.1 Регуляция сплайсинга гена hTERT 36
1.4.2 Клеточная локализация 38
1.4.3 Фосфорилирование и дефосфорилирование hTERT 39
1.5 Регуляция экспрессии теломеразной РНК 40
1.5.1 Регуляция транскрипции теломеразной РНК 42
1.5.2 Посттранскрипционная регуляция теломеразной РНК 45
1.6 Контроль доступа теломеразы на теломеры 45
1.7 Регуляция в ходе ответа на ионизирующие излучения 48
1.8 Заключение 49
2. Результаты и их обсуждение 50
2.1 Активность теломеразы в раках шейки матки 50
2.1.1 Проверка работы TRAP-теста на клеточных линиях 51
2.1.2 Активность теломеразы в опухолевых образцах 54
2.1.3 Теломеразная активность в образцах условно-нормальных тканей 58
2.2 Активация теломеразы в предраковых поражениях шейки матки 59
2.2.1 Теломеразная активность и экспрессия мРНК hTERT в образцах предраковых поражений 61
2.3 Влияние белка RPA на активность теломеразы 69
2.3.1 Приготовление клеточных экстрактов с пониженным содержанием RPA 70
2.3.2 Теломеразная активность в экстрактах с пониженным содержанием RPA 71
2.3.3 Влияние белка SSB на активность теломеразы 75
2.4 Проверка и адаптация TRAP-теста для скрининга ингибиторов теломеразы 77
3. Материалы и методы 79
3.1 Реактивы 79
3.3 Клинические материалы 79
3.4 Культивирование клеточных линий 80
3.5 Приготовление S30 экстрактов 80
3.6 Приготовление экстрактов из образцов операционных материалов 80
3.7 Приготовление S100 клеточных экстрактов 81
3.8 Обработка экстрактов РНКазой А 81
3.9 Получение и характеристика препарата RPA 82
3.10 Иммунопреципитация RPA 82
3.11 Вестерн-блот-анализ 82
3.12Т11АР-тест 83
3.13 Получение праймера TS, меченного 32Р 84
3.14 Вьщеление РНК из клинических материалов 84
3.15 Агарозный гель-электрофорез РНК 84
3.16 Получение кДНК/Обратная транскрипция 85
3.17 ПЦР 85
Выводы 87
- Амплификация генов hTR и hTERT
- Вирусная регуляция экспрессии hTERT
- Активация теломеразы в предраковых поражениях шейки матки
- Приготовление S100 клеточных экстрактов
Введение к работе
В 1961 году Хайфлик и Мурхиад показали, что культура соматических клеток имеет ограниченный период жизни [1]. В 1973 году Оловников предположил, что укорочение концов хромосом - теломер - определяет возможное число делений клетки [2]. Теломеры защищают геном клетки от деградации, участвуют в мейотическом спаривании хромосом и регуляции транскрипции генов прителомерной области [3, 4]. В клетках, способных размножаться бесконечно (бессмертных), должен существовать механизм, компенсирующий укорочение теломер. В 1985 году Блекберн и Грейберг открыли фермент, удлиняющий теломеры — теломеразу [5].
Теломераза — рибонуклеопротеиновый комплекс, состоящий из молекулы РНК — TR (Telomerase RNA), белка теломеразнои обратной транскриптазы — TERT (Telomerase reverse transcriptase) [6] и ряда ассоциированных белков. TR является матрицей для TERT при удлинении (достраивании, поддержании) теломер с помощью теломеразы. Теломераза в клетках человека существует в виде димера и содержит две субъединицы обратной транскриптазы и две молекулы РНК [7]. В теломеразе человека с TERT связанььр23/р90 -шаперон, отвечающий за сборку/конформацию комплекса; 14-3-3, обеспечивающий ядерную локализацию, ТР1 с неизвестной функцией. С TR связываются белки hGARl, Dyskerin/NAP57, hNHP2, С1/С2, отвечающие за стабильность, созревание и локализацию РНК; La, hStau, вероятно, отвечающие за присоединение к теломерам; L22, участвующий в процессинге, ядерной локализации; hNOPIO, A1/UP1, ТР1 с неизвестными функциями [8]. Ферментативная активность теломеразы человека в лизате ретикулоцитов кролика детектируется при добавлении hTR и hTERT [9, 10]. При введении hTERT в клетки, экспрессирующие hTR, в них появляется теломеразная активность [И, 12]. Заметим, что выполнение теломеразой своих функций in vivo не всегда совпадает с наличием теломеразнои активности, измеренной in vitro с помощью основного используемого в настоящее время метода ее определения - протокола амплификации теломерных повторов (telomerase repeat amplification protocol [13] - TRAP). Например, добавление гемагглютининового эпитопа на С-конец hTERT при сохранении теломеразнои активности препятствует удлинению теломер [14], [15].
Активная теломераза нужна, когда клетки активно делятся. Известно, что суперэкспрессия каждого из белков р53, E2F, р16, р21 и р15 останавливает клеточный цикл, что сопровождается угнетением теломеразнои активности в плоскоклеточных карциномах и клеточных линиях глиомы человека [16, 17]. Ингибирование теломеразы может происходить как вследствие остановки клеточного цикла, так и независимо от его
регуляции в результате действия этих белков. Например, р53 подавляет активность теломеразы за счет снижения уровня экспрессии hTERT до остановки клеточного цикла [8]. В этом случае угнетение активности теломеразы является не следствием остановки клеточного цикла, а независимым процессом.
Лейкоциты человека обладают слабой теломеразной активностью. Эксперименты с остановленными в GO-фазе лейкоцитами и последующим их стимулированием фитогемагглютинином показали, что через 2 дня более 30 % лейкоцитов переходят из G0-фазы в S-фазу. При этом, если в экстрактах необработанных лейкоцитов в GO-фазе теломеразная активность не детектируется, то на первый день обработки фитогемагглютинином появляется слабая теломеразная активность, а на второй день она возрастает более чем десятикратно по сравнению с первым. При этом оказалось, что добавление ингибитора клеточного цикла на стадии перехода в S-фазу не ингибирует теломеразную активность. Следовательно, детектируемая теломеразная активность появляется в лейкоцитах в Gl-фазе (рис. 1) [18]. Является ли активация теломеразы следствием входа клеток в клеточный цикл или независимым процессом точно не известно.
С другой стороны in vivo теломеры реплицируются во время S-фазы (рис.1) [19, 20]. В течение большей части клеточного цикла hTR накапливается в тельцах Кахаля, в S-фазе совмещаясь с теломерами в клетках. hTERT большую часть клеточного цикла находится в очагах, не связанных с нуклеолями, тельцами Кахаля или теломерами. В S-фазе клеточного цикла hTERT перемещается в нуклеоли, затем в тельца Кахаля и затем на теломеры [21,22].
Удлинение теломер
Рис. 1. Схема клеточного цикла. Появление активности теломеразы in vitro происходит в Gl-фазе, а работает она в S-фазе.
Активность теломеразы в зависимости от числа делений хорошо описывается двухшаговой гипотезой клеточного старения и обретения бессмертия (иммортализации) -теорией М1/М2 (рис. 2). В клеточных линиях эпителия теломераза активна и длина теломер поддерживается на постоянном уровне. В стволовых клетках активность теломеразы ниже и позволяет лишь частично компенсировать укорочение теломер. В соматических клетках активность теломеразы отсутствует. Укорочение теломер приводит в момент Ml ~ достижение предела Хайфлика (точка А на рис. 2) — к переходу клеток в состояние сенессенса (старения), которое может быть преодолено инактивацией (удалением) pRB/рІб или р53. Клетки, преодолевшие Ml, продолжают делиться и входят в состояние кризиса М2 (точка Б на рис. 2), сопровождающееся массовой клеточной смертью. Уцелевшие клетки перерождаются в опухолевые. Раковые клетки способны к неограниченному делению и поддержанию длины теломер (как правило с помощью теломеразы). Если экспрессирующие hTR не достигшие момента М2 соматические клетки трансфецировать геном hTERT (точка В на рис.2) в них, как и в опухолях, происходит удлинение и стабилизация теломер [8].
:Эм6рйонапьнь1ё^клётаяны&линйи1
Т^анс^рмйр6ванныё?ИТЕК^ клетки?
Єенессенс; Кризис Чігслрїі^трчньїод
Рис. 2. Зависимость длины теломер г от числа делений в различных типах клеток: эмбриональных клеточных линиях, соматических клетках; и трансфецированных hTERT клетках.. А - достижение клетками лимита Хайфлика, Б - кризис, сопровождающийся гибелью клеток и перерождением уцелевших в: опухолевые, В — трансфекция клеток геном hTERT. '
Следует отметить, что не всегда наблюдается корреляция активности теломеразы и = длины теломер.. Например, при лейкемии; зависимость между длиной- теломер И* активностью-теломеразы отсутствует-.[23];. .
Активность теломеразы не проявляется в соматических клетках и тканях человека за редким исключением. Она есть в некоторых клетках крови; в репродуктивных тканях и некоторых быстро обновляющихся тканях, например, в кишечном эпителии и базальном слое клеток кожи [24]:-Так, стволовые клетки способны.многократно преодолеть предел Хайфлика. и; поделиться больше 1000 раз [25]. Активация теломеразы в опухолевых клетках наблюдается в 80 - 90 % случаев. В соматических клетках с активной теломеразой уровень активности ниже, чем в опухолевых-[26]; Недавние исследования показали; что в клеточных культурах, полученных: из эпителия? бронхов; курильщиков, теломеразная активность повышена [27]; Наличие теломеразной: активности характерно?именно для злокачественных опухолей' в то время - как. в доброкачественных опухолях, активность этого фермента либо не выявляется;вовсе, либо частота ее обнаружения низка [2,13- 28]1
Белки, регулирующие работу теломеразы; могут быть важными мишенями при онкогенезе и, соответственно, противоопухолевой терапии; На активность теломеразы влияют белки, имеющие множество функций в клетке, а значит, воздействующих отнюдь не специфично. Также встречаются случаи, когда регуляторы теломеразы действуют
совместно, либо несколько регуляторов объединены в каскад. В последнем случае вещества, приводящие к изменениям теломеразнои активности, могут не являться непосредственными и специфическими регуляторами теломеразы. Практическое применение подобных веществ требует тщательного изучения механизма их действия и тщательного контроля побочных эффектов, поскольку кроме теломеразы они могут влиять на другие важные компоненты клетки.
Активация теломеразы ~ это потенциальный маркер для раннего обнаружения рака. Она может появляться на разных стадиях перерождения в зависимости от типа рака. Для использования активности теломеразы в диагностике необходимо предварительно изучение механизмов активации теломеразы на разных стадиях развития заболевания.
Амплификация генов hTR и hTERT
В норме ген, кодирующий hTR, представлен одной копией, находящейся на хромосоме 3 в положении 3q26.3. Этот участок хромосомы 3 часто амплифицируется, например, в раках шейки матки, легкого и плоскоклеточной карциноме головы и шеи. Число копий гена hTR возрастает в опухолевых клетках по сравнению с нормальными, и, в соответствии с этим, усиливается и экспрессия hTR в раках шейки матки и плоскоклеточной карциноме головы и шеи [48]. Ген hTERT расположен на хромосоме 5 в положении 5ql5.33, в регионе, который тоже часто амплифицируется в ряде раков [48]. Поскольку амплификация теломеразных генов происходит в процессе амплификации хромосом, содержащих эти гены, а не во время специфической амплификации локусов, можно сделать вывод о неспецифичности этого процесса. В случае плоскоклеточных карцином шейки матки активация экспрессии hTERT не связана с амплификацией гена hTERT [49]. С другой стороны, эта амплификация может происходить в результате хромосомной нестабильности и анеуплодии, возникающих при критическом укорочении теломер: 1.3 Регуляция транскрипции TERT В то время- как hTR экспрессируется во многих тканях, появление белка теломеразной обратной транскриптазы совпадает с появлением теломеразной активности [50]. Транскриптов hTERT мало или они вовсе не детектируются в большинстве тканей человека, но часто наблюдаются в этих же тканях после неопластической трансфекции [51]. Интересно, что суперэкспрессия TERT при отсутствии в клетке TR может давать антионкогенный эффект. Трансгенная мышь, суперэкспрессирующая TERT в базальных кератиноцитах кожи (K5ert), имеет повышенную теломеразную активность. Заживление ран у таких животных ускорено, при этом рак кожи развивается у них примерно вдвое чаще чем у особей дикого типа. Напротив, у первого поколения- TR-/- мышей частота встречаемости рака кожи снижена по сравнению с особями дикого типа. K5ert мыши, созданные на основе TR-/- мышей (K5ert/TR-/- мышь), не содержат теломеразу в коже, а культуры первичных кератиноцитов из этих животных имеют значительно более короткие теломеры чем клетки дикого типа. K5ert/TR-/- мыши намного менее чувствительны к химическому индуцированию рака кожи, чем мыши дикого типа или K5ert или TR-/-мыши [48]. Промотор hTERT является GG-богатым и не содержит блоков TATA и СААТ, характерных для посадки РНК-полимеразы П.. Существуют разные данные о местоположении участка инициации транскрипции, полученные с помощью различных методов и клеточных линий.
Кроме того, разные авторы. используют различные схемы нумерации нуклеотидов. Здесь и далее А в триплете ATG, с которого начинается трансляция, принимается за точку +1 нп (нуклеотидных пар). В работе [52] с помощью метода защиты от РНКазы (RNase protection assay) обнаружено несколько различных по размеру защищаемых участков в разных hTERT положительных клеточных линиях, что говорит о возможности существования нескольких сайтов инициации транскрипции (вероятно в области -40 - -100 нп). Наиболее общим является защищенный участок,, которому соответствует положение участка инициации транскрипции в положении-55 G от начала трансляции. В работе [50], анализируя кэпированную мРНК (метод "GapSite Hunting") клеточной линии HeLa, был обнаружен сайт старта транскрипции в положении -77 нп. В настоящее время в большинстве работ принимается последняя точка зрения. Участки, отвечающие за регуляцию транскрипции hTERT, сосредоточены на участке в 2000 нуклеотидных пар до участка инициации трансляции [53, 54]. Наиболее важным для активации является участок от 250-300 нп перед ATG до нескольких десятков нп после. Согласно [50] промотор практически полностью активен при использовании участка до - 258 нп. В работе [52] обнаружена наибольшая активность участка от -279 до 5 в клетках CMV-Mj-HEL-1 и SiHa; и от.-408 до 5 в RCC23 клетках. При добавлении участка от - 380 и дальше от сайта инициации происходит некоторое падение активности промотора (до 50% в клетках МЕ180, меньше в СЗЗА, HeLa, SiHa) [50], [52], а в клеточной линии RCC23 подобное падение начинается в районе - 400 — -500 нп [52]. При добавлении участка - 900 — -1400 нп по данным [50] активность промотора увеличивается, а по данным [52] продолжается некоторое падение. Далее при добавлении участка от - 2000 нп активность промотора падает примерно вдвое по сравнению с отрезком - 1000 нп [53 54] (при добавлении участка от —3000 в [55]) и при добавлении участков дальше -2000 активность промотора меняется незначительно. Кроме того, GG-богатый участок промотора формирует GpG-островки, рядом с ATG, указывая на возможность,регуляции экспрессии hTERT с помощью метилирования [8]. Профили метилирования нормальных и опухолевых клеток различаются. Анализ промотора теломеразы выявил два CpG-островка, один из которых находится в положении - 900 нп от стартового ко дона ATG [36]. В работе [56] показано, что маркеры активного хроматина и экспрессия теломеразы детектируются, когда участок промотора hTERT -73 — +227 нп не метилирован. Анализ метилирования промоторов 16 клеточных линий остеосаркомы показал относительное гиперметилирование всех клеточных линий, но никакой зависимости между частотой метил-СрО-островков и экспрессией hTERT не наблюдали.
Обработка деметилирующим агентом индуцирует экспрессию hTERT мРНК и белка только в одной клеточной линии [57]. При анализе 13 раковых клеточных линий и 24 образцов тканей рака кишечника оказалось, что в клеточных линиях экспрессируется hTERT, и CpG-островки промотора hTERT метилированы. Такие же результаты получены и для тканей. Промотор метилирован в 6 случаях, частично метилирован в 17 случаях и не метилирован в одном случае [58]. Схожие результаты получены в работе [59], где при анализе 56 клеточных линий получены данные о корреляции гиперметилирования и теломеразной активности. При длительной обработке деметилирующим агентом 5-аза-2 -дезоксицитидином (5-aza-2 -deoxycytidine, 5azadC) клеточных линий Lan-1, HeLa, Col 15, в которых теломераза активна, а промотор hTERT гиперметилирован, показано снижение уровня метилирования промотора hTERT на 95% и уменьшение уровня экспрессии мРНК hTERT. При-этом экспрессия с-Мус, одного- из основных активаторов промотора hTERT, незначительно уменьшается! или возрастает в зависимости от использованной клеточной линии. Активность теломеразы сильно падает после 2-4 пересевов клеток в присутствии 5azadC [60]. В нормальных клетках гиперметилирование промотора hTERT угнетает активность теломеразы и экспрессию мРНК hTERT, а при их обработке 5azadC теломераза активируется [61]. Анализ метилирования промотора hTERT у 30 пациентов с хроническими В-клеточными лимфоидными лейкозами показал, что при высокой теломеразной активности заметно снижен уровень метилирования [36]. Промоторы 16 клеточных линий остеосаркомы относительно гиперметилированы, но при этом связи между частотой метил-СрО-участков и экспрессией hTERT не обнаружено.
Вирусная регуляция экспрессии hTERT
Вирусы папиломы человека (ВПЧ) делят на 3 группы (неонкогенные, низкого и высокого риска) по вероятности неопластической трансформации зараженных клеток. Белки Еб и Е7 ВПЧ группы высокого риска участвуют в онкогенезе, инактивируя раковые супрессоры р53 (Еб совместно с Е6АР убиквитин белковой лигазой), pRB и ассоциированные с pRB белки р130 и р107 (Е7) и еще ряд белков [138]. Показано, что инактивация не только Е6, но и Е6АР приводит к подавлению теломеразной активности [138, 139]. Но поскольку в норме ген, кодирующий ЕбАР, присутствует практически во всех типах клеток и тканей [138], ключевая роль в активации теломеразы в этой паре принадлежит Е6. В случае трансфекции теломераза-негативных клеток (первичных кератиноцитов) генами Е6 и Е7 теломеразу активирует только Еб, но не Е7 [139, 140]. В случае трансфекции клеток обоими генами (Е6+Е7) данные противоречивы: активность теломеразы может быть как при трансфекции только геном Еб [140], несколько ниже [139] или несколько выше [80]. В клеточной линии рака шейки матки СЗЗА (с активной теломеразой, но без ВПЧ) экспрессия Еб активирует экспрессию hTERT в 3 раза, Е7 — в 1,5 раза [80]. В клеточной линии эпителия молочной железы Еб активирует теломеразу практически сразу, а Е7 ускоряет процесс появления в популяции теломеразной активности постепенно (через 20-25 пересевов при экспрессии Е7 обнаруживается высокая активность теломеразы) [141]. В-целом, Еб является прямым активатором теломеразы, а возможная активация теломеразы белком Е7 — опосредованный и слабый побочный эффект. Белок Еб, мутации в котором приводят к потере способности активировать . деградацию р53, может усиливать экспрессию теломеразы.
Экспрессирующие кератиноциты с активной теломеразой способны поделиться большее число раз, чем І кератиноциты без активной теломеразы, но не становятся бессмертными [142]. Еб активирует транскрипцию теломеразы, используя участок промотора от - 260 нп до сайта инициации трансляции (-15 - -266 нп [140], -258 нп [80]), на котором расположены 2 участка связывания с-Мус, при удалении! каждого из которых происходит падение активности на 60% [140]. Еб соосаждается с с-Мус при иммунопреципитации [143]. Изменение уровня экспрессии с-Мус при трансфекции клеток геном Еб не обнаружено. При суперэкспрессии гена, кодирующего Мах (белок-антагонист, конкурирующий с Мус), происходит подавление экспрессии hTERT, вызванное Еб [140]. По данным других авторов, введение мутаций в оба участка связывания с-Мус дает лишь незначительное уменьшение активности промотора. В то же время мутации в сайтах связывания Spl приводят к снижению индуцируемой Еб активности промотора до 50 %. Мутации же участков связывания с-Мус и Spl одновременно приводят к практически полному исчезновению активации транскрипции теломеразы белком Еб [80]. Таким образом, Еб использует для активации транскрипции hTERT участки связывания-и с-Мус, и Spl. В кератиноцитах и клетках эпителия молочной железы сильным активирующим теломеразу действием обладает Е6 у ВПЧ группы высокого онкологического риска (ВПЧ 16, ВПЧ 18, ВПЧ 31 и ВПЧ 54), а в случае ВПЧ группы низкого риска (ВПЧ 11, ВПЧ 6) активация транскрипции hTERT невелика [80]. Белок Е6 вирусов папилломы только группы высокого риска связывается с минимальным промотором hTERT [143]. Активация теломеразы белком Е6 является специфичной к типу клеток. Трансфекция клеток геном Е6, приводящая в случае клеток эпителия шейки матки к активации теломеразы, при использовании фибробластов крайней плоти [142] или клеток IMR90 [76] не дает аналогичного эффекта. Е6 активирует теломеразу, используя сразу несколько биохимических путей, как напрямую, так и выключая репрессоры теломеразы. Вирус папилломы человека также содержит белок Е2, способный угнетать промотор hTERT. В клеточной линии 293Т, применяя методы иммунопреципитации хроматина и мутагенеза, показано, что этот белок может связываться с промотором hTERT. Для ингибирования промотора важно его взаимодействие с Spl, участки связывания которого находятся между Е-блоками. Е2 также способен ингибировать рост ВПЧ-инфицированных клеток и приводить к апоптозу клетки HeLa [144]. Известным вирусным онкогеном является белок X вируса гепатита В. Этот белок — транс-активатор, мишенями которого являются гены с-Мус, API, АР2, NF-kB [26], в свою очередь являющиеся активаторами теломеразы. По результатам работы- [145] мРНК hTERT и теломеразная активность почти не детектируются при доброкачественных поражениях печени, и обнаруживаются в большинстве раков, причем уровень теломеразной активности возрастает при переходе от дифференцированных раков к недифференцированным.
Данные по частоте встречаемости высокой теломеразной активности в тканях печенш несколько различаются, но показывают одинаковую тенденцию увеличения теломеразной активности при переходе от нормальной ткани к раку: в 79% раков, 24% цирроза и 8 % хронического гепатита [39]; в 85,2 % раков, 45,9% цирроза печени, 25 % хронического гепатита и 15,7% нормальных тканей [47]. Частота обнаружения активной теломеразы при заболевании гепатитом увеличивается а при дальнейшем перерождении резко возрастает. Таким образом, поражение вирусом гепатита является не единственной причиной появления активной теломеразы при раке печени. При трансфекции клеточных линий геном белка X гепатита В происходит увеличение количества мРНК hTERT (клеточные линии гепатокарциномы и холангиокарциномы) [146]. С помощью Вестерн-блот-анализа показано, что количество теломеразной обратной транскриптазы возрастает в клеточной линии гепатомы при суперэкспрессии белка X вируса гепатита В [ 147]. Одновременно с hTERT обнаружено небольшое возрастание количества с-Мус при суперэкспрессии белка X в клеточной линии гепатомы [147]. Поскольку с-Мус активируется белком X и активирует экспрессию hTERT, возможно он является одним из посредников в активации теломеразы при заражении гепатитом В. С другой стороны, связи экспрессии мРНК hTERT с уровнем с-Мус в клинических образцах рака печени методом гибридизации in situ не обнаружено. В участках связывания с-Мус с промотором hTERT в клинических образцах гепатоклеточной карциномы обнаружены мутации [148]. У мышей теломеразная активность увеличивается при отрезании и последующем зарастании печени в нормальных образцах, а в пролиферирующих злокачественных гепатоцитах в аналогичной ситуации активность теломеразы остается неизменной [149]. Участки возможного связывания- ядерных" гепатоцеллюлярных факторов ЗР и 5 (HNF-3b, HNF-5) найдены в промоторах обратной транскриптазы теломеразы как у человека, так и у мыши. Хотя- они- консервативны, их функциональная значимость остается неопределенной [74]. Они не являются, известными онкогенами, a HNF-3b участвует в дифференцировке клеток печени [150]. Оба герпесвируса, являющиеся онкогенными для человека, участвуют в регуляции транскрипции hTERT. Вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ) является возбудителем инфекционного мононуклеоза и связан с образованием раков, например с лимфомой Беркитта [26, 151]. Исследования носоглоточной лимфомы, которую провоцирует ВЭБ, показали, что различные белки ВЭБ могут как активировать, так и ингибировать ген теломеразной обратной транскриптазы в результате модулирования внутриклеточных сигнальных путей [152]. Латентный мембранный белок 1 (LMP1) вируса Эпштейна-Барр индуцирует специфическое связывание hTERT с р65 субъединицей NF-kB и перенос обоих белков из цитоплазмы в ядро [153]. Другой механизм активации экспрессии hTERT белком LMP1 осуществляется путем трансактивации им с-Мус [154].
Активация теломеразы в предраковых поражениях шейки матки
Поражения шейки матки, в той или иной степени связанные с развитием опухолевого процесса можно условно разделить на 2 группы - предопухолевые (цервикальные интраэпителиальные неоплазии - CIN) и непосредственно опухоли. (Материалы для исследования CIN были любезно предоставлены к.м.н. Л.И.Короленковой (поликлиника ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина) после предварительно кольпоскопичкского контроля больных) CIN характеризуются рядом морфологических изменений, которые достаточно четко определяются при гистологическом и цитологическом исследовании. Соответствующие фотографии представлены нарис. 13. Отличительной особенностью предопухолевых поражений является их способность к возможной регрессии. Для CIN I регрессия достигает гораздо большей степени, чем для CIN II и CIN III. До настоящего времени не существует четких диагностических критериев, позволяющих верифицировать CIN, способные к регрессии, и CIN, прогрессирующих к злокачественному фенотипу. Поскольку в опухолях теломераза уже активна, но не активна в нормальных тканях, теломеразная активность должна появляться на стадии предракового поражения. Теломераза представляет собой комплекс, содержащий белок и РНК матрицу. Основным этапом регуляции теломеразы в литературе считается активация экспрессии мРНК hTERT, которая в клетках может быть представлена несколькими сплайсированными формами. Основными среди них являются полноразмерная, а-форма, р-форма и а+Р форма. Схема представлена на рис. 14. В совместной работе с лабораторией молекулярной биологии вирусов ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина было проведено сравнение различных типов сплайсированных форм мРНК hTERT и теломеразной активности на ранних стадиях канцерогенеза. В большинстве опухолей появление теломеразной активности коррелирует с появлением мРНК hTERT. Эта корреляция не 100% (есть случаи когда есть мРНК, но нет активности теломеразы), а на модельных системах показана возможность регуляции теломеразной активности на этапах сплайсинга мРНК hTERT [56, 168], посттрансляционных модификаций теломеразы, доступа на теломеры [228, 237]. Основной сложностью применения метода TRAP к анализу клинических образцов является приготовление клеточных экстрактов, поскольку, в отличие от клеточных линий, которые содержат только определенный тип клеток, в клинических образцах представлены и другие типы тканей.
На операционных образцах опухолей была стандартизована методика их разрушения с целью приготовления экстрактов, содержащих активную теломеразу [35]. В случае предраковых поражений основная сложность заключется в том, что для анализа доступны лишь очень небольшие фрагменты тканей, разрушение которых в условиях, разработанных для образцов опухолей, доступных в больших количествах, приводит к получению разбавленных растворов, в» которых детекция теломеразной активности затруднена. В связи с этим нам пришлось разработать специальный подход для приготовления концентрированных экстрактов из образцов весом 10-100 мг. Разработку данного подхода проводили на модели опухолевых препаратов, в которых теломеразная активность была обнаружена ранее. Для анализа брали фрагменты опухоли весом 10-100 мг. В результате нам удалось добиться стабильно воспроизводимых результатов детекции активности теломеразы. На следующем этапе была проанализирована серия образцов CIN. Оказалось, что действительно, в ряде образцов была обнаружена теломеразная активность, а в ряде образцов она отсутствует. Примеры полученных данных приведены на рис. 15, 16. Как наличие, так и отсутствие теломеразной активности на стадии CIN говорит об активации теломеразы в начале опухолевого процесса. Можно предположить, что активация теломеразы в тканях происходит, в основном, при поражении ВПЧ группы высокого онкогенного риска (как это было показано на модельных клеточных линиях), поскольку частота встречаемости как ВПЧ группы высокого риска, так и активной теломеразы на ранних стадиях CIN составляет 30-40%. В первых экспериментах были использованы здоровая ткань и доброкачественные поражения шейки матки (миомы) для сравнения с CIN различных стадий и проверки отсутствия неспецифического сигнала от пролиферирующих клеток крови (рис. 15). Теломеразная активность отсутствовала при доброкачественных поражениях, а в большинстве поздних стадий проявлялась высокая теломеразная активность (CIN III и рак В совместной работе с лабораторией молекулярной биологии вирусов ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина в той же серии образцов проводили анализ мРНК hTERT. В результате работы были выделены РНК из 38 образцов биопсий шейки матки. Из них 12 образцов представляют собой условно-нормальную ткань, 19 образцов - CIN разных стадий и б образцов — плоскоклеточные карциномы. Качество полученного препарата РНК проверяли по рибосомной РНК. Соотношения количества 28S и 18S рибосомных РНК составляло 3 к 1, что говорит о хорошем качестве полученной РНК. После проведения обратной транскрипции качество полученной кДНК проверяли с помощью амплификации генов «домашнего хозяйства» GAPDH и HPRT1. По результатам проверки выяснилось, что в некоторых образцах биопсий шейки матки кДНК не была получена, что может быть связано с недостаточным количеством РНК из этих образцов.
Таким образом, анализ изоформ гена hTERT проводили в 11 образцах условно нормальной ткани, в 18 образцах CIN разных стадий и в 6 образцах плоскоклеточных карцином. Использование праймеров, комплементарных как последовательностям РНК, удаляемым при сплайсинге, так и последовательностям, образуемым после сплайсинга, позволяет амплифицировать полноразмерную, а, р и а+р формы мРНК hTERT независимо. Все исследованные образцы биопсий шейки матки были разделены на три группы в зависимости от стадии поражения шейки матки. В первую группу вошли условно-нормальные ткани. Во вторую группу бьши объединены CIN легкой степени тяжести (CIN I и CINII). А в третью группу - CIN тяжелой степени (CIN III) и карциномы шейки матки. Полученные данные о наличии исследуемых сплайсированных форм мРНК hTERT в трех группах образцов биопсий шейки матки представлены в табл. 4. Полноразмерная форма мРНК гена hTERT кодирует функционально полноценную теломеразную обратную транскриптазу, наличие которой способствует иммортализации клеток. Полноразмерная форма мРНК гена hTERT найдена в 55% случаев условно-нормальной ткани, и далее частота ее обнаружения возрастает при переходе к CIN (83%) и далее к карциномам шейки матки (100%). Выявление полноразмерной формы в условно-нормальных клетках шейки матки позволяет сделать предварительный вывод об инициации процесса трансформации, что подтверждается повышением частоты обнаружения данной формы мРНК гена hTERT в ЦИНах и карциномах шейки матки. Р-форма мРНК гена hTERT содержит делецию части шестого экзона, что приводит к функциональному нарушению каталитического центра теломеразнои обратной транскриптазы. Она выявляется в 73% случаев условно-нормальной ткани и в 100% случаев предопухолевых поражений и плоскоклеточных карцином шейки матки. В почках зародыша теломеразная активность исчезает на 15-й неделе развития, а а транскрипты hTERT обнаруживаются на 21-й неделе. Возможно, при онкогенезе шейки матки аналогичная ситуация, когда в небольшом проценте условно-нормальных тканей и предраковых поражений происходит активация транскрипции гена hTERT, однако образование полноценного фермента блокируется неправильным сплайсингом мРНК hTERT. а-форма мРНК гена hTERT, кодирует функционально неактивный фермент, так как содержит делецию 7 и 8 экзонов, также составляющих часть каталитического центра фермента.
Приготовление S100 клеточных экстрактов
Полноразмерная форма мРНК гена hTERT кодирует функционально полноценную теломеразную обратную транскриптазу, наличие которой способствует иммортализации клеток. Полноразмерная форма мРНК гена hTERT найдена в 55% случаев условно-нормальной ткани, и далее частота ее обнаружения возрастает при переходе к CIN (83%) и далее к карциномам шейки матки (100%). Выявление полноразмерной формы в условно-нормальных клетках шейки матки позволяет сделать предварительный вывод об инициации процесса трансформации, что подтверждается повышением частоты обнаружения данной формы мРНК гена hTERT в ЦИНах и карциномах шейки матки. Р-форма мРНК гена hTERT содержит делецию части шестого экзона, что приводит к функциональному нарушению каталитического центра теломеразнои обратной транскриптазы. Она выявляется в 73% случаев условно-нормальной ткани и в 100% случаев предопухолевых поражений и плоскоклеточных карцином шейки матки. В почках зародыша теломеразная активность исчезает на 15-й неделе развития, а а транскрипты hTERT обнаруживаются на 21-й неделе. Возможно, при онкогенезе шейки матки аналогичная ситуация, когда в небольшом проценте условно-нормальных тканей и предраковых поражений происходит активация транскрипции гена hTERT, однако образование полноценного фермента блокируется неправильным сплайсингом мРНК hTERT. а-форма мРНК гена hTERT, кодирует функционально неактивный фермент, так как содержит делецию 7 и 8 экзонов, также составляющих часть каталитического центра фермента. Эта мРНК кодирует доминантно-негативную форму теломеразы, которая ингибирует полноценный активный фермент и таким образом может служить регулятором теломеразнои активности в клетке. В предраковых поражениях и на ранних стадиях канцерогенеза шейки матки происходит резкое падение частоты встречаемости а-формы мРНК hTERT со 100% случаев в группе условно-нормальных эпителиев шейки матки до 25% и 33% в группе дисплазий легкой степени тяжести и группе тяжелых дисплазий и карцином шейки матки, соответственно. Такое распределение встречаемости а-формы мРНК гена hTERT в группах биопсий шейки матки может свидетельствовать о ее возможной роли в подавлении теломеразнои активности в клетках эпителия»шейки матки. а+Р-форма мРНК гена hTERT присутствует практически во всех образцах исследованных биопсий шейки матки за исключением одного случая карциномы шейки матки.
Для ряда образцов CIN одновременно проведен анализ сплайс-форм мРНК hTERT и детекция теломеразнои активности. При» этом не всегда наблюдается теломеразная активность при наличии правильно сплайсированной РНК (рис. 18, образец 22t). Для получения экстракта использовали порцию 2x108 клеток. Клетки собирали резиновым скребком и центрифугировали 10 минут 500 g на 4С. Осадок клеток дважды промывали холодным буфером PBS, осаждая их после промывания центрифугированием в течение 3 минут 700 g при 4С. Затем осадок промывали равным, объемом 2,3х гипотонического буфера (1х гипотонический буфер: ЮмМ HEPES рН 8.0, ЗмМ КС1, 1мМ MgCb, 1мМ DTT, 10 ед/мл RNasin ("IRNase" "Хеликон"), коктейль ингибиторов протеаз ("Complete Protease inhibitor cocktail tablets", "Roche"), осаждали клетки центрифугированием в течение 5 минут при 700 g при 4С и ресуспендировали в 0,75 их объема 2,3х гипотонического буфера. После инкубации во льду в течение 10 минут клетки переносили в холодный (0С) 7-мл гомогенизатор Даунса и перетирали, используя пестик В (0С). После дальнейшего 30-ти минутного выдерживания во льду образец центрифугировали 10 минут на центрифуге Eppendorf 5415R (Германия) при 10000 об/мин при 4С. К осветленному экстракту добавляли 1/50 объема 5 М NaCl и проводили скоростное центрифугирование (100000 g при 4С, центрифуга Beckman L8-50 М/Е (США), ротор SW50.1, 1 час). К полученному препарату экстракта добавляли глицерин до конечной концентрации 20%, после чего экстракт порциями по 50-100 мкл замораживали в жидком азоте и хранили при -70С. Для приготовления экстракта использовали примерно 2x10 клеток HeLa, конечный объем получаемого препарата экстракта составлял 1 мл, таким образом, можно считать, что 1 мкл препарата S100 представлял собой экстракт из 2x105 клеток. Концентрацию белка в экстрактах определяли по методу Бредфорда, обычно она составляла 3-4 мг/мл. 3.8 Обработка экстрактов РНКазой А Контрольный экстракт с разрушенной РНК готовили прибавлением к 10 мкл экстракта 1 мкл раствора (10 мг/мл) РНКазы А. Смесь выдерживали 20 минут при комнатной температуре. Препарат рекомбинантного RPA человека был получен из штамма E.coli как описано в работе [234] с небольшими модификациями и не содержал примесей нуклеаз. Концентрация белка, измеренная с использованием реагента для измерения концентрации белка по Бредфорду ("Bio Rad") по предложенной производителем методике, и раствора БСА в качестве стандарта при построении калибровочной кривой, составляла 2,7 мг/ мл.
Согласно данным измерения анизотропии поляризации флуоресценции, полученным в результате равновесного титрования RPA с использованием, оцДНК [235], препарат содержал более 95% активного белка. Все последующие эксперименты проводили с учетом этого значения. 3.10 Иммунопреципитация RPA Поликлональные анти-RPA антитела из сыворотки иммунизированного кролика, очищенные с использованием аффинной хроматографии были любезно предоставлены к.б.н. П. П. Лактионовым (ИХБФМ). Для обеднения экстракта использовали модифицированную методику иммунопреципитации [228]. Экстракт S100 разбавляли PBS до концентрации белка 1 мг/мл. К 400 мкл разбавленного S100 экстракта добавляли антитела к RPA (5-Ю мкл) и инкубировали смесь 1-2 часа при +4С при перемешивании. 200 мкл протеин G-сефарозы преинкубировали 10 минут при +4С с 50 мкл S100 экстракта и центрифугировали при 1000 g. Затем к протеин G-сефарозе приливали 400 мкл смеси экстракта и антител и инкубировали суспензию 1-2 часа при +4С при перемешивании, после чего центрифугировали при 1000 g 5 минут. Супернатант собирали, делили на аликвоты, замораживали в жидком азоте и хранили при -70С. Полученный препарат экстракта с пониженным содержанием RPA использовали для последующих экспериментов. Для Вестерн-блотов белки S100 экстракта и RPA-обедненного S100 экстракта разделяли на 15% ДДС-ПААГ геле и переносили на нитроцеллюлозную мембрану ("Schleicher&Schuell"). Процедуру визуализации проводили с использованием антител против соответствующих белков (анти-RPA, анти-актин) набора детектирующих реагентов для Вестерн-блотов "Amersham ECL Plus" ("GE Healthcare") по прилагаемой производителем этих реагентов методике. В работе использовали фирменные актин ("DPC biermann") и антитела к нему (кроличья сыворотка, реакционноспособная к человеческому актину, "Sigma"). 3.12 TRAP recT TRAP-тест проводили как описано ранее [13] с некоторыми модификациями. На первом шаге готовили смесь N1: 49 мкл смеси TRAP, содержащей lx TRAP-буфер (1х TRAP-буфер: 20 мМ HEPES-KOH рН 8.3, 1,5 мМ MgCl2, 63 мМ КС1, 1мМ EGTA, 0,1 мг/мл BSA? 0,005% v/v Tween-20), 20 мкМ dNTP, за исключением dGTP% 4 мкМ dATP, 1,6 мкМ олигонуклеотида TS (aatccgtcgagcagagtt) и экстракт клеток клеточных линий или тканей.
