Содержание к диссертации
Введение
1. Регуляция №і2-зависимой транскрипции генов (обзор литературы) 8
1.1. Введение 8
1.2. Nrf2 - центральный регулятор системы ответа клетки на окислительный стресс 9
1.3. Способы регуляции фактора Nrf2 16
1.4. Ядерно-цитоплазматический транспорт белков, краткий обзор 32
1.5. Заключение 35
2. Роль ядерно-цитоплазматического транспорта белка Keapl в регуляции ответа клетки на окислительный стресс (результаты и обсуждение) 37
2.1. Кеар 1 способен перераспределяться в ядро 3 7
2.2. Идентификация сигнала ядерного экспорта белка Кеар 1 41
2.3. Поиск сигнала ядерной локализации белка Кеар 1 47
2.4. Nrf2 также постоянно перемещается между ядром и цитоплазмой 48
2.5. Выявление роли сигнала экспорта белка Кеар 1 в механизме регуляции №і2-зависимой экспрессии генов 51
2.6. Активирующие свойства белка Кеар INESmut
обусловлены его взаимодействием с Nrf2 57
2.7. Кеар INESmut не вызывает увеличение количества Nrf2 в клетке 62
2.8. Кеар 1 в присутствии Nrf2 взаимодействует с ARE in vitro 63
2.9. Кеар 1 входит в комплекс белков, взаимодействующих с промоторной областью гена NQ01 68
2.10. Новая модель регуляции ответа клетки на окислительный стресс 71
2.11. Альтернативные модели регуляции активности Nrf2, основанные на ядерно-цитоплазматическом транспорте 75
3. Экспериментальная часть 79
3.1. Используемые штаммы микроорганизмов и реактивы 79
3.2. Используемые приборы 81
3.3. Методы 81
Выводы 104
Список литературы 105
- Nrf2 - центральный регулятор системы ответа клетки на окислительный стресс
- Ядерно-цитоплазматический транспорт белков, краткий обзор
- Поиск сигнала ядерной локализации белка Кеар 1
- Используемые штаммы микроорганизмов и реактивы
Введение к работе
В процессе эволюции живые организмы разделились на два основных типа: прокариотические и эукариотические. Особенностью эукариотических клеток стало наличие ядра - отделенного от цитоплазмы мембраной компар-тмента, основной функцией которого стало хранение генетической информации. В связи с этим системы обслуживания ДНК и перевода генетического кода в аминокислотную последовательность значительно усложнились.
Поскольку для синтеза белка необходимо перевести мРНК из ядра в цитоплазму, а, с другой стороны, для осуществления процессов репликации и транскрипции нужно обеспечить наличие в ядре необходимых белков, то ядерная мембрана должна быть проницаема. Таким образом, возникла целая система ядерно-цитоплазматического транспорта, основной функцией которой стал перенос необходимых макромолекул через особые образования -ядерные поры.
Возникновение системы ядерно-цитоплазматического транспорта позволило создать очень гибкий механизм регуляции транскрипции различных генов, поскольку добавило еще один способ контроля активности транскрипционных факторов. Действительно, теперь транскрипционный фактор, находящийся в цитоплазме, остается неактивным до тех пор, пока не получит возможность перейти в ядро. С другой стороны его ядерная транслокация является более быстрым процессом, чем синтез фактора, начиная со стадии транскрипции или трансляции. Таким образом, пространственное разделение транскрипционного фактора и его генов-мишеней является очень частым способом его репрессии в условиях, когда активность фактора не требуется. И напротив, в условиях (часто неблагоприятных), когда транскрипция генов необходима, для осуществления ответа достаточно перевести фактор в ядро.
Поскольку подобный механизм является удобным для эукариотической клетки, то неудивительно, что на настоящее время известно довольно много различных транскрипционных факторов, регулируемых таким образом. В данной работе описывается контроль активности транскрипционного фактора Nr2 именно посредством ядерно-цитоплазматического транспорта. Nrf2 является ключевым белком ответа клетки в процессе очень опасного состояния - окислительного стресса, поэтому данное исследование является актуальным и позволяет по-новому взглянуть на способы защиты эукариотиче-ского организма от вредного действия окружающей среды.
Nrf2 - центральный регулятор системы ответа клетки на окислительный стресс
В процессе эволюции живые организмы разделились на два основных типа: прокариотические и эукариотические. Особенностью эукариотических клеток стало наличие ядра - отделенного от цитоплазмы мембраной компар-тмента, основной функцией которого стало хранение генетической информации. В связи с этим системы обслуживания ДНК и перевода генетического кода в аминокислотную последовательность значительно усложнились.
Поскольку для синтеза белка необходимо перевести мРНК из ядра в цитоплазму, а, с другой стороны, для осуществления процессов репликации и транскрипции нужно обеспечить наличие в ядре необходимых белков, то ядерная мембрана должна быть проницаема. Таким образом, возникла целая система ядерно-цитоплазматического транспорта, основной функцией которой стал перенос необходимых макромолекул через особые образования -ядерные поры.
Возникновение системы ядерно-цитоплазматического транспорта позволило создать очень гибкий механизм регуляции транскрипции различных генов, поскольку добавило еще один способ контроля активности транскрипционных факторов. Действительно, теперь транскрипционный фактор, находящийся в цитоплазме, остается неактивным до тех пор, пока не получит возможность перейти в ядро. С другой стороны его ядерная транслокация является более быстрым процессом, чем синтез фактора, начиная со стадии транскрипции или трансляции. Таким образом, пространственное разделение транскрипционного фактора и его генов-мишеней является очень частым способом его репрессии в условиях, когда активность фактора не требуется. И напротив, в условиях (часто неблагоприятных), когда транскрипция генов необходима, для осуществления ответа достаточно перевести фактор в ядро.
Поскольку подобный механизм является удобным для эукариотической клетки, то неудивительно, что на настоящее время известно довольно много различных транскрипционных факторов, регулируемых таким образом. В данной работе описывается контроль активности транскрипционного фактора Nr2 именно посредством ядерно-цитоплазматического транспорта. Nrf2 является ключевым белком ответа клетки в процессе очень опасного состояния - окислительного стресса, поэтому данное исследование является актуальным и позволяет по-новому взглянуть на способы защиты эукариотиче-ского организма от вредного действия окружающей среды.
В процессе жизнедеятельности эукариотической клетки в цитоплазме и в ядре могут появляться активные формы кислорода и азота, способные повреждать важнейшие клеточные макромолекулы и в итоге приводить к гибели клетки. Подобное крайне неблагоприятное состояние называется окислительным стрессом. Оно может быть вызвано как проникновением в клетку извне ксенобиотиков и оксидантов, так и естественными сбоями в механизмах клеточного метаболизма. На уровне целого организма подобное состояние также вызывается действием ионизирующей радиации, облучения ультрафиолетом, в ходе фагоцитоза и воспалительных процессов [1]. Окислительный стресс является причиной целого ряда серьезных заболеваний: атеросклероз, нейродегенеративные заболевания, рак [1-4]. В связи с этим исследование молекулярных механизмов поведения эукариотической клетки в состоянии окислительного стресса является актуальной научной задачей.
Для защиты клетка выработала сложный механизм, включающий в себя первую и вторую фазу ответа на окислительный стресс [5]. Если попавшее в цитозоль соединение гидрофобно, то именно в процессе первой фазы ответа осуществляется его перевод в водорастворимую форму ферментами группы цитохрома Р450. Однако получаемые в итоге соединения часто ядовиты (в основном именно они и вызывают появление активных форм кислорода), поэтому требуется дополнительная модификация (как правило, конъюгация с гидрофильными молекулами, например с глутатионом) для безопасного вывода образовавшихся продуктов из клетки [6]. Эта стадия осуществляется белками т.н. второй фазы ответа клетки на окислительный стресс. Если же соединение, проникшее в клетку, уже водорастворимо, то оно сразу подвергается действию ферментов второй фазы ответа.
Основным регуляторним белком второй фазы ответа клетки на окислительный стресс является транскрипционный фактор Nrf2, под контролем которого находятся все гены, кодирующие детоксифицирующие ферменты [7]. Механизмы регуляции фактора Nrf2 и являются предметом обсуждения настоящего обзора. Nrf2 - белок семейства CNC bzip Nrf2 - это белок длиной 581 аминокислотный остаток и массой 66 кДа (электрофоретическая подвижность у него аномальна и соответствует белку размером около 110 кДа). Nrf2 относится к семейству транскрипционных факторов с доменом CNC (сар п соПаг) и с участком т.н. основной лейциновой молнии (bzip - basic zipper). Этот белок был впервые обнаружен при поиске транскрипционных факторов, взаимодействующих с регуляторными областями глобинового и других эритроидных генов, и назван по сходству с основным регулятором этого локуса - NF-E2 (Nrf2 - NF-E2 related factor 2) [8, 9]. В отличие от NF-E2, распространенного только в гематопоэтических клетках [10], Nrf2 встречается во всех клетках организма, что уже в самом начале исследования его свойств позволяло предположить его важные функции. Кроме Nrf2 к семейству CNC bzip транскрипционных факторов относятся белки Nrf 1 и Nrf3, свойства которых будут затронуты далее.
Nrf2 взаимодействует со специфической областью ДНК в промоторньгх областях генов, кодирующие белки ответа клетки на окислительный стресс, называемой ARE (antioxidant response element, участок ответа на оксиданты) [11], или EpRE (electrophile response element, участок ответа на электрофилы) [12]. Свое название данные последовательности получили вследствие того, что репортерные конструкции под их контролем активировались под действием оксидантов или электрофилов.
Ядерно-цитоплазматический транспорт белков, краткий обзор
Поскольку описываемая далее практическая работа посвящена ядерно-цитоплазматическому транспорту белков Keapl и Nrf2, то в настоящий обзор литературы необходимо включить небольшую главу, посвященную основным аспектам данного вопроса.
В процессе эволюционного развития у эукариотических клеток появился отдельный компартмент, ядро, основная функция которого - хранение и обслуживание генетического материала. Ядро отделено от цитоплазмы липид-ным бислоем - ядерной мембраной. Поскольку информация о белках находится в ядре, а сами белки синтезируются в цитоплазме, причем их присутствие требуется в ядре, то возникает необходимость транспорта беков и других молекул через ядерную мембрану. Для этих целей служат специальные муль-тибелковые комплексы - ядерные поры, построенные из примерно 100 различных видов белков и имеющие массу порядка 125 МДа. Маленькие молекулы и небольшие белки с массой до 40-60 кДа способны проникать через ядерную пору посредством пассивной диффузии, однако для транспорта более крупных белков требуется активным и энергозависимым процесс [134].
Многочисленные исследования продемонстрировали, что за ядерный импорт или экспорт отвечают короткие последовательности в составе самих белков, называемые соответственно сигналами ядерного импорта (NLS - nuclear localization signal) и сигналами ядерного экспорта (NES - nuclear export signal) [135, 136]. Наиболее распространенными являются сигналы импорта в ядро, составляемые одним, или двумя, разделенными спейсером определенной длины, кластерами положительно заряженных аминокислотных остатков лизина и аргинина. Что касается сигнала экспорта из ядра, то классическим является т.н. лейцин-богатый NES, представляющий собой последовательность гидрофобных аминокислотных остатков (лейцин, изолейцин, фенилала-нин, валин), чередующихся с другими аминокислотами так, что при образовании этим участком структуры а-спираль гидрофобные аминокислоты оказывается с одной стороны и образуют т.н. гидрофобный гребень. В подобном сигнале наиболее важными для его функционирования являются последние остатки лейцинов. Ряд наиболее характерных сигналов экспорта из ядра и импорта в ядро приведен в таблице 1-2. Таблица 1-2. Примеры классических сигналов ядерного импорта и экспорта.
Для прохода через ядерную пору белкам, обладающим сигналами экспорта или импорта, необходимо связаться со специальными транспортными белками - импортинами или экспортинами [136]. Белки с классическим положительно заряженным сигналом импорта в ядро последовательно связываются с двумя белками: сначала с импортином а, затем образовавшийся комплекс взаимодействует с импортином р. Далее три белка проходят через ядерную пору. В ядре белковый комплекс импортины-белок разрушается под действием специфической СТРазы Ran, т.е. суммарный процесс требует энергию, выделяемую при гидролизе GTP. Процесс экспорта из ядра схож с процессом импорта: белки с классическим лейцин-богатым сигналом экспорта взаимодействуют с экспортином (Crml) в присутствии той же Ran, в цитоплазме происходит гидролиз GTP и, как следствие, диссоциация комплекса экспор-тин-белок [136]. Таким образом между цитоплазмой и ядром создается градиент GTP, причем переход GDP в GTP осуществляется именно в ядре при помощи специфического фактора, ассоциированного с хроматином (RCC1). Схематически описанные выше процессы импорта и экспорта представлены на рисунке 1-7 [137].
Кроме описанных выше механизмов существуют альтернативные способы импорта и экспорта белков, опосредованные неканоническими сигналами и независящие от GTP. Ряд белков может транспортироваться через ядерную пору за счет взаимодействия с другими белками, обладающими сигналами импорта или экспорта, т.е. обнаружение у полипептида способности перемещаться между ядром и цитоплазмой не является прямым свидетельством того, что он обладает последовательностями NLS или NES. Для доказательства их существования необходимо продемонстрировать, что эти участки необходимы и достаточны для транспорта белка в ядро или из него.
Поиск сигнала ядерной локализации белка Кеар 1
На следующем этапе нашей работы было решено идентифицировать NLS белка Keapl человека. Для этого был использован тот же подход, что и для поиска NES, - создание химерных конструкций с EGFP и изучение их внутриклеточной локализации. Однако Keapl не содержит аминокислотных последовательностей, похожих на какой-либо из известных сигналов ядерного импорта. Как было обнаружено ранее (рис.2-7Б,В), обе половины белка Keapl были способны накапливаться в ядре (N-концевая под действием LMB), поэтому можно было предположить наличие сигнала NLS практически в любой части белка. В первую очередь мы решили исследовать С-концевую половину репрессора. Единственным доказательством существования в ее составе последовательности NLS может быть идентификация аминокислотных остатков, необходимых и достаточных для осуществления импорта в ядро. Единственный короткий участок в составе С-концевой половины, имеющий отдаленное сходство с классическим основным сигналом импорта, - блок 5 KHRR (рис.2-6), поэтому было решено создать различные делеционные мутанты Keapl, как содержащие предполагаемый NLS, так и не включающие его.
Изучение локализации синтезируемых в клеточной линии HeLa химерных белков дало обнадеживающие результаты: фрагменты, содержащие блок 551KHRR554 находились в ядре, а белки, не имеющие этот участок, были из него исключены (данные не приведены). Например, фрагмент Keapl 1-535, содержащий всю N-концевую половину, был исключен из ядра даже при обработке клеток LMB. Однако последующее создание полноразмерного белка, несущего две точечные мутации в предполагаемом сигнале импорта в ядро, и исследование его внутриклеточной локализации показало, что NLS картировать не удалось. Данные мутации лишь ослабляли способность полноразмерного белка накапливаться в ядре под действием LMB, тогда как белок с действительно нарушенным импортом в ядро должен был в этих условиях целиком оставаться в цитоплазме. Таким образом, вопрос о местоположении сигнала импорта в ядро белка Кеарі на настоящее время остается открытым. Возможно, что это не короткая последовательность в составе Kelch домена, а участок на его поверхности, образующийся из удаленных друг от друга фрагментов полипептидной цепи. Не исключено также, что Кеарі для транспорта в ядро отчасти использует NLS другого белка, способного с ним взаимодействовать. Nrf2 также постоянно перемещается между ядром и цитоплазмой
Поскольку основной функцией белка Кеарі является репрессия фактора Nrf2, то возник вопрос: каким образом обнаруженные нами челночные свойства Кеарі влияют на свойства и локализацию Nr2? Закономерной являлась гипотеза о том, что Nr2 в комплексе с Кеарі в нормальных условиях также постоянно перемещается в ядро и из него, а не конститутивно находится в цитоплазме.
Для проверки подобного предположения было решено изучить совместную локализацию в клетках линии HeLa белков KeaplWT и Nrf2WT (в нормальных условиях и в присутствии LMB), а также белков KeaplNESmut и Nr2WT (здесь и далее Nr2WT - это эктопический фактор дикого типа, Nrf2 -эндогенный белок). Поскольку в данных экспериментах нам хотелось наименьшим образом исказить свойства репрессора, мы отказались от химерных конструкций с EGFP и использовали другой вектор для продукции белков в эукариотических клетках - pcDNA4/HisMax (варианты А, В и С, отличающиеся только положением открытой рамки считывания в полилинкере). Транслируемые с подобной плазмиды белки содержат лишь небольшой олигопептид на N-конце, неспособный существенным образом повлиять на свойства всего белка. кДНК точечного мутанта Keapl, дефектного по сигналу экспорта из ядра, бьша встроена в полилинкер этого вектора в одной рамке считьшания с этим олигопептидом. Плазмиды на основе pcDNA4/HisMax А и В, кодирующие Keapl и Nrf2 (оба - дикого типа), были сконструированы в нашей лаборатории ранее. Детекция синтезируемых белков, как и ранее эндогенных, осу ществлялась при помощи сканирующей конфокальной микроскопии после последовательного окрашивания фиксированных клеток первичными, а затем вторичными, конъюгированными с хромофорами, антителами.
Из литературных источников известно, что при сверхэкспрессии в клетке Nrf2 преимущественно локализуется в ядре, а при добавлении его репрессора оба белка перемещаются в цитоплазму, что было подтверждено на первом шаге нашей работы (рис.2-12А и рис.2-13А,Б). Здесь и далее красный хромофор соответствует локализации Nrf2, а зеленый - Keapl (как диких белков, так и мутантных).
Поскольку Keapl и Nrf2, согласно нашим данным, являются белками-челноками и оба всегда в небольшом количестве присутствуют в ядре, закономерен вопрос: каким образом накопление этих двух белков в ядре, вызванное мутацией сигнала экспорта из ядра репрессора Keapl, скажется на экспрессии Nrf2-3aBHCHMbix генов? Подобный вопрос позволит выяснить функциональную роль присутствия Keapl в ядре клетки, поскольку кроме основного действия, связанного с экспортом Nr2 из ядра, у белка Keapl могут быть и дополнительные функции (например, диссоциация Nrf2 от промоторных областей подконтрольных генов).
Для ответа на поставленный вопрос был выбран метод с использованием репортерной конструкции. Суть подхода заключается в котрансфекции клеток двумя или более плазмидами. Первая кодирует репортерный белок, обладающий ферментативной активностью, транскрипция которого контролируется №2-связывающим участком ДНК в промоторной области. Остальные плаз-миды обеспечивают продукцию интересующих нас белков, в данном случае Nr2WT, KeaplWT или его мутантов. Если белок влияет на №2-зависимую транскрипцию, то это скажется на количестве в клетках репортерного фермента, и, как следствие, на уровне его активности, который можно количественно измерить.
В нашем случае была использована кДНК люциферазы под контролем промотора, содержащего ARE гена NQ01 человека (плазмида была сконструирована в нашей лаборатории ранее). Таким образом, уровень активности транскрипционного фактора оценивали по интенсивности хемилюминесцент-ной реакции фермента с субстратом (люциферин).
Для корректного сравнения получаемых результатов необходимо их нормирование. Для этого использовалась котрансфекция дополнительной плазмидой, содержащей кДНК фермента р-галактозидазы под контролем конститутивного промотора. Этот фермент, взаимодействуя с субстратом ONPG (О - нитрофенил p-D-галактопиранозид), расщепляет его с образованием окрашенного продукта, что позволяет измерять активность Р-галактозидазы спектрофотометрически и таким образом судить о ее количестве в клетках. Поделив значение люциферазной активности на величину Р-галактозидазной, можно получить нормированную люциферазную активность, которая приводится на всех дальнейших диаграммах.
Для продукции в клетках млекопитающих белков NrftWT и Keapl (дикого типа и мутанта по сигналу экспорта из ядра) использовались уже описанные выше плазмиды на основе вектора pcDNA4/HisMaxC. Фермент Р-галактозидаза синтезировался с уже имеющейся в нашем распоряжении плазмиды на основе того же вектора. Для изучения влияния мутантного белка Keapl на №і2-зависимую экспрессию репортерного гена были использованы две линии клеток: HeLa и HepG2.
Используемые штаммы микроорганизмов и реактивы
Как видно из рисунка 2-27, KeaplWT уменьшает количество Nrf2WT путем деградации. Это не происходит, если Nrf2 не способен взаимодействовать с репрессором. Важным наблюдением оказалось то, что количество Nrf2 дикого типа в присутствии KeaplNESmut практически не изменяется (или даже немного меньше) по сравнению с количеством Nrf2WT, синтезируемого в клетках без репрессора, и с количеством Nrf2Delta во всех случаях. Таким образом, можно было сделать вывод о том, что активирующее действие мутант-ной по сигналу экспорта из ядра формы репрессора Кеарі не является результатом увеличения количества фактора Nrf2.
Если исследуемый нами эффект обусловлен не увеличением общего количества Nrf2WT в клетках, то логичным кажется предположение о том, что KeaplNESmut, взаимодействуя с Nrf2 и находясь с ним, вследствие своей мутации, в ядре каким-то образом усиливает активирующие способности транскрипционного фактора. Подобный вопрос интерес тем, что позволяет взглянуть на репрессор Кеарі с совершенно новой стороны.
Мы высказали предположение, что Кеарі может входить в состав транскрипционного комплекса с участием Nrf2. Для его проверки было решено обратиться к методу EMSA (electrophoretic mobility shift assay - изучение сдвигов электрофоретической подвижности), который позволяет обнаружить взаимодействие между белками и фрагментами ДНК in vitro. Суть метода заключается в разной скорости перемещения свободного и связанного с белком (или белками) радиоактивно-меченного ДНК-зонда в неденатурирующем по-лиакриламидном геле. Если к реакционной смеси, состоящей из зонда и клеточного лизата добавить дополнительно антитела к исследуемому нами белку, то это вызовет либо диссоциацию комплекса (тогда мы сможем детектировать только свободный зонд), либо образование более сложного комплекса ДНК-белок-антитела (это уменьшит подвижность этой структуры в геле еще в большей степени). Такой вариант постановки эксперимента называется Super Shift.
В качестве зонда был выбран короткий двухцепочечный фрагмент ДНК (120 п.н.), содержащий ARE гена NQ01 человека, который до этого был нами использован для создания репортерных конструкций на основе гена люцифе-разы. Зонд синтезировали при помощи ПЦР в присутствии [a- P]dATP.
Инкубирование зонда с лизатом клеток линии HeLa, трансфицированных №і2-кодирующей плазмидой, приводило к образованию комплекса Nrf2-ARE, выявляемого в виде характерной полосы (рис.2-28,А). В качестве контроля был использован лизат нетрасфицированньгх клеток линии HeLa. Также дополнительным контролем являлось добавление в реакционную смесь избытка немеченого (т.н. «холодного») ДНК-зонда. В условиях такого эксперимента радиоактивная полоса, соответствующая комплексу Nrf2-ARE, исчезала (рис.2-28, панель А).
Дополнительным доказательством того, что обнаруженная нами полоса является комплексом Nrf2-ARE, служат эксперименты по влиянию на нее антител на Nrf2 (поликлональные антитела Н300 и С20). В этих условиях исследуемая полоса, наблюдаемая в данном месте, исчезла (по сравнению с контролем - преиммунной сыворотки кролика) (рис.2-28,Б), что свидетельствует о том, что связывание белка с антителами препятствует его взаимодействию с ARE. Не исключено, что поликлональные антитела вызвали смещение комплекса Nrf2-ARE на старт трека, что привело к появлению жирных полос вверху рентгенограммы (рис.2-28,Б).
Далее мы ввели в подобные эксперименты лизаты клеток, трансфициро-ванных соответственно плазмидами, кодирующими EGFP (контроль) и белки в тех же сочетаниях, что и в предыдущих экспериментах. В первую очередь наличие в клетках всех синтезируемых белков подтверждалось при помощи иммуноблоттинга клеточных лизатов клеток линии HeLa, синтезирующих белки в соответствующих сочетаниях (рис.2-29).
. Иммуноблоттинг лизатов клеток линии HeLa, трансфицированных белками Keapl и Nrf2 (как дикого типа, так и мутанты) в различных сочетаниях. Для детекции использовались поликлональные антитела к Nrf2 и Кеар 1.
Как видно из рисунка 2-30 (панель А), как Nrf2WT так и Nrf2Delta образовывали комплекс с ARE. В присутствии Keapl (как дикого типа, так и мутанта), мы детектировали образование комплекса с замедленной электрофоре-тической подвижностью - вероятно, Keapl-Nrf2-ARE. Существенно, что в присутствии Nrf2Delta, неспособного к взаимодействию с репрессором, этот «тройной» комплекс не образуется. Отдельно было проверено то, что Keapl, экспрессированый в клетках без Nrf2, неспособен образовывать комплекс с ARE (рис.2-30, панель Б).
