Введение к работе
з
Актуальность темы. Митохондрия, кроме роли энергетической станции, выполняет роль спускового механизма, запускающего процессы некроза и апоптоза клетки. В нормальном состоянии митохондрия уравновешивает стрессовые воздействия разнообразными защитными механизмами. При превышении суммой стрессовых воздействий некоего порогового значения митохондрия начинает процесс митоптоза, в некоторых условиях приводящий к лавинообразному массовому самоуничтожению митохондрий и апоптозу. Основным событием, определяющим митоптоз, является формирование повышенной проницаемости, начинающееся с окисления тиоловых групп аденин-нуклеотид транслоказы.
Одним из главных стресс-факторов и важнейшим сигнальным агентом является супероксид-анион, вырабатываемый дыхательной цепью митохондрии. Супероксид - не только вредоносный побочный продукт переноса электронов, но и необходимый медиатор процессов, происходящих в митохондрии и клетке. Многоуровневая антиоксидантная защита митохондрии включает в себя механизмы переработки 0{ в менее опасные активные формы кислорода, а также механизмы перераспределения супероксида между митохондрией и цитозолем.
Многочисленные исследования (Han, Williams et al. 2001; Madesh and Hajnoczky 2001; Han, Antunes et al. 2003) показывают, что основной канал внешней митохондриальной мембраны - митохондриальный порин (потенциал-зависимый анионный канал) является не только переносчиком метаболитов, но и путем вывода супероксид-радикала из межмембранного пространства в цитозоль. Изменяя проводимость анионного канала клетка может регулировать поток супероксида, выходящего из митохондрии и уровень супероксида внутри нее.
Многие стрессовые воздействия, например, гипер- и гипоксия, воздействие этанола, влияют на баланс супероксида и приводят к окислительному стрессу и повреждению ДНК. В то же время, грубое стимулирование антиоксидантных механизмов так же опасно и может приводить к возникновению злокачественных опухолей и дефектам развития. Таким образом, уровень и распредение потоков
4 активных форм кислорода является важнейшим регуляторным механизмом определяющим жизнь и смерть клетки.
В настоящей работе изучено влияние ингибирования потенциал-зависимого анионного канала на уровень супероксида в изолированных митохондриях. В качестве модельной системы для определения последствий ингибирования анионного канала использовали Са -индуцированное набухание митохондрий в присутствии фосфата и дыхательного субстрата (сукцината).
На основе анализа данных литературы сформулирована следующая гипотеза: ингибирование анионного канала усиливает чувствительность митохондрии к стрессовым воздействиям за счет затруднения оттока супероксида из межмембранного пространства в цитозоль; в результате этого нарастает внутренний окислительный стресс митохондрии и ускоряется возникновение поры повышенной проницаемости. Цель работы:
Показать, что ингибирование потенциал-зависимого анионного канала уменьшает проницаемость внешней митохондриальной мембраны, что в свою очередь затрудняет отток супероксида из митохондрии, вызывает окислительный стресс и ускоряет начало Са2+-зависимого набухания. Задачи исследования:
Показать, что ингибитор потенциал-зависимого анионного канала (G3139) снижает проницаемость внешней митохондриальной мембраны для водорастворимых молекул.
Показать, что ингибитор потенциал-зависимого анионного канала (G3139) ускоряет начало Са2+-зависимого набухания митохондрий.
Показать, что антиоксид анты частично компенсируют действие ингибитора G3139 на Са -зависимое набухание митохондрий.
Измерить скорость накопления супероксида внутри митохондрий и показать, что она зависит от проницаемости внешней митохондриальной мембраны.
Научная новизна. Предложен новый способ представления кинетики кальций-индуцированного набухания митохондрий в виде кривых зависимости времени полуперехода от концентрации кальция, который позволяет наглядно отображать
5 изменения кинетики и значительно облегчает анализ экспериментальных данных. Впервые, используя выделенные митохондрии печени крысы, прямо продемонстрировано уменьшение проницаемости внешней митохондриальной мембраны для небольших водорастворимых молекул после обработки ингибитором анионного канала G3139. Экспериментально показано увеличение под действием G3139 чувствительности митохондрий к кальцию в процессе кальций-индуцированного набухания. Этот эффект компенсируется обработкой митохондрий антиоксидантом. Адаптирован для использования на митохондриях метод измерения скорости накопления супероксида при помощи мембран-проницаемого флуоресцентного красителя дигидроэтидина. Показано значительное увеличение скорости накопления супероксид-радикала в митохондриях при ингибировании потенциал-зависимого анионного канала. При этом добавленная снаружи супероксиддисмутаза не изменяла скорости накопления 02" , что подтверждает, что супероксид-радикал накапливается не в цитозоле, а внутри митохондрий.
Научно-практическое значение. Выдвинутая гипотеза, в пользу которой свидетельствуют полученные в процессе работы данные, предполагает существование митоптоза - регуляторного механизма, медиатором которого является супероксид-радикал, а одним из главных регуляторов - потенциал-зависимый анионный канал. Таким образом углубляется понимание механизмов инициации апоптоза и повреждения тканей в условиях патологии. Разработанные в данной работе экспериментальные методы измерения проницаемости митохондриальной мембраны и скорости накопления супероксида внутри митохондрий могут применяться в последующих исследованиях митохондриальных функций. Положения, выносимые на защиту:
Ингибитор потенциал-зависимого анионного канала G3139 уменьшает проводимость внешней митохондриальной мембраны для небольших водорастворимых молекул (кальцеина).
Обработка митохондрий ингибитором анионного канала G3139 ускоряет начало набухания, вызванное кальцием, причем этот эффект компенсируется добавлением антиоксиданта.
Реакция окисления дигидроэтидина супероксидом происходит преимущественно внутри митохондрии (в матриксе и межмембранном пространстве).
В митохондриях, обработанных ингибитором G3139, значительно увеличивается скорость накопления супероксида, причем этот эффект компенсируется обработкой пороформирующим реагентом дигитонином.
Апробация работы состоялась 09 ноября 2009 г. на заседании проблемной комиссии "Биохимия, биофизика и реология крови" в Гематологическом Научном Центре РАМН.
Материалы диссертации докладывались на конференции 52nd Annual Meeting of the Biophysical Society and 16th IUPAB International Biophysics Congress, Long Beach, CA, USA, 2-6 Feb 2008
Публикации. По материалам диссертации опубликованы тезисы в сборнике трудов конференции и 2 статьи в рецензируемых журналах.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 106 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 — обзора литературы, главы 2 — описания материалов и методов, главы 3 — описания результатов, главы 4 — обсуждения результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 194 источника. Работа выполнена на базе Гематологического Научного Центра РАМН в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. лабораторией проф. Атауллаханов Ф.И.).
