Содержание к диссертации
Введение
1.Обзор литературы 9
1.1.Выделение Na+,K+ATФазы 9
1.2.Цикл Альберса-Поста 10
1.3.Неканонические режимы работы белка 11
1.4. Структура Na+,K+-ATФазы 13
1.5.Различие структуры Na+,K+-АТФазы в двух основных конформациях 15
1.6.Ингибиторы Na+,K+-АТФазы .17
1.7.Сайты связывания ионов в белке 17
1.7.1.Гипотетическая последовательность связывания Na+ 24
1.8. Определение констант связывания K+ и Na+ в цитоплазматических сайтах связывания Na+,K+-ATФазы 27
1.9.Специфичность Na+,K+-ATФазы к переносимым ионам .29
1.10. Влияние многовалентных ионов 31
1.11.Электрогенность Na+,K+-ATФазы. Диэлектрические коэффициенты 32
1.12.Модель электрогенного транспорта ионов Na+,K+-АТФазой .34
1.13.Исследования на клетках. Нестационарный транспорт .36 1.14.Исследования на плоских бислойных мембранах. Метод адмиттанса 38
1.15.Влияние рН на активность Na+,K+ATФазы 43
1.16.Постановка задачи 46
2. Материалы и методы .48
2.1.Материалы. 48
2.2.Методы .50
2.2.1. Методы формирования БЛМ и регистрации токов Na+,K+-АТФазы 51
3 2.2.2.Метод компенсации внутримембранного поля с помощью второй гармоники емкостного тока 56
3.Результаты и их обсуждение. 57
3.1.Опыты с caged-ATP 57
3.2.Опыты с caged-H+ 63
3.2.1.Опыты на БЛМ без адсорбированных мембранных фрагментов .63
3.2.2.Опыты с Na+,K+-ATФазой 70
3.2.2.1.Определение констант связывания Na+ и K+ в цитоплазматических сайтах Na+,K+-ATФазы 79
3.2.2.2. Зависимость связывания Na+ в цитоплазматических сайтах от концентрации Mg2+ 83
3.3.Заключение 85
4.Выводы 86
5.Список используемой литературы
- Структура Na+,K+-ATФазы
- Влияние многовалентных ионов
- Методы формирования БЛМ и регистрации токов Na+,K+-АТФазы
- Зависимость связывания Na+ в цитоплазматических сайтах от концентрации Mg2+
Структура Na+,K+-ATФазы
Ценная информация о механизме работы Na+,K+-АТФазы может быть получена из экспериментов, в которых ионы натрия или калия отсутствуют в среде. В таких упрощенных условиях Na+,K+-ATФаза способна осуществлять часть своих транспортных функций.
В отсутствие ионов калия и в присутствии ионов натрия как в цитоплазме, так и во внешней среде, белок осуществляет электронейтральный обмен ионов натрия в соотношении один к одному. Для поддержания этого режима требуется одновременное присутствие АТФ и АДФ внутри клетки. Обмен сопровождается переносом меченого концевого фосфата между АТФ и АДФ, но не приводит к суммарному гидролизу АТФ. Предположительно обмен осуществляется по цепочке реакций:
Эта цепочка соответствует верхней части схемы Алберса-Поста. Здесь ионы натрия связываются с цитоплазматической стороны с высоким сродством ( 10 мМ), а с внешней - с низким ( 100 мМ) (Glynn, 1985). В отсутствие ионов натрия и с внешней, и с цитоплазматической стороны мембраны наблюдается аналогичный калий-калиевый обмен. Сродство к калию имеет еще более выраженную асимметрию, на внешней стороне 0,2 мМ, а на цитоплазматической 10мМ. Для такого режима работы необходимо присутствие неорганического фосфата и АТФ (Glynn, 1988). Необходимость присутствия фосфата означает, что перенос калия во внешнюю среду связан с обращением реакции его переноса в цитоплазму. Таким образом, калиевый обмен может быть представлен следующей схемой:
В отсутствие во внешней среде ионов натрия и калия или других способных замещать их ионов (Rb+, Сs+, Li+ и т.д.), гидролиз АТФ сопровождается транспортом ионов натрия из цитоплазмы во внешнюю среду (Karlish and Kaplan, 1985) В этом случае АТФ-зависимый транспорт ионов натрия происходит так же, как и в физиологических условиях, сопровождаясь медленным спонтанным дефосфорилированием белка. Отношение числа переносимых ионов натрия к числу гидролизуемых молекул АТФ составляет три к одному. Перенос электронейтрален при рН=6,5, но становится все более электрогенным при повышении рН (Goldshleger et al., 1990). Наиболее вероятным представляется такое объяснение, что при низких значениях рН протоны служат заместителями ионов натрия, и неэлектрогенный "несопряженный перенос" ионов натрия на самом деле представляет собой их обмен на ионы водорода в соотношении три натрия к трем протонам.
Если в условиях несопряженного АТФ-зависимого транспорта ионов натрия во внешнюю среду добавить эти ионы в очень маленькой концентрации ( мМ), происходит ингибирование гидролиза АТФ и транспорта. Повышение внеклеточной концентрации ионов натрия приводит к возобновлению обоих процессов, однако при этом наблюдается поток ионов натрия в обоих направлениях (Cantley, 1981). В этих условиях ионы натрия могут замещать ионы калия с внешней стороны белка, и АТФ-зависимый натриевый обмен осуществляется по той же схеме, что и в стандартных условиях (т.е. по схеме Альберса и Поста), но с заменой калия на натрий. Эксперименты с белком, реконструированным в липосомы, показывают, что АТФ-зависимый натриевый обмен является электрогенным. Однако стехиометрия натрий-натриевого обмена в указанных условиях несколько больше, чем три к двум. Одно из возможных объяснений состоит в том, что, как упоминалось выше, кроме ионов натрия, калий может замещаться протонами, тогда как способность протонов замещать ионы натрия значительно ниже.
Таким образом, помимо нормального обмена трех цитоплазматичеких ионов натрия на два внеклеточных иона калия, Na+,K+-ATФаза способна осуществлять не сопровождающийся суммарным гидролизом АТФ калий-калиевый и натрий-натриевый обмен в соотношении один к одному, а также сопровождающийся суммарным гидролизом АТФ натрий-натриевый обмен, либо несопряженный транспорт ионов натрия из цитоплазмы во внеклеточную среду.
Помимо этого, обнаружена дополнительная реакция, в ходе которой наблюдается низкое сродство белка, пребывающего в состоянии Е2, к АТФ (Glynn, 1985) Такая реакция не является необходимой для завершения цикла – транспорта ионов калия в клетку, – однако она ускоряет конформационный переход. Кроме того, подбором соответствующих условий можно заставить Na+,K+-ATФазу работать в «обратном направлении», т.е. синтезировать АТФ (Garrahan and Glynn, 1967). В более поздней публикации (De Weer et al., 2001), показано существование электрического тока при обращении транспорта в обратном направлении.
В последних публикациях показана способность Na+,K+-ATФазы в определенных условиях переносить и протоны, причем количество и механизм их переноса в настоящее время активно дискутируются (см «1.15.Влияние рН на активность Na+,K+-ATФазы»).
Влияние многовалентных ионов
Определенная по активации натриевого тока из клетки и ингибировании калиевого тока в клетку аффинность понижается в ряду Rb+ K+ Cs+ Li+ (McCognahey et al, 1962; Sachs et al, 1967). В «натриевой» ветке транспорта Na+ может заменяться Li+, существуют косвенные свидетельства, что он также может замещаться протонами. Те же скорости переноса Li+ достигаются при на порядок большей его концентрации, чем Na+ , а стехиометрия переноса Li+ на молекулу АТФ близка к 2 (Dunham et al, 1977). Однако следует различать константы непосредственно связывания ионов с трансмембранными сайтами и эффективными константами переноса ионов (они также зависят от связывания с другими сайтами, распределения зарядов в белке, последующих конформационных переходов и т. д.). Связываться с цитоплазматическими сайтами, но не переноситься могут некоторые другие моновалентные ионы. Согласно данным по ингибированию направленного наружу тока натрия (Maizels, 1968) и уменьшению скорости гидролиза АТФ вследствие конкуренции с натрием за цитоплазматические сайты связывания (Rossi et al, 1978), константы связывания разных моновалентных катионов убывают в последовательности K+ Rb+ Cs+ Li+. Наиболее подробное исследование цитоплазматического связывания различных ионов было проведено в работе (Schneeberger and Apell, 2001) с помощью флуоресцентных красителей, чувствительных к связыванию третьего иона натрия. Для определения констант связывания использовался факт кооперативности связывания Na+. При насыщающей их концентрации постепенно повышалась концентрация исследуемого иона, в результате чего происходило вытеснение этими ионами натрия из первых двух сайтов. Это приводило к диссоциации натрия и из третьего сайта, что вызывало изменение флуоресценции.. Данный метод позволил определить непосредственно константы диссоциации Rb+, K+, Cs+ и Li+ в цитопламатических сайтах Na+,K+-ATФазы: KRb=0.8 мМ, KK=0.9 мМ, KCs=12 мМ, KLi=32 мМ. Различие полученных констант объясняли разными радиусами этих ионов, и из зависимости констант от радиуса был получен оптимальный размер радиуса, величина которого говорит о размере полости в сайте связывания Na+,K+-АТФазы (рис. 10)
Многие двухвалентные ионы оказывают сильное влияние на активность Na+,K+,ATФ-азы. Как говорилось выше, ион магния необходим как кофактор для работы белка. Однако Mg2+ обладает и ингибирующим действием на белок. Детальное исследование взаимного влияния ионов магния и натрия на связывание друг друга проведено в статье Schneeberger and Apell, 2001. Методика исследования была аналогична приведенной в предыдущем разделе со связыванием одновалентных ионов, однако, в отличие от одновалентных ионов, Mg2+ связывается не в трансмембранных сайтах а, предположительно, на цитоплазматической петле L6/7 (Shainskaya, 2000). Согласно полученным данным, повышение концентрации Mg2+ вызывает увеличение константы диссоциации Na+ и, наоборот, повышение концентрации Na+ приводит к увеличению константы диссоцияции Mg2+ (рис. 11). Повышение концентрации ионов натрия от 0 до 5 мМ не влияет на KMg, При дальнейшем росте концентрации KMg увеличивается линейно. Полученную зависимость удалось описать уравнением конкурентного связывания Na+ и Mg2+:
Co2+, Ni2+ и Mn2+ могут выступать в качестве заместителей Mg2+ как кофакторы. Co2+ может обеспечить примерно ту же скорость работы белка (число оборотов в единицу времени), что и Mg2+, тогда как Ni2+ и Mn2+ - лишь менее половины этой скорости. Ca2+ не может заменить Mg2+ как кофактор гидролиза АТФ, но, даже в концентрациях около сотни мкМ ингибирует белок (Rossi et al, 1978; Apell et al, 1986). Ионы Ca2+, а также Ba2+ и Sr2+ в концентрациях около 10 мМ сильно (на 1-2 порядка) понижают константу связывания Na+ в цитоплазматических сайтах (Schneeberger and Apell, 2001).
В физиологических условиях Na+,K+-АТФаза переносит в одном цикле единичный не скомпенсированный положительный заряд. Таким образом, транспорт является электрогенным. Это обстоятельство позволяет исследовать работу АТФазы с помощью измерений электрических токов, связанных с электрогенными стадиями функционирования фермента (стадиями, в которых происходит перемещение заряда внутри мембраны). Обмен ионами между центрами связывания и растворами с цитоплазматической или внеклеточной стороны происходит пассивно. Согласно наиболее распространенному представлению, он протекает в т.н. “каналах доступа” - структурах, напоминающих колодцы или ионные каналы, выход из которых в раствор с одной стороны мембраны закрыт. Участки связывания двух из трех ионов натрия (так же как и двух ионов калия) отрицательно заряжены (Goldshleger et al., 1987). Перемещение этих ионов к местам связывания не сопряжено с заметным перемещением заряда в мембране. Связывание третьего иона натрия происходит только после того, как будут заняты участки связывания двух других ионов (Schneeberger, 2001). Это связывание (третьего иона) происходит в высокоспецифичном центре Na+,K+-АТФазы (Schwappach et al., 1994). Сопряженное с ним перемещение иона в каналах доступа представляет собой электрогенный процесс. Согласно результатам измерений электрических токов, глубина канала, соединяющего этот центр связывания с раствором с цитоплазматической стороны белка, составляет примерно 25% от толщины мембраны, (Wuddel and Apell, 1995), с внеклеточной стороны - 65 - 70% (Holmgren et al., 2000), (Wuddel and Apell, 1995). Для количественной оценки электрогенности той или иной стадии транспорта вводят специальный параметр – диэлектрический коэффициент (ДК). Его величина определяется соотношением эффективных емкостей области, в которой происходит перемещение заряда Сin , и оставшейся области Cadd: где Sin и Sin - толщина и значение диэлектрической проницаемости области, в которой происходит перемещение заряда, 8асы и sadd - соответствующие параметры оставшейся области. Единичному значению ДК соответствует перенос одного элементарного заряда через всю толщину мембраны из одного раствора в другой. Если ДК принимает значение меньше единицы, значит, транспорт осуществляется не через всю толщину мембраны. Значение ДК определяется также диэлектрической проницаемостью окружения заряда вдоль пути его переноса: чем меньше ДК, тем больше ее величина по сравнению с таковой для оставшегося слоя мембраны. Наиболее общее определение диэлектрического коэффициента какой-либо электрогенной стадии - это отношение электрической работы, затрачиваемой для перемещения иона на этой стадии, к суммарной работе, необходимой для переноса этого иона между двумя растворами, разделенными мембраной (Павлов и Соколов, 1999). В общем случае при изучении электрогенного транспорта исходно неизвестно, сколько ионов переносится в данной стадии и перемещаются ли в мембране одновременно с ионами другие заряды, например, заряженные группы белка.
Методы формирования БЛМ и регистрации токов Na+,K+-АТФазы
Электрические сигналы записывались после вспышки УФ света, вызывающей быстрое освобождение АТФ из связанной формы. Освобождение АТФ приводило к появлению переходного тока, связанного с переносом ионов натрия Na+,K+-ATФазой из раствора в область контакта БЛМ с фрагментом (Borlinghaus et al., 1987). Перенос ионов натрия в отсутствие ионов калия завершается установлением долгоживущего состояния "равновесия"; и для того, чтобы Na+,K+-ATФаза успевала вернуться в исходное состояние, следующую вспышку давали не ранее чем через 10 минут. Это позволяло проводить несколько измерений на одной мембране. На один из электродов подавалось напряжение синусоидальной формы с амплитудой 40 – 50 мВ с аналогового выхода платы L-783 (в случае измерений адмиттанса). Из литературы известно, что толщина БЛМ из дифитаноиллецитина, содержащих декан, около 5 нм (Benz et al., 1976), что примерно вдвое больше толщины МФ. Поскольку БЛМ и МФ включены последовательно (рис. 15), на последних должна падать примерно треть приложенного напряжения – 14-17 мВ. Подаваемое на мембрану напряжение поступало на вход одного из каналов АЦП. Второй электрод ячейки соединяли с входом операционного усилителя Keithley-427, выход которого был связан со входом другого канала АЦП. Для компенсации исходного (существующего до вспышки УФ света) переменного тока, вызванного емкостью и проводимостью БЛМ с адсорбированными фрагментами, использовалась аналоговая электронная схема, принцип действия которой основан на сложении инвертированного напряжения тока, генерируемого RC-цепочкой, с током, регистрируемым на БЛМ (рис.15). Эта схема позволяла значительно ослабить исходный емкостной ток БЛМ и сделать возможным запись малых приращений переменного тока, вызванных работой Na+,K+-ATФазы после вспышки УФ-света (рис. 16) (Соколов, 1992).
Полное вычитание исходного переменного тока и вычисление изменений адмиттанса проводилось компьютером с помощью разработанной Соколовым В. С. программы. Программа вычисляла изменение адмиттанса путем аппроксимации приращений переменного тока і, вызванных вспышкой света, линейной комбинацией косинуса и синуса с частотой приложенного напряжения . Амплитуды соответствующих функций, представляющие собой синфазную (с нулевым сдвигом фазы по отношению к переменному напряжению) и квадратурную (со сдвигом фазы в 90) составляющие переменного тока, использовались для определения приращения емкости gmeas и проводимости Cmeas БЛМ с адсорбированными фрагментами в соответствии с формулой амплитуда переменного напряжения, приложенного к мембране, о)=2ті/ -круговая частота переменного напряжения. Изменение адмиттанса мембраны вычислялось как разность средних значений емкости и проводимости до вспышки УФ-света и через 0,5 с после вспышки (рис. 16).
Кроме того, как говорилось выше, на высоких частотах приложенного напряжения емкость мембраны и сопротивление электродов работают как RC-ячейка (рис. 15). Исходя из анализа эквивалентной схемы, полученные в экспериментах значения емкости и проводимости нуждаются в коррекции. В приближении нулевой проводимости мембраны и малых изменений емкости, вызванных вспышкой света, по сравнению с исходной емкостью мембраны формулы для коррекции выглядят как: где Cm – исходная емкость мембраны, Gel – проводимость электродов и раствора, C и G – соответствующие приращения емкости и проводимости до коррекции, Ccorr и Gcorr – после коррекции. 2.2.2.Метод компенсации внутримембранного поля с помощью второй гармоники емкостного тока
Разность граничных потенциалов БЛМ измеряли методом компенсации внутримембранного поля с использованием второй гармоники емкостного тока (Соколов и Кузьмин, 1980). К мембране прикладывали сумму синусоидального (с выхода генератора Г3-118, Россия) и постоянного напряжений. Величина постоянного напряжения подбиралась такой, чтобы достичь минимального значения емкости мембраны, что контролировалось по отсутствию второй гармоники емкостного тока. Измерение осуществлялось автоматически с помощью написанной Соколовым В.С. программы. Вторая гармоника емкостного тока с выхода преобразователя ток-напряжение (Keithley-427, США) усиливалась селективным усилителем (Ф582, Россия) и подавалась на вход АЦП платы L780. В зависимости от величины второй гармоники программа вычисляла величину постоянного напряжения, которое с выхода ЦАП платы L780 подавалось на мембрану в сумме с синусоидальным напряжением, замыкая петлю отрицательной обратной связи. В результате действия обратной связи наступало устойчивое равновесие, в котором амплитуда второй гармоники поддерживалась равной нулю. Соответствующая этому условию постоянная составляющая напряжения на мембране равна разности граничных потенциалов
Для того чтобы установить возможность протонного транспорта Na+,K+-АТФазой, была проведена серия опытов с caged-ATP в среде, не содержащей ионов натрия и калия. Изучалось влияние рН на частотные зависимости приращения емкости и проводимости в ответ на освобождение АТФ в безнатриевой среде и после добавления в ячейку 4 мМ Na+. Эта концентрация ионов натрия, при которой, согласно литературным данным, основной вклад в изменения емкости мембраны вносит транспорт ионов натрия в цитоплазматическом канале доступа, выбрана для сравнения и нормировки. Для усреднения результатов разных опытов частотные зависимости нормировалась на величину заряда, перенесенного через мембрану Na+,K+-АТФазой, который определяли как максимальное значение интеграла тока короткого замыкания, измеренного в присутствии ионов натрия после вспышки света. В разных опытах значения перенесенного заряда лежали в пределах от 0.5 до 3 пКл.
В безнатриевой среде были получены зависимости, мало отличающиеся от аналогичных в среде с 4 мМ Na+ (рис. 18). Разница состояла в том, что в присутствии Na+ на низких частотах приращения емкости были меньше, чем в среде без Na+. Частотная зависимость изменения емкости в присутствии ионов натрия была близка к измеренной ранее в (Sokolov et al, 2008)
На приращения емкости в среде, не содержащей Ионы натрия, влиял рН. Повышение рН от 6 до 8 вызывало монотонное понижение низкочастотных участков зависимостей (рис. 19). Был также проведен контрольный эксперимент без добавления мембранных фрагментов. Он показал ничтожные (до 0.4 пикофарад) изменения емкости после вспышки, которые в пределах точности измерения можно считать нулевыми (рис. 20) на всех частотах переменного напряжения.
Зависимость связывания Na+ в цитоплазматических сайтах от концентрации Mg2+
Опыты были проведены при 4 значениях рН (7.4, 7.6 и 7.9 и 8.05) в области частот от 2 до 1024 Гц. После записи частотной зависимости в каждом эксперименте добавлялся NaCl в концентрации 4 или 10 мМ, после чего записывалась еще одна частотная зависимость (с Na+). Полученные частотные зависимости приведены на рисунке 27.
При рН=7.4 приращения емкости были положительны и не зависели от частоты. При наличии Na+ приращения емкости на всех частотах были несколько выше, чем в безнатриевой среде (на самом деле, в отсутствие NaCl концентрация ионов натрия не равнялась нулю, а составляла около 0.3 мМ из-за того, что использовалась натриевая соль Caged-H+).
При рН=7.65 (и с натрием, и без) также существовало плато на частотах ниже 100 Гц, но на частотах ниже 10 Гц появлялось заметное увеличение приращений емкости. В этих условиях добавка натрия почти не меняла частотные зависимости приращений емкости.
При более высоком рН, 7.9, изменения емкости вследствие фотолиза MNPS почти линейно падали с частотой, добавка натрия вызывала лишь очень малое их уменьшение.
При самом высоком рН, при котором проводились измерения (8.05), на частотных зависимостях приращений емкости в области промежуточных частот (30-100 Гц) наблюдалось плато, выше и ниже емкость падала с частотой. Добавка натрия приводила к заметному уменьшению приращений емкости.
Зависимости от частоты приращений емкости, вызванных закислением среды при фотолизе MNPSNa на мембране с адсорбированными МФ с Na+,K+-ATФазой в среде без NaCl (черные квадраты) и после добавления 10 mM NaCl (красные кружки) при разных рН, значения которых указаны на подписях Состав раствора – 12 мM NMG, 10 мM MgCl2, 0.14 мM ЭДTA.
Согласно данным, приведенным на рис. 27 при pH=7.4, приращения емкости не зависят от частоты. В экспериментах с другими значениями рН зависимость от частоты наблюдалась, но в области высоких частот, где точность измерения емкости уменьшается, поскольку частотные зависимости приходилось корректировать, чтобы учесть их искажения, вызванные наличием сопротивления электродов раствора, из-за которого на высоких частотах измерительная схема действовала как фильтр, значительно ослабляя величину измеряемого переменного тока. В любом случае, полученные результаты говорят о том, что характерная частота, при которой может происходить спад емкости, достаточно высока (около 1000 Гц или выше). Этим данные частотные зависимости существенно отличаются от зависимостей, полученных при измерениях приращений емкости, вызванных освобождением АТФ (Sokolov et al, 2008, а также рис. 18-19). В случае транспорта третьего иона натрия во внеклеточном канале доступа низкую скорость процесса связывали с тем, что этот транспорт сопряжен с конформационным переходом E1-E2. Как мы показали, в случае протона скорость действительно высока, поэтому конформационного перехода E1-E2, связанного с транспортом протона, нет. Перемещение третьего иона натрия в цитоплазматическом канале доступа, согласно Sokolov, 2008, приводит к изменению емкости, зависящему от частоты, с характерной частотой (при которой происходит уменьшение приращения емкости в 2 раза) примерно 600 Гц. Поскольку транспорт осуществляется в конформации E1, авторы связывают не очень высокую скорость переноса третьего натрия с существованием потенциального барьера для него в канале доступа. Возможная более высокая скорость транспорта протона может быть объяснена как его малыми размерами, позволяющими ему переноситься несколько иным путем из цитоплазмы к сайтам связывания, или легче преодолевать потенциальные барьеры в канале доступа, так и переносом по механизму Гротхуса.
В дальнейших экспериментах, для более подробного исследования влияния ионов натрия на приращение емкости, вызванное скачком рН, были проведены эксперименты, в которых измерения проводились на одной частоте (64 Гц) при постепенном повышении концентрации ионов натрия (рис. 28).
Приращения емкости, вызванные фотолизом MNPS, на частоте 64 Гц при разных концентрациях ионов натрия в присутствии (светлые точки) и в отсутствие (темные точки)10 мкМ ванадата. Состав раствора – 12 мМ NMG, 0.14 мМ EDТА, рН 8.
Этот эффект ионов натрия определяется функционированием Na+,K+-АТФазы, что подтверждают контрольные опыты. Прежде всего, в отсутствие Na+,K+-АТФазы добавление хлористого натрия в интервале концентраций до 10 мМ не влияло на изменение емкости мембраны при фотолизе Caged-H+ (рис. 26). Этот контроль нельзя считать идеальным, поскольку изменение емкости на чистых БЛМ вызван, вероятнее всего, протонированием фосфолипидов, а липидный состав фрагментов мембран, в которые встроена Na+,K+-АТФаза, отличается от липидов, из которых сформирована БЛМ. Поэтому проводились эксперименты, в которых фрагменты мембран были адсорбированы на БЛМ, но Na+,K+-АТФаза ингибировалась ванадатом. Известно, что ванадат ингибирует электрогенный транспорт натрия в цитоплазматическом канале Na+,K+-АТФазы (Pintschovius et al., 1999). В присутствии этого ингибитора влияние ионов натрия на приращения емкости при фотолизе caged-H+ было незначительным, и в пределах точности измерений им можно пренебречь (рис. 28).
Эксперименты по влиянию ионов натрия на изменение емкости на мембране с Na+,K+-АТФазой при скачке рН были проведены при нескольких значениях начального рН (от 7 до 8). При всех значениях рН приращения емкости выходили на плато при концентрации Na+ 3-4 мМ. Количественный эффект ионов натрия на изменение емкости при частоте 64 Гц и всех значениях рН определяли как разность между значениями на плато и при 0 мМ Na+. На рис. 29 приведена зависимость этой разности от рН. Для того, чтобы уменьшить разброс экспериментальных данных, полученных на разных мембранах, измеренные приращения емкости нормировали на начальное значение емкости мембраны (поскольку емкость пропорциональна площади бислоя, это аналогично нормировке на площадь). Как видно из рис. 29, зависимость эффекта ионов натрия от рН имеет немонотонный вид. При низких значениях рН эффект ионов натрия был положительным (при введении NaCl приращения емкости, вызванные фотолизом caged-H+, увеличиваются), а при высоких рН эффект становится отрицательным (т.е. приращения емкости в присутствии NaCl уменьшаются).
