Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Механизмы клеточной гибели 10
1.1.1 Апоптоз 10
1.1.2 Аутофагическая клеточная смерть 25
1.1.3 Некроз 33
1.1.4 Нетоз 36
1.1.5 Корнификация 36
1.1.6 Митотическая катастрофа 37
117 Энтоз 41
1.1.8 Партанотоз 41
1.2. Механизмы действия противоопухолевых препаратов нитрозоалкилмочевин
Глава 2. Материалы и методы исследования 54
2.1. Материалы и реактивы 54
2.2. Оборудование 55
2.3. Методы исследования 56
2.3.1. Клеточные линии и их культивирование . 56
2.3.2. Изучение цитотоксического действия препаратов методом 56 МТТ - тест
2.3.3. Метод двойного прижизненного окрашивания ДНК с 58 использованием Аннексина V-FITC в комбинации с PI
2.3.4. Прямая реакция иммунофлуоресценции (РИФ) 58
2.3.5. Проточно-цитофлуориметрический анализ 59
2.3.6. Определение уровня экспрессии мРНК Beclin1 . 60
2.3.7. Определение мРНК mFas и sFas 60
2.3.8. Статистическая обработка результатов 62
Глава 3. Результаты исследований 63
3.1. Исследование фенотипа клеточных линий меланомы 63
3.1.1. Статус CD95/Fas рецептора 63
3.1.2. Статус MDR1 гена 67
3.2. Цитотоксическое действие двух лекарственных форм производных нитрозометилмочевины на меланомные клеточные линии
3.2.1. Лиофилизированная араноза 73
3.2.2. Липосомальная араноза 78
3.3. Определение статистической значимости различий в проценте живых клеток после инкубации клеток с двумя лекарственными формами аранозы
3.4. Цитотоксическое действие двух лекарственных форм OR-2011 102
на меланомные клеточные линии
3.5. Влияние двух лекарственных форм аранозы на индукцию 110
апоптоза в клеточных линиях меланомы человека
3.6.Преодоление множественной лекарственной устойчивости 119
липосомальной аранозой
Глава 4. Обсуждение результатов исследований 122
Выводы 125
Список литературы
- Аутофагическая клеточная смерть
- Клеточные линии и их культивирование
- Цитотоксическое действие двух лекарственных форм производных нитрозометилмочевины на меланомные клеточные линии
- Определение статистической значимости различий в проценте живых клеток после инкубации клеток с двумя лекарственными формами аранозы
Аутофагическая клеточная смерть
Первые попытки классификации типов клеточной смерти были предприняты в середине 60-х годов. Так, в 1973 г. Schweichel и Merker предложили первую классификацию клеточной смерти: первый тип клеточной смерти ассоциирован с гетерофагией, второй тип ассоциирован с аутофагией и третий тип не связан был ни с каким типом. Эти формы клеточной смерти соответствовали апоптозу, аутофагической клеточной смерти и некрозу соответственно [96; 97; 124]. Классификацией типов клеточной смерти занимался номенклатурный комитет по клеточной смерти (Nomenclature Committee on Cell Death, NCCD) в 2005, 2009 и 2012 гг. Он обозначил несколько вариантов клеточной смерти. Помимо этих трх, ставших классическими, типов клеточной смерти в настоящее время охарактеризовано также много других. Подробнее каждый из этих типов клеточной смерти рассмотрены ниже.
Апоптоз - (от греч. «» – отделение и «» – падение) генетически запрограммированная гибель клеток, которая приводит к «аккуратной» разборке и удалению клеток [23].
Апоптоз – многофазный процесс. На первом этапе (инициаторная фаза) происходит инициация и трансдукция проапоптотического сигнала. Индукторами запрограммированной гибели могут выступать самые различные факторы, такие как белковые продукты протоонкогенов, молекулы – лиганды мембранных рецепторов смерти, радиация, цитотоксические лекарственные препараты, вирусы и др. Большое количество белков участвуют в апоптозе. В зависимости от их функций их делят на две группы: белки-триггеры и белки-модуляторы. Белки-модуляторы участвуют в трансдукции «сигнала смерти». Триггеры участвуют в индукции проапоптотического сигнала (например, белки из семейства фактора некроза опухолей, Т- и В-клеточные рецепторы). За инициацией следует эффекторная фаза, в ходе которой происходит активация каспазной системы клетки. Вслед за эффекторной наступает фаза деградации клетки, характеризующаяся деструкцией клеточного материала [45]. Морфологическими признаками этого активного процесса являются переход фосфатидилсерина из внутреннего монослоя цитоплазматической мембраны в наружный монослой [48], уменьшение клетки в объеме, мембрана теряет микроворсинки и нормальную складчатость, образует пузыревидные вздутия («отшнуровывание» пузырьков, так называемых апоптотических телец), распад клеточного ядра, уплотнение хроматина и фрагментация ДНК. Сначала образуются крупные фрагменты ДНК по 30 000 – 700 000 пар оснований. Затем происходит межнуклеосомная деградация ДНК, т.е. ее расщепление в результате формирования разрывов между нуклеосомами с формированием фрагментов, содержащих 180-190 пар оснований. Эти фрагменты выявляются при горизонтальном электрофорезе в агарозном геле в виде «ДНК-овой лестницы» - отдельных полос, соответствующих дискретности по молекулярной массе образующихся фрагментов ДНК [3; 4; 18; 23]. Апоптотические тельца фагоцитируются очень быстро, так как на их поверхности экспрессируются молекулы, распознаваемые фагоцитирующими клетками: тромбоспондин, фосфолипиды, содержащие фосфатидилсерин, гликоконъюгаты, содержащие концевой -D-N-ацетилглюкозамин, витронектин. Процессу фагоцитоза способствует также инактивация на поверхности умирающих клеток молекул типа CD31, необходимых для распознавания не подлежащих поглощению жизнеспособных клеток [4; 49; 156]. Клетки, подвергшиеся апоптозу, распознаются макрофагами и другими фагоцитирующими клетками и быстро элиминируются. Морфологически регистрируемый процесс апоптоза продолжается 1—3 часа. Очень важно то, что при апоптозе не развивается воспалительный процесс. Апоптоз является способом самоуничтожения клетки, который генетически запрограммирован и включается в нужное время и с нужной интенсивностью. В отличие от некроза апоптоз для своего развития требует наличия АТФ, т. е. является энергозависимым процессом расщепления ДНК эндогенными эндонуклеазами, при этом лизосомы остаются интактными.
Посредством апоптоза организм избавляется от ненужных, или «отработавших», клеток, например во время эмбрионального развития, при формировании нервной системы и при иммунном ответе. Путем апоптоза элиминируются трансформированные клетки, например при канцерогенной дегенерации, вирусной инфекции или необратимом повреждении ДНК в случае облучения [4; 20; 23; 26; 158 ].
Внешний апоптоз Термин «Внешний апоптоз» сейчас используется для обозначения клеточной смерти, которая индуцируется внеклеточными сигналами, специфическими к трансмембранным рецепторам [97; 149; 197]. «Рецепторы смерти» представляют собой трансмембранные белки, для которых характерно наличие в цитоплазматической части молекулы участка размером около 80 аминокислотных остатков. Данная последовательность называется «доменом смерти» (death domain- DD) и необходима для трансдукции сигнала апоптоза [31]. В качестве таких сигналов выступают специфические внеклеточные лиганды, которые связываются со своим рецептором клеточной гибели, экспрессированным на поверхности клеточной мембраны и активируют соответствующий сигнал смерти. Известно пять сигнальных путей внешнего апоптоза и их рецепторы. Это FAS/CD95 и его лиганд (FASL/CD95L), рецептор опухоленекротического фактора альфа TNFR1 и его лиганд, TRAILR и его лиганд (TNFS10, 10 член суперсемейства лигандов TNF) [31; 197]. Кроме того, внешний проапоптотический сигнал может быть послан через так называемые «зависимые рецепторы». Например, через нетриновые рецепторы UNC 5A и DCC, которые проявляют свою внешнюю летальную функцию только тогда, когда концентрация их специфического лиганда падает ниже порогового уровня [149; 159].
Клеточные линии и их культивирование
Длительное время некроз рассматривали лишь как вариант неспецифической гибели клетки. Фактической причиной гибели при некрозе считают резкое падение содержания АТФ в клетках до такого уровня, который не совместим с жизнью [90; 94]. Наиболее принципиальным достижением в изучении программируемой гибели клетки явилось установление программируемого характера биохимических изменений, приводящих к некрозу [43; 137; 162; 171]. В связи с этим, в современной классификации программированной смерти клетки (ПСК) апоптоз получил название «ПСК I типа», аутофагия «ПСК II типа», а некроз «ПСК III типа». Установлено, что некроз может происходить не только как итог апоптоза в ситуации энергодефицита клетки, что было известно довольно давно [94], но и как самостоятельная танатогенная программа, ключевую роль в которой играют белок PARP, индукторы митохондриального окислительного стресса, протеаза omi, а также некоторые каспазы и ряд других ферментов [43; 68; 137; 162; 171].
Долгое время некроз рассматривался только как механизм клеточной смерти в отсутствии морфологических признаков апоптоза [98; 99; 126].
Однако теперь стало ясно, что некроз появляется регулируемым образом и некротическая клеточная смерть играет заметную роль при многих физиологических и патологических состояниях. Некроз участвует в патогенезе заболеваний, в том числе ишемического повреждения, нейродегенерации и вирусной инфекции, таким образом представляя привлекательной мишенью для избежания необоснованной гибели клеток [192].
Ругулируемый некроз появляется в результате цепи событий. В результате связывания опухоле-некротического фактора альфа (TNF-альфа) и цитоплазматического хвоста опухоле-некротического рецептора первого типа (TNFR1) прототипа рецептора смерти, происходит тримеризация TNFR-ассоциированного домена смерти (TRADD), рецептор связывающего белка киназа 1 (RIP1), клеточных ингибиторов апоптоза 1 (cIAP1) и cIAP2, TNFR-ассоциированных факторов 2 (TRAF2) и TRAF5. В результате образуется мультибелковый комплекс. Затем RIP1 совместно с cIAP1 и cIAP2 готовит места для рекрутирования киназы 1 трансформирующего рост фактора бета (ТАК1), ТАК1-связывающих белков 1 (ТАВ2) и ТАВ3. ТАВ2 и ТАВ3 вместе обеспечивают выживающий сигнал путем активациитранскрипционного фактора NF-kB. В некоторых патофизиологических и экспериментальных ситуациях, или в результате отсутствия каспазы 8, RIP1 переходит в физическое и функциональное взаимодействие с ее гомологом RIP3 окончательно активируя выполнение некротической смерти. Регулируемый некроз также может быть индуцирован алкилирующим повреждением ДНК [111, 204]. Возможно, это происходит в результате повышения активности poly(ADP-ribosa) полимеразы 1. Этот процесс также реализуется через RIP3 [99; 193].
Морфологическими признаками некроза является набухание клеток и их мембранных органелл, неспецифическая компактизация хроматина, вакуолизация цитоплазмы, нарушение целостности плазматической мембраны и выход содержимого клеток во внеклеточное пространство. В итоге в многоклеточном организме в области некроза развивается воспалительная реакция [49].
Индуцировать программу некроза можно, если активировать программу апоптоза связыванием таких лигандов как Fas, TRAIL или вызывая гиперэкспрессию проапоптотического белка Bax, и в тоже время либо ингибируя активность каспаз, либо вызывая гиперэкспрессию антиапоптотических белков. Программированный некроз в свою очередь может быть подавлен, если на клетки воздействовать антиоксидантами либо подавить активность протеинкиназы RIP [113]. Интересно, что протеинкиназа RIP является одной из мишеней действия каспаз. Это означает, что инициация и осуществление апоптоза активно подавляют развитие некроза в клетках. Физиологическое значение такого противоборства между апоптозом и программированным некрозом проявляется на двух системах. На клетках, инфицированных вирусом vaccinia virus, программированный некроз может быть не только вариантом гибели в условиях подавления апоптоза, но и выполнять функцию усиления иммунных реакций в ответ на инфицирование микроорганизмами. Отрицательная связь между апоптозом и программированным некрозом прослеживается и при повреждении ДНК, вызванном химическими агентами или ионизирующим излучением. В неопухолевых клетках в этих случаях включаются пункты проверки, действующие во всех фазах интерфазы клеточного цикла и предотвращающие вступление в митоз клеток с нарушенным геномом [49; 163;174].
В случае нарушения механизмов репарации клетки погибают путем апоптоза. Однако, как оказалось, если в таких клетках с поврежденной ДНК нарушены механизмы осуществления апоптоза, что является достаточно распространенным в трансформированных клетках, клетки погибают путем программированного некроза. Физиологическое значение некроза в такой ситуации имеет двоякий смысл. С одной стороны программированная гибель клеток путем некроза в отсутствие апоптоза все же снижает риск передачи дочерним клеткам мутаций [49; 90]. С другой стороны, распад клеток при некрозе может способствовать активации иммунного ответа многоклеточного организма [49].
Цитотоксическое действие двух лекарственных форм производных нитрозометилмочевины на меланомные клеточные линии
Клетки выращивали в 6-луночных планшетах (Costar) в среде RPMI-1640 c 10% ТЭС. В лунки засевали по 2 мл клеточной суспензии, содержащей 1 105 клеток/мл. Через сутки в лунки с клетками добавляли традиционную лекарственную форму аранозы и липосомальную аранозу в концентрации 450 мг/мл и 900 мг/мл. В контрольных лунках клетки оставались без препаратов. Через 24 ч инкубации клетки из лунок снимали раствором Версена в пробирки со средой, в которой они росли, и осаждали центрифугированием 5 минут при 1000 оборотов/минуту. Затем клетки отмывали, после чего помещали в пробирки по 250-500 тыс. клеток на пробирку в 100 мкл аннексин-связывающего буфера. В пробирки добавляли по 5 мкл Аннексин V-FITC и 5мкл пропидий йодид. Образцы инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут. Далее к пробам добавляли 400 мкл аннексин-связывающего буфера и проводили анализ на проточном цитофлуориметре.
Прямая реакция иммунофлуоресценции (РИФ) Экспрессию CD95 антигена исследовали в реакции поверхностной иммунофлуоресценции. Для осуществления прямой реакции поверхностной иммунофлуоресценции в пробирки с 50 мкл клеток в количестве 500 тыс. на пробирку добавляли моноклональные антитела CD95, меченные фикоэритрином (PE) по 10 мкл, затем инкбуировали в течение 30 мин при t 4 C, затем клетки дважды отмывали РВS и анализировали методом проточной цитофлуориметрии. 2.3.5. Проточно-цитофлуориметрический анализ
Метод позволяет анализировать параметры клеточного цикла, ранний апоптоз, наличие клеточных рецепторов. Проточно-цитофлуориметрический анализ проводили на проточном цитофлуориметре FACSCantoII (Becton Dickinson, США).
Клетки анализировали на основе параметров, измеряемых проточной цитометрией. Клетки в момент прохождения через луч лазера рассеивают свет во всех направлениях и испускают небольшое количество света за счет флуоресценции. Размер и форму клеток определяет прямое рассеивание света (FCS) – количество света в направлении лазерного пучка под углом 0, тогда как боковое рассеивание (SSC) – под углом 90 по отношению к лазерному пучку определяет структурные особенности различных популяций клеток. На цитограмме устанавливали соответствующее окно дискриминации (гейт), в котором на основании SSC и FCS вырезали основной пул клеток с целью удаления крупных (агрегаты) частиц и мелких (дебрис) частиц. Интенсивность флуоресценции проводилась с учетом анализа гистограмм. На гистограммах по оси Y отображено число событий (число клеток), а по оси X – интенсивность флуоресценции. В зависимости от цели исследования в каждом образце накапливали не менее 5–10 тысяч событий. Длина волны для красной флуоресценции (РI) устанавливалась в канале РЕ флуоресценции (585/42 нм), а длина волны для зеленой флуоресценции устанавливалась в канале FITC (530/30 нм). Данные получали в логарифмическом измерении для обоих каналов. Анализ апоптотических клеток, окрашенных Annexin V – FITC/PI, основывался на регистрации клеток ранний апоптоз Annexin V – FITC + PI и поздний апоптоз Annexin V – FITC + PI+ .
При анализе двойного окрашивания клеток в режиме «dot plot» Аннексином V-FITC в сочетании с PI были получены данные в логарифмическом измерении для обоих каналов FITC и РЕ. 2.3.6. Определение уровня экспрессии мРНК Beclin1
Клетки клеточных линий меланомы кожи mel Z, mel Kor, mel Mtp, mel Ibr сажали по 2105 в дуплетах на 6-луночные планшеты в полной среде. Через 24 часа к клеткам добавляли аранозу в концентрации 450 мг/мл и липосомальную форму аранозы в той же концентрации и инкубировали в течение 24 часов.
Детекцию экспрессии мРНК Beclin1 определяли с помощью ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Через 24 ч после культивирования с химиопрепаратами клетки лизировали, используя реагент TRIzol (Sigma, США). Из лизата опухолевых клеток выделяли тотальную РНК в системе хлороформ-изопропиловый спирт (Sigma, США). Обратную транскрипцию проводили в соответствии со стандартным протоколом [82]. Реакцию проводили в амплификаторе «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) по программе: 24 С – 10 мин, 42 С – 50 мин и 70 С – 15 мин. Использовали следующие праймеры для гена Beclin1 F: 5`-AAGACAGAGCGATGGTAG-3` и R:5`-CTGGGCTGTGGTAAGTAA-3` (продукт 282 н.п.); для beta-Actin F: 5 -GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 и R: 5 -CTCCTTAATGTCACGCAC-GATTTC-3 (продукт 460 н.п.). Условия амплификации: предварительная обработка – 94С – 2 мин; денатурация ДНК – 94 С – 30 с; отжиг праймеров – 62 С – 30 с; элонгация – 72 С – 1 мин (для Beclin1, 26 циклов), а также 94 С – 2 мин; 94 С – 20 с; 60 С – 20 с; 72 С – 45 с (для beta-Actin, 24 цикла). Продукты амплификации анализировали после электрофореза в 1,5% агарозном геле (Хеликон, Россия), содержащем бромистый этидий (Serva, Германия) в стандартной концентрации. Уровень экспрессии Beclin1 оценивали в относительных единицах оптической плотности (о.е.) с помощью программы «ImageJ» по отношению к уровню beta-Actin.
Определение статистической значимости различий в проценте живых клеток после инкубации клеток с двумя лекарственными формами аранозы
Сравнение чувствительности клеточных линий к цитотоксическому действию аранозы показало, что наибольшую цитотоксичность вызывала араноза в клетках mel Kor. Эти клетки сохраняли рецептор CD95/Fas и не экспрессировали pgp170. Эти клетки могут служить как положительный контроль. В связи с этим мы сравнили статистическую значимость различий в чувствительности клеточных линий к апоптозу по сравнению с этой линией. Кроме того, было проверено различие между линиями. Было обнаружено, что клетки mel Kor отличались по чувствительности к аранозе от других клеток (Рис.4). Наиболее существенные различия были с клетками линии mel Z. Статистически значимые различия были при инкубации в течение 48 ч с концентрацией аранозы 0,45 мг/мл ( P 0,02), 0,112 мг/мл (P 0,044), 0,056 мг/мл (P 0,006) и при 72 ч инкубации с концентрацией 0,056 мг/мл (Р 0,001). Как видно, эффект был значимым при низких концентрациях препарата. Тем не менее, он подтверждает утверждение, что отсутствие рецептора CD95/Fas на поверхностной мембране делает клетки более резистентными к противоопухолевым препаратам.
Сравнение чувствительности к аранозе клеток mel Kor и mel Mtp clone X выявило статистически значимые различия при 48 ч инкубации с концентрацией 0,45 мг/мл (P 0,049).
Похожие результаты получили при сравнении чувствительности к аранозе клеток mel Kor и mel Mtp и выявили статистически значимые различия при 48 ч инкубации с концентрацией 0,45 мг/мл (P 0,042).
При сравнении чувствительности к аранозе клеток линии mel Ibr, в 50 % клеток которой гиперэкспрессирован ген MDR1, с MDR1- отрицательными клетками mel Kor обнаружили, что они статистически значимо устойчивы при инкубации в течение 72 ч с концентрациями препарата 0,112 и 0,056 мг/мл (P 0,026 и 0,024 соотвественно).
Таким образом, можно сделать заключение, что клетки линий mel Z, mel Mtp и mel Mtp clone X (у всех клеток отсутствует рецептор CD95/Fas) более
Проведенное исследование показало, что клетки линий меланомы кожи различаются по чувствительности к цитотоксическому действию аранозы. Наиболее чувствительные клетки линии mel Kor, которые экспрессируют рецептор CD95 и у которых не гиперэкспрессирован ген MDR1.
Липосомальная араноза более эффективна по сравнению с лиофилизированной лекарственной формой и на ее цитотоксическое действие не влияет ни отсутствие CD95/Fas рецептора, ни гиперэкспрессия гена множественной лекарственной устойчивости. 101Клетки mel Ibr также были чувствительны к действию лиофилизированной аранозы при инкубации в течение 48 и 72 ч. ИК50 была 0,9 и 0,45 мг/мл соответственно. После 24 ч ИК50 не была достигнута (Табл.13). Липосомальная араноза также не оказывала действие при инкубации в течение 24 ч. Однако, в дальнейшем она оказывала более значимые эффекты по сравнению с лиофилизированной аранозой.
Таким образом, сравнение цитотоксического действия двух лекарственных форм аранозы показало, что липосомальная араноза более эффективна и на ее цитотоксическое действие не влияет ни отсутствие CD95/Fas рецептора, ни гиперэкспрессия гена множественной лекарственной устойчивости (Табл. 17).
Вывод: Липосомальная араноза более эффективна по сравнению с лиофилизированной лекарственной формой и на ее цитотоксическое действие не влияет ни отсутствие CD95/Fas рецептора, ни гиперэкспрессия гена множественной лекарственной устойчивости.
Результаты сравнения процента выживших клеток меланомы линии mel Mtp представлены в (Рис. 11, Табл.14). Как видно из таблицы, через 24 ч липосомальная араноза в концентрациях 0,9 и 0,45 мг/мл статистически значимо сильнее оказывала цитотоксическое действие на эти клетки. При других концентрациях статистически значимых различий не обнаружили.
Через 48 ч липосомальная араноза оказывала статистически значимое большее цитотоксическое действие по сравнению с лиофилизированной аранозой почти во всех концентрациях (Рис. 11, Табл.14). Однако через 72 ч эти различия стали статистически не значимы.
Таким образом можно сделать вывод, что липосомальная араноза оказывает более сильное цитотоксическое действие на CD95/Fas отрицательные клетки по сравнению с лиофилизированной аранозой при инкубации в течение 48 ч.
Результаты сравнения процента выживших клеток меланомы линии mel Z представлены в (Рис. 12, Табл. 15). Как видно из таблицы, через 24 ч обе лекарственные формы аранозы были неактивны и ИК50 не была достигнута. Через 48 ч ИК50 для лиофилизированной аранозы не было достигнута, а для липосомальной аранозы она составила 0,716 мг/мл. Статистически значимые различия были при концентрациях 0,112 и 0,056 мг/мл. Через 72 ч было выявлено статистически значимое различие в тех же концентрациях. Из этого можно заключить, что различия в эффективности липосомальной аранозы проявляются при низких концентрациях препарата. Результаты сравнения процента выживших клеток меланомы линии mel Kor представлены в (Рис. 13, Табл.16). Как видно из таблицы, эффект обеих лекарственных форм аранозы статистически значимо не различался. Аналогичные результаты получили при использовании клеток меланомы линии mel Ibr. Эффект обеих лекарственных форм аранозы статистически значимо не различался (Рис. 14, Табл. 17).
![Оценка гипотензивной, органопротективной и метаболической эффективности и безопасности различных групп гипотензивных препаратов [Электронный ресурс]](/i/i/4260/197708.png "Оценка гипотензивной, органопротективной и метаболической эффективности и безопасности различных групп гипотензивных препаратов [Электронный ресурс] Демидова Мария Андреевна")