Введение к работе
Актуальность темы
I. Множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток:
биологические механизмы и значение в онкологии.
Несмотря на значительные достижения фармакологии, в том числе развитие ехнологай создания лекарств с ожидаемыми свойствами, успехи химиотерапии пухолей ограничены важнейшей особенностью живых систем — способностью датироваться к изменеіпіям внешней среды. Одно из проявлений такой дастичности - развитие устойчивости опухолевых клеток к препаратам, [спользуемым в химиотерапии. Широкая распространегаюсть и долговременный, стойчивый характер адаптации клеток к внешним воздействиям предполагают, то преодоление лекарственной устойчивости может быть связано не только с оиском более эффективных препаратов: вероятно, нет лекарства, к которому летки не были бы способны развивать устойчивость. Только выяснение нологических механизмов резистентности к различным видам стресса послужит «новой для разработки стратегий преодоления лекарственной устойчивости -еобходимого условия повышения эффективности лечения онкологических ольных.
Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) новообразований — охранение опухолевыми клетками жизнеспособности в ответ на воздействие азличных лекарственных веществ — одна из основных причин прогрессировать! олезни: опухоль нечувствительна к химиотерапии независимо от комбинации рименяемых лекарств. Феномен МЛУ имеет долговременный и стабильный арактер: механизмы резистентности наследуются в поколениях клеток. Таким бразом, МЛУ - один из ключевых факторов прогрессии опухоли.
Различают два основных вида устойчивости клеток к токсинам. Первичная г.е. наблюдающаяся до воздействия химиопрспаратов) устойчивость обусловлена кспрессией механизмов защиты при прогрессии опухоли. Так, активация
антиапоптотических механизмов, обусловливающая устойчивость к эффектора иммунитета, может иметь отношение к резистентности к лекарственным препаратам. Вторичная (приобретенная) устойчивость возникает в клетках, подвергнутых стрессовым воздействиям. До этих воздействий механизмы защ в таких клетках экспрессированы слабо или отсутствуют; выживая после обработки одним токсином, клетки приобретают резистентность ко многим веществам —МЛУ (Riordan, Ling, 1985). Дальнейший отбор закрепляет приобретенный фенотип в поколениях клеток.
Важнейшим механизмом МЛУ является пониженное накопление токсин» клетке, обусловленное выведением веществ в межклеточную среду. Такой транспорт осуществляется интегральным белком плазматической мембраны Р-гликопротеином (Pgp) за счет энергии гидролиза АТФ (Juliano, Ling, 1984)."! человека Pgp кодируется геном MDRI (multidrug resistance 1), локализованным хромосоме 7 (Chen et al., 1986). Многочисленные данные свидетельствуют о т( что увеличение иРНК MDRI и Pgp часто служит фактором устойчивости мноп типов опухолей к лечению (Linn et al., 1995; Stavrovskaya et al., 1998).
II. Становление МЛУ в опухолевых клетках: биологические механизмы как мишени для профилактики
Правомерно предположить, что повышение количества иРНК MDRI обусловлено амплификацией этого гена. Такой механизм МЛУ выявлен в культивируемых линиях клеток, прошедших селекцию на выживание в присутствии токсинов (Roninson, 1991). Однако при анализе опухолей человек амплификация гена MDR1 не обнаружена ни в первичных опухолях, ни в новообразованиях после лечения. Вероятная прігчина клинической МЛУ — гиперэкспрессия MDRI и Pgp при неизмененной структуре гена (сохранении копийности инуклеотидной последовательности), т.е. эпигенетическая активаї фенотипа. В культурах опухолевых клеток человека повышение уровня иРНК MDRI и количества Pgp отмечено при однократной обработке химиопрепарата
яличными по химической структуре и механизмам действия (Chaudhary, aninson, 1993). Получены доказательства накопления иРНК MDR\ в метастазах ркомы в легочную ткань уже через 20-50 мин после начала интраоперационной :рфузии легких доксорубицином (Abolhoda et al., 1999). Эти результаты (дтверждшот возможность эпигенетической активации МЛУ в эксперименте и [инических ситуациях: повышение иРНК MDR\ и Pgp в опухолях может юисходить без амплификации гена MDRI.
Такой тип биологической регуляции — срочная активация фенотипа — іедусматривает индукцию транскрипции гена (генов), кодирующего ответствующий фенотип, и/или посттранскрипционный контроль (стабилизация 'НК, регуляция синтеза и функционирования белка). Применительно к МЛУ азашшй тип регуляции означает возможность индукции гена MDR\ іеклеточньїми стимулами и относительно быстрое становление резистентности в r/холевых клетках в ответ на стресс. Индуцибельность гена MDRI предполагает тивацгао путей передачи сигналов от периферии клетки к ядру. Такими путями )гли бы быть стресс-реализующие сигнальные механизмы: протеинкиназа С ІКС), фосфолипазы и внутриклеточный Са2+, митогенактивируемые ютеинкиназы, ядерный фактор каппа В (NFkB). Передача сигналов к гуляторной области гена MDRI и транскрипту обеспечивает активацию спрессии гена.
Исследование регуляции МЛУ имеет и принципиальный практический пект. Ингибирование этих механизмов с помощью фармакологических и/или нетических воздействий позволило бы предотвратить развитие МЛУ в процессе [миотерагаш.
III. Преодоление сформировавшейся МЛУ опухолевых клеток.
Если блокирование активирующих ген MDR\ сигналов может едотвратить становление МЛУ в первично чувствотелышх клетках, то такой
подход неприменим для преодоления уже сформировавшейся резистентности. Традиционным методом борьбы с вторичной МЛУ является использование модуляторов Pgp в комбинации с цитостатиками (Lehne, 2000). Однако использование ингибиторов Pgp ограничено побочными явлениями (нарушения ритма сердца, иммунологический дисбаланс). Не менее важно, что эффективное комбинаций модулятор+щггостатик может быть снижена из-за блокирования по крайней мере некоторых механизмов клеточной смерти при селекции на МЛУ.
Преодоление сформировавшейся МЛУ достижимо при выполнении двух условий: 1) концентрация лекарственного препарата должна быть достаточна дл активации эффекторных механизмов гибели клетки, 2) функции этих механизмо должны быть сохранены в клетках с МЛУ. Первое условие выполняется, если препарат преодолевает барьер Pgp. Однако требуется доказать, что достижение критической внутриклеточной концентрации агента достаточно для активации гибели клетки, резистентной ко многим воздействиям. Механизмы выживания, функционирующие в резистентных клетках, должны служить мишенями для элиминации последних.
Для реализации второго условия представляются перспективными подход направленные на лизис резистентных клеток как механизм индукции их гибели. Вакцинация мышей клетками сингенной миеломы, трансфецированными кДНК некоторых цитокинов, приводит к развитию опосредованного цитотоксическимі Т-лимфоцитами (ЦТЛ) иммунного ответа и отторжению прививаемой опухоли} иммунизированных животных (Dranoff et al., 1993; Levitsky et al., 1996). ЦТЛ лизируют клетки с помощью гранзима В и перфорина. Поскольку гранзим В активирует каспазу 3 - один из дистальных эффекторов апоптоза, а перфорин вызывает первичное повреждение плазматической мембраны (некроз), можно надеяться, что ЩЛ будут эффективны, если проксимальные механизмы гибели блокированы; запуск дистальных звеньев апоптоза в комбинации с некрозом
риведет к гибели клеток, устойчивых к противоопухолевым препаратам -адукторам программированной клеточной гибели.
Постановка проблемы
МЛУ - клинически неблагоприятный феномен, преодоление которого эебует знания механизмов его развития и путей реализации клеточной гибели, ребуется исследовать оба аспекта проблемы. Во-первых, необходимо изучить еханизмы становления МЛУ в MD/? l/Pgp-негативных клетках человека, сследование этих механгомов послужит прєдотвращешпо развития устойчивости первично чувствительных клетках. Во-вторых, анализ процессов гибели, ункционирующих в клетках с МЛУ, создаст основу для преодоления їзистентности в ситуациях, когда сформировалась вторичная МЛУ.
Цель исследования - установление механгомов срочного становлення [ЛУ в опухолевых клетках человека и разработка подходов к преодолешпо этого їда устойчивости.
Задачи:
-
Оптимизировать модели становления МЛУ в культурах опухолевых клеток человека в ответ на воздействие химиопрепаратов и экспериментальных агонистов и антагонистов сигнальных механизмов.
-
Определить основної! механизм срочного развития МЛУ при обработке клеток противоопухолевыми агентами: амплификация гена MDRI, селекция Pgp-позитивных клеток или гащукция МЛУ de novo.
-
Исследовать пути передачи внутриклеточных сигналов, регулирующих активацию МЛУ - протеинкиназа С, фосфолипаза С, вігутриклеточньїй Са +, митоген-активируемые протеинкиназы, NFkB).
-
Выявить роль транскрішционной активашш и посттранскрігпциошюй регуляции (стабильность иРНК) экспрессии гена MDRI в срочном становлешш МЛУ в ответ на воздействие химиопрепаратов.
-
Разработать способы предотвращения развития МЛУ в опухолевых клетках при комбинировании химиопрепаратов с блокаторами MDR\-активирующих сигнальных путей и ингибиторами генной транскрипцип
-
Исследовать кинетику активации шшциирующих и эффекторных каспа изменения трансмембранного потенциала митохондрий, протеолитического расщепления поли(АДФ)рибозо-полимеразы, межнуклеосомной фрагментации ДНК и целостности плазма-тической мембраны в родительских клетках и вариантах с МЛУ при обработке препаратом, не транспортируемым Р-гликопротеином.
-
Использовать вакцинацию опухолевыми клетками, экспрессирующими цитокины, для генерирования иммунного ответа против клеток с МЛУ.
Положения, выносимые на защиту.
-
Становление Pgp-опосредованной МЛУ - срочная реакция клетки на многие воздействия - опосредовано эпигенетической активацией гена MDRI. Эта активация обусловлена многочисленными механизмами передачи внутриклеточных сигналов, индукцией промотора гена и стабилизацией иРНК и может быть предотвращена ингибиторами указанных сигналов.
-
Преодоление Pgp-опосредованной МЛУ может быть связано с направленным воздействием на плазматическую мембрану резистентных клеток. Pgp не защищает клетки от нарушения целостности плазматической мембраны - некроза.
Научная повпзна Впервые обосновано представление о становлении МЛУ как срочном ответе клетки на экзогенный стимул;
Впервые детально исследован механизм становления конкретного фенотипа лекарственной устойчивости — Pgp-опосредованной МЛУ: эпигенетическая активация кодирующего этот белок гена MDRI.
3. Впервые разработана модель срочной активации гена MDRI,
сопровождающейся приобретением стабильного фенотипа Pgp-опосредованной МЛУ в культуре опухолевых клеток человека; \. Выявлены пути сигнальной трансдукции, механизмы активации транскрипции и посттранскрипционной регуляции гена MDRX в клетках, подвергнутых воздействшо противоопухолевых препаратов. 5. Впервые охарактершованы классы фармаколопіческих веществ — блокаторов передачи внутриклеточных сигналов — для предотвращения становления Pgp-опосредованной МЛУ в опухолевых клетках. 5. Впервые исследованы мехшшзмы гибели, функционирующие в клетках с Pgp-опосредованной МЛУ, и разработан подход к преодолению резистентности, заключающийся в первичном повреждешш целостности плазматической мембраны.
Практическая ценность.
-
Разработка методов предотвращения срочного становления Pgp-опосредованной МЛУ в культуре опухолевых клеток при воздействии химиотерапевтических препаратов.
-
Доклинические испытания модифицированных генно-инженерных вакцин для преодоления МЛУ.
Апробация работы.
Диссертация обсуждена 30 июня 2003 г. на совместной конференции іаборагорий генетики опухолевых клеток, цитогенетики с группой молекулярной генетики, вирусных и клеточных онкогенов, молекулярной эндокринологии, тротивоопухолевого иммунитета, биохимической фармакологии, медицинской шмии, экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей; отделешгіі шмунологии, гематологии, химиотерапии, клинической фармакологии, «шбшшрованных методов лечения РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.
Основные материалы диссертации представлены на следующих конференциях: 2-й международный симпозиум "Cytostatic Drug Resistance", (Ю Германия, 1991); Гордоновская конференция "Advances in Chemotherapy" (Ньк Лондон, США, 1994); "Molecular Toxicology" (Коплер Маунтин, США, 1995); "Inducible Genomic Responses" (Стивенсон, США, 1996); "Nucleic Acids — Integrating Molecular Diagnostics and Therapy" (Сан-Диего, США, 1996); ежегод конференции American Association of Cancer Research (1994-2001): 6-й и 7-й конгрессы "Advances in Oncology", (Херсониссос, Греция, 2001,2002); "Струк и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 2002), а также на семинарах в Oncotech, Inc. (Ирвайн, США, 1996), Институте Солка (ЛаХойя, США, 1997), онкологическом центре Ли Моффит (Тампа, США, 1997), The Jackson LaboraU (Бар Харбор, США, 1997), онкологическом центре Слоун-Кеттеринг, Нью-Йо] США, 1999), университетах Копенгагена (2002), Инсбрука (2002) и Гронингеї (2003), МГУ им. М.В.Ломоносова (2002), НИИ экспериментальной патологии онкологии и радиобиологии им. Р.Е.Кавецкого (Киев, 2002).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 22 журнальные статьи и пол международный патент.
Структура и объем диссертации.
