Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1 Регуляция клеточного метаболизма в условиях гипоксии 11
2.1.1 Механизмы детекции уровня кислорода 11
2.1.2 Транскрипционный фактор HIF 14
2.1.3 Структура HIF-1 17
2.1.4 Механизмы регуляции HIF-1 19
2.1.5 Изоформы HIF- 26
2.2 Гипоксия и злокачественные новообразования 28
2.2.1 Гипоксия и РМЖ 34
2.3 Воздействие эстрогенов на клетки-мишени. Рецепторы эстрогенов 37
2.3.1 Сигнальные пути рецепторов эстрогенов. 38
2.3.2 Современные представления о возникновении гормональной резистентности РМЖ . 40
2.4 Гипоксия и гормональная резистентность РМЖ 46
2.5 Гипоксия и эпителиально-мезенхимальный переход 49
2.5.1 ЭМП и рак 49
2.5.2 Гипоксия и индукция ЭМП 50
2.6 ЭМП и гормональная зависимость клеток РМЖ 53
3 Материалы и методы
55 Список реактивов и производителей 55
Оборудование и приборы 56
3.1 Культивирование клеток 57
3.2 МТТ-тест 58
3.3 Получение клеточных экстрактов и иммуноблоттинг 59
3.4 Транзиентная трансфекция 60
3.5 Трансдукция клеток лентивирусной конструкцией 63
3.6 Использование специфического ингибитора -катенина ICG-001 63
3.7 Использование активатора -катенина CHIR 99021 64
4 Результаты и обсуждение 65
4.1 Сравнительный анализ выживаемости в условиях гипоксии клеток эстрогензависимого и эстрогенрезистентного рака молочной железы 65
4.1.1 Рост клеток MCF-7 и HBL-100 в условиях гипоксии 65
4.1.2 Индукция HIF-1 под действием гипоксии 67
4.1.3 Влияние гипоксии на содержание и активность рецептора эстрогенов ER 68
4.2 Гипоксия и эстрогеннезависимые сигнальные пути 72
4.2.1 Влияние гипоксии на уровень HER2/Neu 72
4.2.2 Гипоксия и белок Snail1. Значение Snail1 в регуляции выживаемости клеток в
условиях гипоксии 74
4.2.3. Взаимоотношения между Snail1 и ER 80
4.2.4. Участие кадхерин-катенинового сигнального пути в реакции клеток на гипоксию 5 Заключение 88
Выводы 92
- Транскрипционный фактор HIF
- Современные представления о возникновении гормональной резистентности РМЖ
- Получение клеточных экстрактов и иммуноблоттинг
- Влияние гипоксии на содержание и активность рецептора эстрогенов ER
Введение к работе
Актуальность проблемы
Рак молочной железы (РМЖ) является одним из наиболее распространённых злокачественных заболеваний среди женщин [М.И.Давыдов, 2004, S.J.Fergusson, 2002, K.Lundgren, 2007], и, несмотря на значительный прогресс в его лечении, уровень смертности больных РМЖ остается достаточно высоким [М.И.Давыдов, 2004, Н.Е.Кушлинский и соавт., 2005, R.C.Bast Jr. Et al., 2000, J.R.Harris, 1996]. Одним из факторов, препятствующих снижению смертности, является развитие резистентности опухолей молочной железы к различным видам терапии [М.А.Красильников, 2004]. В этой связи актуально изучение молекулярных механизмов развития резистентности на моделях in vitro и выявление новых клеточных маркеров, определяющих чувствительность рака молочной железы к противоопухолевым препаратам.
Основным критерием чувствительности больных РМЖ к гормональной терапии является содержание рецепторов эстрогенов (ER) [T.Bachleiter-Hofmann et al. 2002, J.Baselga et al., 2012]. Различают врожденную и приобретенную гормональную резистентность РМЖ (под последней подразумевают резистентность к гормональным препаратам, развившуюся в процессе терапии). В обоих случаях снижение гормональной зависимости может быть обусловлено как уменьшением содержания ER, так рядом других факторов, среди которых – нарушение баланса между белками-активаторами и супрес-сорами ER; лиганд-независимая активация ER; стимуляция сигнальных путей, идущих в обход ER (EGFR, PI3K, NF-kB) и поддерживающих тем самым рост РМЖ в отсутствие эстрогенов [R.Clarke et al., 2003, A.Ring, 2004].
На сегодняшний день не вызывает сомнений важная роль, которую играет гипоксия в формировании фенотипа опухолевой клетки. Дефицит кислорода в микроокружении опухолевых клеток способствует развитию устойчивости к противоопухолевой терапии, в том числе к гормональным препаратам, что подтверждается большим количеством клинических данных. В целом опухоли, развивающиеся в условиях гипоксии, характеризуются более высокой степенью злокачественности и выраженной способностью к автономному, нерегулируемому росту [D.Generali et al., 2006, D.Generali et al., 2009, P.N.Span et al., 2003].
Основной задачей диссертации явилось исследование взаимосвязи между снижением гормональной зависимости и развитием устойчивости к гипоксии опухолей молочной железы. Предполагалось изучить особенности регуляции некоторых антиапоптотических сигнальных путей в клетках эст-
рогензависимого и эстроген-независимого рака молочной железы и установить их значение в развитии толерантности опухолевых клеток к гипоксии.
Цели и задачи исследования
Целью данной работы является исследование взаимосвязи между снижением гормональной зависимости и развитием устойчивости к гипоксии опухолей молочной железы, и установление молекулярного механизма толерантности к гипоксии в эстрогеннезависимых клетках рака молочной железы.
Основные задачи работы:
-
Сравнительный анализ выживаемости в условиях гипоксии (1% О2) клеток эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы
-
Изучение базального и индуцированного гипоксией уровня экспрессии HIF-1 в клетках эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы
-
Исследование влияния гипоксии на содержание и активность рецептора эстрогенов ER
-
Исследование значения Snail1/-катенин-сигнального пути в регуляции выживаемости клеток рака молочной железы в условиях гипоксии
-
Исследование взаимной регуляции Snail1 и рецептора эстрогенов ER в клетках рака молочной железы.
Научная новизна и практическая значимость исследования
Несмотря на значительный прогресс в исследовании молекулярного механизма реакции на гипоксию опухолевых клеток, значение аппарата рецепторов эстрогенов в этом процессе остается малоизученным. Судя по результатам отдельных работ, потеря рецепторов эстрогенов может провоцировать увеличение устойчивости клеток рака молочной железы к гипоксии, однако механизм активации протективных белков в гормонрезистентных опухолях РМЖ практически не исследован.
В настоящей работе впервые продемонстрирован и исследован механизм устойчивости к гипоксии, основанный на активации в клетках эстро-геннезависимого рака молочной железы Snail1-сигнального пути, установлено значение белков Snail1 и -катенина в поддержании роста и выживаемости опухолевых клеток в условиях гипоксии.
Получены новые данные о молекулярном механизме развития устойчивости к гипоксии опухолевых клеток и значении гормонального статуса опухолевых клеток в этом процессе. В экспериментах по подавлению экспрессии Snail1 c помощью РНК-интерференции установлено, что снижение экспрессии Snail1 повышает чувствительность клеток к гипоксии. Эти результаты позволяют рассматривать Snail1 в качестве перспективной мишени таргетной противоопухолевой терапии эстрогеннезависимого рака молочной железы.
Личный вклад автора
Автором самостоятельно проведён анализ отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме и разработан дизайн экспериментов, а также лично автором осуществлялись анализ и интерпретация результатов исследования, статистическая обработка данных, полученных в ходе экспериментов, формулирование выводов, оформление диссертационной работы.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.01.12. – «онкология», конкретно пунктам 2,3.
Апробация работы
Диссертация апробирована и рекомендована к защите 22 апреля 2013
года на совместной научной конференции лаборатории молекулярной эн
докринологии, лаборатории механизмов химического канцерогенеза, лабо
ратории механизмов гибели опухолевых клеток, лаборатории механизмов
прогрессии эпителиальных опухолей НИИ Канцерогенеза РОНЦ
им.Н.Н.Блохина РАМН.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 5 статей опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям учёной степени кандидата биологических наук.
Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста, содержит 24 рисунка. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Список литературы содержит 221 источник.
Транскрипционный фактор HIF
Эти механизмы обеспечивают как немедленный (например, снижение активности калиевых каналов; увеличение активности ферментов гликолиза), так и замедленный (например, снижение интенсивности синтеза мРНК и белков, формирующих калиевые каналы; увеличение интенсивности синтеза мРНК и белков-ферментов гликолиза) ответы клетки на изменение напряжения кислорода. Немедленный ответ основан на посттрансляционной модификации уже синтезированных белков или других макромолекул за счет окислительно-восстановительных реакций, реакций фосфорилирования-дефосфорилирования и т.д., в то время как отсроченный ответ имеет в своей основе изменение экспрессии генов. В последние годы особое внимание уделяется изучению механизмов, обуславливающих реализацию воздействия гипоксии на клетки, а также исследованию немедленного и отсроченного клеточных ответов при действии острой и хронической гипоксии [117].
Немедленный ответ клеток на острую гипоксию проявляется прежде всего в изменении ионных токов через мембрану. Ионные каналы, чувствительные к уровню кислорода, преимущественно находятся в мембранах возбудимых нейросекреторных клеток (клетки каротидных телец, нейроэпителиальные клетки дыхательной системы), опосредующих немедленные приспособления организма к гипоксии со стороны сердечнососудистой и дыхательной систем, а также в гладкомышечных клетках, опосредующих вазомоторную реакцию на гипоксию. В соответствии с одной из гипотез, кислородный сенсор связан с самим каналом, и окси/деокси состояния молекулы-сенсора обуславливают конформационные изменения канала. Альтернативная точка зрения на функционирование О2-датчика связана с преобразованием О2 в АФК, которые затем изменяют окислительно-восстановительный статус клетки и работу ионных каналов [130].
Отсроченный ответ клетки на гипоксию заключается в изменении транскрипции определенных генов. Каким же образом гипоксический сигнал может передаваться на ядро клетки, влияя на экспрессию чувствительных к гипоксии генов? Ещё в середине 80-х было установлено, что чувствительные к кислороду сигнальные пути, лежащие в основе регуляции гена эритропоэтина, работают практически во всех клетках млекопитающих, независимо от их отношения к продукции эритропоэтина, и что они регулируют многие другие гены [140]. В настоящее время установлено, что ведущая роль при ответе клетки на гипоксию осуществляется несколькими тесно связанными транскрипционными факторами, названными hypoxia-inducible factors (HIFs), которые запускают обширный транскрипционный каскад, напрямую или опосредованно контролирующий экспрессию сотен генов в любой клетке в ответ на гипоксию. Установлено, что транскрипционные мишени HIFs играют ключевую роль в стимуляции ангиогенеза и эритропоэза, регуляции вазомоторных функций, клеточной пролиферации, энергетического метаболизма и многих других механизмов ответа на гипоксию как на системном, так и на клеточном уровнях. Таким образом, HIFs являются частью широко распространенного в различных тканях, универсального механизма детекции уровня кислорода [170].
Число известных генов-мишеней HIF постоянно растет. Эти гены кодируют белки, играющие важную роль в адаптации клетки к острой и хронической гипоксии [184, 186, 209]. Такие белки обеспечивают различные механизмы приспособления клетки к пониженному содержанию кислорода:
Белки, участвующие в анаэробном расщеплении глюкозы: альдолаза А (ALDA), альдолаза С (ALDC), енолаза-1 (EN01) , глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (GAPDH) , гексокиназа-1 (НК1) , гексокиназа-2 (НК2) , лактатдегидрогеназа А (LDHA), фосфофруктокиназа L (PFKL) , фосфоглицераткиназа-1 (PGK1), пируваткиназа М (РКМ) , триозофосфатизомераза (ТРІ), глюкозофосфатизомераза (GPI) , 6-фосфофрукто-2-киназа/фруктозо-2,6-бифосфатаза 3 (PFKFB3); переносчики глюкозы 1 и 3 (GLUT 1/3); регуляторы внутриклеточного рН, например, трансмембранный фермент угольная ангидраза, удаляющая избыток протонов (СА).
Белки, обеспечивающие увеличение содержания кислорода в ткани за счет стимуляции эритропоэза, ангиогенеза и регуляции тонуса сосудов: фактор роста эндотелия сосудов (VEGF); рецептор VEGF (VEGFR); endocrine gland-derived VEGF (EG-VEGF, или PROK1); ингибитор активатора плазминогена (PAI-1); N0-синтаза-2 (NOS-2) (тонус сосудов); гем-оксигеназа-1 (НО-1) (тонус сосудов); эндотелин-1 (тонус сосудов); -і адренорецептор (тонус сосудов); адреномедуллин (тонус сосудов); ангиопоэтины (ANGPT1, ANGPT2); эритропоэтин (ЕРО); церуллоплазмин (окисление железа); трансферрин (транспорт железа, необходимого для синтеза гема); рецептор трансферрина (захват железа клетками).
Белки, влияющие на жизнеспособность и пролиферацию клеток: трансформирующие факторы роста TGF- и TGF-; р21; проапоптотические белки NIP3, NIX, RTP801; рецептор инсулиноподобного фактора роста (IGFR-1, -2, -3); инсулиноподобный фактор роста 2 (IGF-2), циклин G2; тромбоцитарный фактор роста PDGF-; лептин; плацентарный фактор роста (PGF); хемокиновый рецептор CXCR4.
Современные представления о возникновении гормональной резистентности РМЖ
Рецепторы эстрогенов играют ведущую роль в развитии РМЖ, поэтому гормональная терапия, блокирующая сигнальные пути рецепторов, успешно используется в клинике. Существует две основные стратегии подавления сигналинга рецепторов эстрогенов в клетках РМЖ: подавление эффекта эстрогена посредством антагонистов рецепторов и снижение выработки эстрогена. К препаратам-антагонистам рецепторов относятся SERM (selective estrogen receptor modulators) и SERD (selective estrogen receptor down-regulators). К препаратам группы SERM относится тамоксифен, который уже более 40 лет является основным препаратом для проведения эндокринной терапии гормонозависимого РМЖ [5-7]. Препараты группы SERM в некоторых тканях, включая молочные железы, ведут себя как антагонисты рецепторов эстрогенов; в других же тканях, например, костях и сердце, проявляют себя как агонисты рецепторов [40, 81, 124]. Препараты группы SERD, в частности, фулвестрант, являются «чистыми» антиэстрогенами, действуя исключительно как антагонисты рецепторов [159]. В качестве препаратов, подавляющих действие эстрогенов, используются также ингибиторы ароматазы, такие как анастрозол (аримидекс) и летрозол. Ароматаза - фермент, превращающий циркулирующие в крови андрогены в эстрогены. Таким образом, ингибиторы ароматазы подавляют синтез эстрогенов в организме, что позволяет достичь противоопухолевого эффекта в случае рака молочной железы [69].
К сожалению, далеко не во всех случаях опухоль молочной железы обладает высокой чувствительностью к терапии антиэстрогенами и ингибиторами ароматазы, что определяет низкий терапевтический эффект лечения. Основной причиной такой неэффективности эндокринной терапии является гормональная резистентность опухоли – устойчивость опухоли к действию гормональных цитостатических препаратов. Гормонорезистентные опухоли возможно разделить на две группы: опухоли с первичной гормонорезистентностью и опухоли с приобретенной гормонорезистентностью. К первой группе относят опухоли, у которых биологический механизм гормональной резистентности сформировался до проведения терапии, то есть de novo. Во вторую группу входят опухоли, утратившие чувствительность к цитостатическому действию антиэстрогенов во время проведения эндокринной терапии. Возникновение у больных РМЖ первичной и приобретенной гормонорезистентности связано с различными молекулярными механизмами, поддерживающими рост злокачественных клеток [38, 173].
Оказалось, что неэффективность тамоксифена во многих случаях не связана с отсутствием или утратой во время терапии основной мишени этого препарата -рецепторов эстрогенов. Этот факт подтверждается результатами клинических исследований: только небольшая (от 17 до 28%) группа больных с приобретенной гормонорезистентностью к тамоксифену утрачивает ER [75, 98]; по данным Bachleitner-Hofmann T. и соавторов около 80% гормонорезистентных опухолей молочной железы (контралатеральный РМЖ) сохраняют ER после проведения курса адъювантной терапии тамоксифеном [12]. Некоторые исследования подтверждают, что ER продолжают регулировать развитие опухоли в большинстве гормонорезистентных случаях; и две трети пациентов, резистентные к тамоксифену, чувствительны к терапии фулвестрантом и ингибиторами ароматазы [25, 91, 158].
Механизмы гормональной резистентности рака молочной железы. В настоящее время описано несколько возможных изменений в метаболизме опухолевых клеток, приводящих к полной или частичной утрате зависимости от эстрогенов [3, 7, 38]. Развитию гормональной резистентности могут способствовать следующие события: Нарушение экспрессии ER, мутации и альтернативные изоформы рецепторов
Любые изменения ER на уровне гена или белка могут стать причиной развития гормональной резистентности и более агрессивного фенотипа опухоли. Утрата ER с течением времени происходит примерно у 20% пациентов, получавших гормональную терапию [75]. Подавление или полная утрата ER может обеспечиваться разными механизмами. Один из механизмов связан с тем, что специфические микро-РНК могут регулировать стабильность м-РНК рецептора, подавляя его трансляцию [9]. Мутации в гене ER встречаются очень редко: менее, чем в 1% случаев ER - позитивных опухолей [86]. Но существует большое количество естественных изоформ рецепторов ER и ER, которые являются результатом альтернативного сплайсинга. Недавно было установлено, что экспрессия одной из таких изоформ - укороченного варианта ER36 - сопряжена с пониженным эндокринным ответом клеток [187].
Уровень ER и его функции могут также регулироваться посредством посттрансляционных модификаций, таких как фосфорилирование, метилирование, убиквитинирование. Эти модификации влияют на взаимодействие ER с его корегуляторами и, следовательно, способствуют развитию гормональной резистентности [69, 72].
Получение клеточных экстрактов и иммуноблоттинг
Полученные нами результаты подтверждают известные данные о возможности деградации рецептора эстрогенов в условиях гипоксии. Так, схожие тенденции были продемонстрированы в работе J. Kurebayashi и соавт. [113] на модели клеточных линий РМЖ ML-20 и KPL-1 [113]. Клетки ML-20 являются субпопуляцией клеточной линии MCF-7, эстроген-зависимой in vitro и in vivo. В противоположность, клеточная линия KPL-1 является эстроген-чувствительной in vitro, но эстроген-резистентной in vivo. Эти авторы показали, что гипоксия значительно снижает экспрессию и активность ER в зависимости от времени культивирования в условиях 1% О2.
Исследования, проведённые M.Stoner [198] на ER-положительной эстроген-чувствительной клеточной линии РМЖ ZR-75 показали, что снижение активности ER в условиях гипоксии и при культивировании клеток с хлоридом кобальта связано прежде всего с протеосомной деградацией этого белка. В экспериментах на клеточных линиях MCF-7 и T47D было установлено, что в условиях гипоксии развитие гормональной резистентности связано не только с протеосомной деградацией рецептора, но и с подавлением транскрипции гена Esr1 [176] .
По данным клинико-лабораторных исследований, в образцах РМЖ пониженный уровень ER наблюдается в перинекротических областях опухоли и коррелирует с повышенной экспрессией маркёров гипоксии, таких как CA-IX и Glut-1 [39].
Однако наши данные о снижении активности ER в гипоксии частично противоречат наблюдениям Yi и соавт. [215]. Авторы этого исследования провели трансфекцию эмбриональных клеток почки человека HEK293 (ER-) плазмидой с геном ER дикого типа и репортерной конструкцией с эстроген-чувствительными элементами. Эстрадиол и гипоксия приводили к росту активности ER в этой модели, а их комбинация вызывала значительный синергетический эффект: обнаружено увеличение активности ER более чем в 10 раз по сравнению с контрольными клетками. Основываясь на этих данных, авторы делают вывод об активации ER в условиях гипоксии. В работе Yi et al. также используют линию клеток MCF-7, однако репортерный анализ на этих клетках не проведен, и авторы ограничились лишь анализом уровня белка ER.
По-видимому, снижение активности ER в гипоксии, продемонстрированное в нашей работе и подтвержденное в ряде исследований [114, 176, 198], является тканеспецифичным и не воспроизводится на клеточных моделях другого генеза с экзогенным ER.
Таким образом, полученные нами результаты, как и данные ряда исследователей, демонстрируют эффект снижения экспрессии и активности рецептора эстрогена ER в клетках РМЖ в условиях гипоксии, что позволяет рассматривать гипоксия-зависимую деградацию ER в качестве одного из факторов, определяющих сравнительно высокую чувствительность гормонзависимых опухолей молочной железы к гипоксии.
В литературе неоднократно отмечалось, что в условиях гипоксии не только не снижается, но может и возрастать активность рецепторов белково-пептидных факторов, в частности EGFR, Her2/Neu, IGFR, контролирующих пролиферацию эстрогеннезависимых клеток [87]. Предполагается, что рецепторы ростовых факторов находятся под позитивным контролем со стороны HIF-1/2 [51, 58, 65, 87], хотя некоторые исследователи указывают также на независимую от HIF активацию трансмембранных рецепторов ростовых факторов в условиях гипоксии [106, 146]. Мы исследовали динамику накопления в клетках Her2/Neu – белка из семейства рецепторов ЭФР. С этой целью была проведена трансфекция клеток MCF-7 плазмидой, содержащей дикий вариант гена Her2/Neu, с последующим определением уровня Her2/Neu в условиях нормоксии и гипоксии. Результаты показали, что в отличие от ER, уровень Her2/Neu практически не изменяется в условиях гипоксии, оставаясь на прежнем уровне (рис.8).
Влияние гипоксии на содержание HER2/Neu в клетках MCF-7. Содержание HER2/Neu определяли в тотальных клеточных лизатах. Представлены результаты одного из трех независимых экспериментов. Иммуноблоттинг
Вероятно, экспрессия в эстрогеннезависимых клетках подобных тирозинкиназных рецепторов, малочувствительных к гипоксии, может частично поддерживать рост таких клеток в условиях гипоксии – в отличие от эстрогензависимых клеток, пролиферация которых преимущественно регулируется через аппарат рецепторов эстрогенов.
Наши данные об устойчивости белка HER2/neu к гипоксическим условиям дополняют результаты Dragowska и соавт. [48] о действии гефитиниба на ER положительные опухоли с повышенной экспрессией HER2/neu у мышей. Известно, что основной мишенью для гефитиниба являются EGFR-положительные клетки, где этот препарат ингибирует EGFR и частично подавляет активность тирозинкиназы HER2/neu. В экспериментах, проведенных Dragowska и соавт. [48], гефитиниб снижал активность EGFR, HER2/neu и МАP-киназ Erk1/2 и вызывал реоксигенацию опухолевой ткани у мышей. В статье аналогичной тематики Hardee и соавт. [79] предлагается использовать трастузумаб (ингибитор HER2/neu) в качестве индуктора оксигенации опухолевой ткани; ожидается, что повышенный уровень кислорода сенсибилизирует опухоли к химио- и радиотерапии. На моделях in vitro, по-видимому, возникает регуляторная петля: с одной стороны HER2/neu сигнальный путь обеспечивает гипоксию в опухолевой ткани, с другой – гипоксия стимулирует через HIF-1 активность тирозин-киназы HER2/neu. Наличие положительной обратной связи между белками HER2/neu и HIF-1 делает в ряде случаев неэффективной таргетную монотерапию такими препаратами как гефитиниб, эрлотиниб, трастузумаб и др., что может быть преодолено только с помощью мультитаргетных подходов, включающих одновременное ингибирование различных сигнальных мишеней (рецепторных тирозинкиназ, MAP-киназ, PI3K, mTOR, ароматазы и др.). Клинические испытания таких комбинированных схем терапии РМЖ, проведенные за последние годы, показывают перспективность таких подходов [102, 136, 183], [13]).
Влияние гипоксии на содержание и активность рецептора эстрогенов ER
Известно, что общей чертой многих солидных опухолей является ограниченное снабжение кислородом, вызванное недостатком кровеносных сосудов и их дефектной структурой [22]. Гипоксические области довольно часто обнаруживаются и в опухолях молочной железы [43, 112]. В настоящее время для лечения опухолей молочной железы в клинике успешно используется гормональная терапия, однако следует отметить, что гормональная зависимость опухоли является динамическим явлением и зависит от особенностей микроокружения клеток и, в частности, содержания в них кислорода. Накопленные к настоящему моменту клинические и экспериментальные данные свидетельствуют о том, что опухолевые клетки, находящиеся под давлением гипоксии, проявляют повышенную резистентность к гормональной терапии и хуже поддаются радиотерапии [147], в связи с чем гипоксию рассматривают как один из факторов опухолевой прогрессии и развития лекарственной устойчивости.
В настоящей работе мы исследовали сигнальные пути, ответственные за выживаемость клеток РМЖ в условиях гипоксии. Мы показали, что гормон-резистентные клетки РМЖ проявляют повышенную устойчивость к гипоксии по сравнению с гормон-зависимыми клетками. Эта устойчивость обеспечивается комплексом факторов, некоторые из которых нам удалось установить.
Мы показали, что в условиях гипоксии в эстроген-зависимых клетках довольно быстро деградирует рецептор эстрогенов ER, при том, что содержание и активность фактора Her2/Neu – белка из семейства рецепторов ЭФР - при гипоксии не снижается. Мы предполагаем, что такая разница в устойчивости этих факторов и определяет большую чувствительность к гипоксии эстроген-зависимых клеток, пролиферация которых опосредована ER. Дело в том, что быстрая деградация ER предполагает выключение эстроген-зависимых митогенных сигнальных путей, и, следовательно, остановку пролиферации при гипоксии. Наши результаты позволяют предположить, что рецептор негативные клетки более устойчивы в этих условиях по причине активации в них эстроген-независимых митогенных сигнальных путей, опосредованных в частности
Her2/Neu, который при гипоксии сохраняет свою активность. Наши данные согласуются с данными ряда других исследователей, которые отмечают, что гипоксия не только не снижает, но в некоторых случаях стимулирует активность рецепторов белково пептидных факторов роста, таких как EGFR, Her2/Neu, IGFR [51, 65, 87] .
На следующем этапе работы мы исследовали значение отдельных эстроген-независимых сигнальных путей в поддержании роста клеток РМЖ в условиях гипоксии. Известно, что развитие гормональной резистентности в клетках РМЖ часто сопровождается появлением признаков эпителиально-мезенхимального перехода [59]. Одним из ключевых факторов эпителиально-мезенхимального перехода является белок Snail1, содержание которого, по нашим данным, гораздо выше в эстроген-независимых клетках РМЖ. Это согласуется с данными некоторых исследователей, которые отмечают, что ER участвует в негативной регуляции экспрессии Snail1 [59], а следовательно, в эстроген-независимых клетках при отсутствии рецептора эстрогенов экспрессия Snail1 возрастает.
В наших экспериментах подавление активности Snail1 с помощью siRNA приводило к снижению устойчивости эстроген-независимых клеток к гипоксии. Данный эффект указывает на важную роль Snail1 при адаптации клеток к условиям дефицита кислорода. Последующие этапы нашего исследования показали, что протективный эффект Snail1 частично опосредован активацией -катенин-сигнального пути. Известно, что Snail1 подавляет экспрессию Е-кадхерина - основного белка клеточных контактов [14]. Согласно нашим данным, в эстроген-независимых клетках линии HBL-100 с повышенным содержанием Snail1 уровень Е-кадхерина значительно ниже, чем в эстроген-зависимых клетках линии MCF-7. Е-кадхерин закрепляется в клеточной мембране посредством -катенина – белка, который помимо стабилизации клеточных контактов, выполняет функцию транскрипционного фактора. При снижении уровня Е-кадхерина в клетках -катенин высвобождается из комплекса с Е-кадхерином и может транспортироваться в ядро, где выполняет роль траскрипционного фактора, ответственного за регуляцию некоторых генов контроля клеточного цикла [45, 97, 154]. Мы показали, что в условиях гипоксии активность -катенина в клетках возрастает (рис.18). Согласно литературным данным, -катенин может контролировать клеточный ответ на гипоксию, взаимодействуя с гипоксия-респонсивными элементами (HRE) промоторов HIF-1-зависимых генов [93, 120]. Полученные нами результаты подтверждают эти данные. Мы исследовали влияние -катенина на активность репортерной плазмиды, содержавшей ген люциферазы под контролем HRE. Уровень активации репортерной плазмиды под действием гипоксии существенно снижался в присутствии специфического ингибитора -катенина, что свидетельствует о непосредственном участии -катенина в регуляции HIF-1-зависимых генов в клетках рака молочной железы.
