Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы. 8-38
Глава II. Характеристика больных и методы исследования Результаты собственных исследований 39 - 58
Глава III. Выявление микрометастазов рака молочной железы в костном мозге и периферической крови методом проточной цитофлуориметрии 59 - 82
Глава IV. Иммуноцитофлуорометрическое выявление циркулирующих опухолевых клеток у больных распространенным раком молочной железы 83 - 119
Глава V. Иммунологическое определение опухолевых клеток в костном мозге 120 - 133
Глава VI Субпопуляции циркулирующих опухолевых клеток, циркулирующих в периферической крови больных раком молочной железы 134-152
Заключение и обсуждение полученных результатов 153 - 160
Выводы.
Список литературы
- Характеристика больных и методы исследования Результаты собственных исследований
- Выявление микрометастазов рака молочной железы в костном мозге и периферической крови методом проточной цитофлуориметрии
- Иммуноцитофлуорометрическое выявление циркулирующих опухолевых клеток у больных распространенным раком молочной железы
- Иммунологическое определение опухолевых клеток в костном мозге
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Заболеваемость раком молочной железы в России, как и во многих странах, продолжает расти. В структуре заболеваемости женщин рак молочной железы устойчиво занимает 1 место, при этом у 37,3% впервые заболевших женщин диагностируется III или IV стадии заболевания. Прирост заболеваемости раком молочной железы в России составил с 1999 по 2004 г. 6,8%. Прирост стандартизованного показателя смертности составил 2,9% [4]. В западных странах в последние годы наблюдается тенденция к увеличению продолжительности жизни больных раком молочной железы. Так в США пятилетняя выживаемость больных РМЖ составляет 81%, в Западной Европе - 71%, а в Восточной Европе - 58%. Улучшение показателей выживаемости в США и Западной Европе является результатом ранней диагностики и успешного лечения с использованием современных диагностических и лечебных мероприятий.
В последние годы особое внимание уделяется более точному стадированию заболевания, а также поиску методов таргетной терапии рака молочной железы. Большое значение придается изучению биологически значимых характеристик заболевания, которые могут помочь при выборе наиболее эффективного вида противоопухолевого лечения.
Развитие современных технологий сделало возможным определение единичных опухолевых клеток в биоптатах костного мозга и в периферической крови. Считается доказанным, что обнаружение на этапе постановки диагноза микрометастазов в костном мозге влияет на время продолжительность времени до прогрессирования и общую выживаемость больных операбельным РМЖ.
Клиническое значение иммунологического определения опухолевых клеток, циркулирующих в периферической крови, остается не до конца понятным. Опухоли молочных желез гетерогенны по иммунофенотипу, что
5 находит отражение в особенностях клинического течения, степени распространенности процесса, характере иммунного ответа и прогнозе заболевания. Есть все основания предполагать, что гетерогенность иммунофенотипа рака молочных желез присуща и циркулирующим в периферической крови опухолевым клеткам. Следовательно, течение и прогноз заболевания может определяться не только фактом обнаружения опухолевых клеток в периферическом кровеносном русле, но и качественным составом этих клеток. Изучение иммунофенотипа циркулирующих опухолевых клеток, может быть полезным в понимании механизмов метастазирования и лекарственной устойчивости рака молочной железы.
В этой связи представляется актуальным изучение количественного и качественного состава опухолевых клеток, циркулирующих в периферической крови больных диссеминированным и местно-распространенным раком молочной железы.
Цель работы.
Целью настоящего исследования является иммунофенотипическое изучение количественного и качественного состава опухолевых клеток, циркулирующих в периферической крови и костном мозге больных диссеминированным и местно-распространенным раком молочной железы.
Задачи исследования.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
1. Установить количество циркулирующих опухолевых клеток в
периферической крови больных местно-распространенным и
диссеминированным раком молочной железы
иммуноцитофлуорометрическим методом с использованием моноклональных антител к мембранным панэпителиальным антигенам Egp34 и ВегЕр4.
Провести количественную оценку клеток рака молочной железы в костном мозге иммунопатологическим методом с использованием МКА к панцитокератинам KL-1.
Охарактеризовать субпопуляции циркулирующих в периферической крови клеток рака молочной железы на основании экспрессии мономорфных детерминант молекул гистосовместимости II класса (HLA-DR) и рецептора апоптоза FAS/APO-1 (CD95).
Оценить клиническую значимость определения циркулирующих опухолевых клеток и их количества в динамике в процессе специфической противоопухолевой терапии у больных местно-распространенным и диссеминированным раком молочной железы.
Научная новизна.
Впервые установлена частота обнаружения (41,3%) и охарактеризован
субпопуляционный состав циркулирующих опухолевых клеток в
периферической крови больных местно-распространенным и
диссеминированным раком молочной железы. Показано, что
циркулирующие в периферической крови опухолевые клетки гетерогенны
по экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости II класса
(HLA-DR) и рецептора CD95. В большинстве случаев отмечена выраженная
пропорция HLA-DR-негативных и CD-95-негативных клеток. Выявление
ЦОК наблюдается достоверно чаще при инфильтративно-дольковом раке и
у больных в менопаузе. Микрометастазы в костном мозге до лечения
обнаруживаются в 55% случаев рака молочной железы III-IV стадий и не
имеют прямой ассоциации с наличием циркулирующих опухолевых клеток
в крови. Доказано, что использование проточно-
иммуноцитофлуорометрической количественной идентификации
циркулирующих опухолевых клеток в крови больных раком молочной железы на основании отсутствия обще-лейкоцитарных антигенов CD45 и экспрессии мембранных панэпителиальных антигенов (ВегЕр4 и Egp34) с
7 точностью 1 опухолевая клетка на 1 миллион лейкоцитов позволяет оценивать динамику ЦОК и, в комплексе со стандартными диагностическими методами, эффективность проводимой химиотерапии.
Научно-практическая значимость.
Обоснована необходимость определения циркулирующих опухолевых клеток у больных раком молочной железы с целью совершенствования оценки степени распространенности рака молочной железы. Метод внедрен в клиническую практику отделения клинической фармакологии и химиотерапии НИИ КО ГУ РОНЦ им. Блохина Н.Н. РАМН. Показано, что динамика ЦОК в процессе лечения отражает эффективность лечения (продолжительность интервала без прогрессирования) и является ценным прогностическим показателем. При оценке субпопуляционного состава ЦОК отсутствие экспрессии молекул HLA-DR может служить указанием на необходимость применения индукторов экспрессии HLA-DR (например, интерферонов) в HLA-DR-негативных случаях с целью восстановления возможности распознавания микрометастазов иммунной системой организма.
По теме диссертации опубликовано 3 статьи в российской научной
прессе. Тезисы по теме диссертации представлены на конференции
Европейского общества медицинских онкологов (ESMO), состоявшейся в
июне 2003 г.
Материалы диссертации доложены на IV Российской конференции с
международным участием «Иммунология гемопоэза» (тема конференции
«Микрометастазы рака), состоявшейся 6 июня 2007 года.
Характеристика больных и методы исследования Результаты собственных исследований
Материалом для настоящего исследования послужили данные клинического, морфологического, иммуноцитологического и иммуноцитофлуориметрического обследования 65 больных местно-распространенным (первично-неоперабельным) и диссеминированным раком молочной железы, находившихся на лечении в ГУ Российском Онкологическом Научном Центре им. Н.Н. Блохина РАМН в период с 2001 по 2003 гг. Основными критериями включения больных в исследование были: морфологическая верификация диагноза рака молочной железы необходимость проведения системного лечения (химиотерапия, гормонотерапия) по поводу впервые выявленного распространенного рака молочной железы или в связи с рецидивом заболевания согласие больного на проведение дополнительных диагностических манипуляций (забор периферической крови и костного мозга с целью иммунологического исследования)
Распространенность процесса до начала лечения оценивалась у всех больных в соответствии с классификацией злокачественных опухолей UICC (5 издание TNM, 1997г.) на основании физикального и инструментального обследований, включавших в себя: рентгенографию органов грудной клетки ультразвуковую томографию печени, молочных желез и регионарных зон радиоизотопное исследование скелета дополнительно по показаниям выполнялись: компьютерная томография органов грудной клетки или брюшной полости рентгенография костей
В зависимости от клинической ситуации (стадия заболевания, уровень рецепторов половых гормонов в опухоли, возраст больной, менструальная функция, длительность интервала без прогрессирования, локализация метастазов) после полного обследования больным проводилось системное противоопухолевое лечение.
Ниже представлены режимы системной противоопухолевой терапии, которые рассматривались в качестве стандартных в рамках данного исследования.
Химиотерапия по схеме FAC: доксорубицин 50 мг/м2 + циклофосфан 500 мг/м2 + 5-фторурацил 500 мг/м2 внутривенно капельно в 1 день с интервалом в 21 день.
Химиотерапия таксанами. Паклитаксел 175 мг/м2 3-часовая внутривенная инфузия или доцетаксел 75 мг/м2 в/в капельно 1 раз в 21 день планировалось назначать в качестве 2 линии химиотерапии больным с рецидивом рака молочной железы, которым ранее проводилась химиотерапия с включением антрациклинов или в связи с прогрессированием заболевания после адъювантной химиотерапии с включением антрациклинов.
Гормональная терапия. Тамоксифен 20 мг в сутки планировалось назначать больным с благоприятным прогнозом (больным в менопаузе, с положительными рецепторами половых гормонов, с длительным безрецидивным интервалом, отсутствием метастазов во внутренние органы). Допускалось применение ингибиторов ароматазы (анастрозол, летрозол) у больных, получавших тамоксифен адъювантно или в качестве второй линии гормонотерапии после прогрессирования заболевания на фоне приема тамоксифена.
Лечебный противоопухолевый эффект оценивался по клиническим данным и по данным инструментальных методов обследования каждые 2 курса химиотерапии и по окончании цикла химиотерапии; или после 3 месяцев гормонотерапии в соответствии с критериями ВОЗ: Полный эффект (ПЭ). Под ним подразумевается исчезновение всех проявлений заболевания, определенное по двум наблюдениям с интервалом не менее 4 недель.
Частичная регрессия (ЧР): уменьшение на 50% и более суммы произведений наибольших перпендикулярных диаметров всех измеряемых проявлений заболевания по 2 наблюдениям с интервалом не менее 4 недель.
Стабилизация заболевания (СЗ). Для опухолей с двумя измеряемыми диаметрами снижение менее чем на 50%, или увеличение менее чем на 25%, суммы произведений наибольших перпендикулярных диаметров всех измеряемых проявлений заболевания при отсутствии новых очагов. Для опухолей с одним измеряемым диаметром снижение менее чем на 50%, или увеличение менее чем на 25% суммы диаметров всех измеряемых опухолей.
Прогрессирование заболевания (ПЗ). Увеличение на 25% и более размера хотя бы одного измеряемого проявления заболевания с одним или двумя измеряемыми диаметрами (по сравнению с наименьшими измерениями) или появление новых проявлений заболевания.
В случае метастазов в кости под стабилизацией заболевания понималось отсутствие значимых изменений по рентгенологической оценке не менее чем через 9 недель после начала лечения; частичная регрессия — частичное уменьшение количества метастазов, увеличение плотности остеолитическнх метастазов; полная регрессия - полное исчезновение всех поражений по данным рентгенографии скелета; прогрессирование -увеличение количества или размеров существующих метастазов в кости или появление новых.
Выявление микрометастазов рака молочной железы в костном мозге и периферической крови методом проточной цитофлуориметрии
Микрометастазы - единичные опухолевые клетки, не выявляемые стандартными морфо-цитологическими методами при различных солидных опухолях и, в частности, при раке молочной железы. В энциклопедии клинической онкологии под редакцией акад. Давыдова М.И. (глава 1, 2004 г.) термин микрометастазы обозначает метастазы на грани определения современными методами диагностики, не проявляющие себя клинически. В данной работе мы сочли возможным употреблять термин «микрометастазы» применительно к позитивным по эпителиальным антигенам единичным клеткам, выявляемым иммуноцитолошческим методом в костном мозге и периферической крови больных раком молочной железы.
Прогностическое значение выявления микрометастазов в костном мозге при раке молочной железы в настоящее время доказано по результатам большого количества исследований. Так в августе 2005 опубликованы данные совокупного анализа отдаленной выживаемости 4703 больных раком молочной железы I, II и III стадий, включенных в клинические исследования. Средний период наблюдения составил 5,2 года (максимальный период - 10 лет). По данным многофакторного анализа микрометастазы в костный мозг у больных операбельным РМЖ до лечения статистически достоверно ухудшали отдаленные результаты лечения (общую продолжительность жизни и продолжительность безрецидивного интервала) [28].
Вместе с тем, несмотря на большое количество проведенных исследований, единства мнения о методах выявления и значении единичных опухолевых клеток в мировой литературе нет. Также пока не доказана роль солитарных опухолевых клеток, циркулирующих в периферической крови (смотри главу I).
Одним из наиболее информативных методов выявления мпкрометастазов с точки зрения клинического применения является проточная цитофлуориметрия. Во-первых, по чувствительности методика превосходит морфо-цитологические методы, когда зачастую единичные опухолевые клетки не выявляются вообще, или их гистогенез вызывает сомнения. Кроме того, использование при проточной цнтофлуориметрии высокоспецифичных моноклональных антител для выявления клеток-мишеней делает проточную цитофлуориметрию сопоставимой по чувствительности с методиками ПЦР - возможно выявление единичных опухолевых клеток среди 1-5 млн анализируемых клеток. Несомненным плюсом данного метода является высокая воспроизводимость, а также быстрота получения результатов исследования (все время анализа от подготовки пробы до получения обработанных результатов занимает не более 5 часов).
В настоящее время проточная цитофлуориметрия широко используется при первичной диагностике процесса для установления природы опухолевых клеток (гемопоэтические, эпителиальные) в случаях, когда морфо-цитохимия не может дать однозначного ответа. Результаты иммунологического исследования в подобных ситуациях являются решающими для больного. Речь идет, как правило, о массивном поражении (значительном количестве циркулирующих опухолевых клеток) н обычные цитофлуориметрические методики (использование 2-х, 3-х параметровой окраски клеток и оценка относительно небольшого количества клеток, когда анализируется не более 20000 клеток) являются вполне достаточными для установления иммунологического профиля опухолевых клеток.
При оценке же костного мозга и периферической крови с целью выявления микрометастазов приходится иметь дело с единичными опухолевыми клетками, как правило, не выявляемыми при обычной морфоцитохимии, а это создает ряд трудностей и требует модификации методик проточной цнтофлуориметрии. Особенного внимания заслуживает проблема сбора достаточного для анализа количества клеток.
Для выявления единичных метастатических клеток при опухолях эпителиальной природы используются антитела к общеэпителиальным антигенам наряду с антителами к различным цитокератинам.
Существует достаточное количество моноклональных антител к общеэпителиальным антигенам и к цитокератинам. Причем в случае последних используются как антитела к какому-нибудь одному цитокератину (например, к цитокератину 5 или 7 и т.д.) или, что наиболее часто, антитела выявляющие одновременно комбинацию цитокератинов, так называемые антитела к пан-цитокератинам. Ввиду этого возникает проблема правильного подбора комбинации моноклональных антител, позволяющей достоверно выявить единичные опухолевые клетки рака молочной железы.
В нашем исследовании мы отработали методику проточной цитофлуориметрии для выявления циркулирующих опухолевых клеток рака молочной железы в периферической крови больных с местно-распространенным и диссеминированным раком молочной железы.
В ходе отработки метода проточной цитофлуориметрии для выявления микрометастазов рака молочной железы мы попытались решить указанные выше технические проблемы.
Иммуноцитофлуорометрическое выявление циркулирующих опухолевых клеток у больных распространенным раком молочной железы
Иммунологическое исследование периферической крови до начала лечения с целью выявления циркулирующих опухолевых клеток было проведено 63 больным с помощью моноклональных антител НЕА-125, ВегЕР4 иКЫ.
Была сопоставлена различная чувствительность метода иммуноцитофлуорометрического выявления ЦОК: 1 клетка на миллион лейкоцитов и 1 клетка на 100000 лейкоцитов. При анализе с точностью 1 клетка на миллион лейкоцитов частота выявления ЦОК у больных диссеминированным и местно-распространенным РМЖ составила 47,6%, а при анализе с точностью 1 клетка на 100000 лейкоцитов частота выявления ЦОК составила 41,3%.
Для повышения точности исследования и исключения единичных случайных событий, количество антиген-позитивных клеток 10 на миллион лейкоцитов было решено принимать за негативный результат, т.е. в группу позитивных больных относили только пациентов с заведомо позитивным результатом исследования (более 10 ЦОК на 1 миллион лейкоцитов).
Как указано выше, в исследуемой группе частота выявления опухолевых клеток в периферической крови до начала лечения на основании исследования экспрессии какого-либо из трех изученных антигенов составила 41,3% (26 позитивных результатов у 63 больных).
У больных местно-распространенным раком молочной железы и у больных с отдаленными метастазами циркулирующие опухолевые клетки по данным проточной цитометрии выявляли приблизительно с одинаковой частотой: ЦОК выявлены у 3 из 7 больных местно-распространенным РМЖ и у 21 из 56 больных метастатическим РМЖ, что составило 42,9% и 41% соответственно.
Оценка количества циркулирующих опухолевых клеток на основании экспрессии Egp34 с помощью МКА НЕА-125 до лечения проведена у 21 больной. У 10 больных (47,6%) были выявлены НЕА-125-позитивные клетки. Медиана в пределах позитивных случаев составила 34 клетки, разброс значений был значительным (от 13 до 307 клеток).
На основании экспрессии KL-1 кровь на наличие циркулирующих опухолевых клеток была оценена у 10 больных. Антиген-позитивные клетки были выявлены у 2 из них (20%).
У 32 больных иммунологическое исследование периферической крови до лечения было проведено с помощью антител к антигену ВегЕР4. У 43,8 % больных (n = 14) были обнаружены ВегЕР4-позитивные клетки. Медиана в пределах позитивных случаев составила 66 клеток, разброс значений от 11 до 418 клеток. Данные о частоте выявления ЦОК с помощью различных антител у больных в анализируемой группе отражены в таблице 8.
Как видно из таблиц, количество обнаруженных ЦОК не зависело от локализации и количества метастазов. Так, у больной с выраженной диссеминацией процесса (№ = Как видно из таблицы 12, при использовании антител ВегЕР-4 и НЕА125 у большинства больных ЦОК чаще определялись в количестве от 11 до 100, ЦОК-негативные случаи составляли не менее 50% (56,3% и 52,4% соответственно), структура распределения больных по группам примерно одинакова вне зависимости от используемых антител.
На рисунке 11 показано распределение больных в зависимости от количества ЦОК во всей группе вне зависимости от вида используемых антител. 57), с метастазами в кости, печень, легкие, отдаленные лимфоузлы ЦОК в крови до лечения не определялись, а у больной с местно-распространенным раком молочной железы (№ = 44) было обнаружено 160 АГ-позитивных клеток.
Для удобства оценки полученных результатов все исследуемые больные в зависимости от количества выявленных в периферической крови опухолевых клеток были условно поделены нами на 3 группы:
1 группа - опухолевых клеток в периферической крови не выявлено или количество ЦОК не превышало 10 (0-10 клеток) на миллион лейкоцитов
2 группа - количество циркулирующих опухолевых клеток составляло от 11 до 100 клеток. В группу 2 решено относить заведомо позитивные случаи (более 10 ЦОК на миллион лейкоцитов). группа - количество ЦОК превышало 100 антиген-позитивных клеток на 1 миллион лейкоцитов. В 3 группу относились больные с высоким количеством ЦОК.
В следующей таблице показано распределение больных в зависимости от количества выявленных с помощью трех моноклинальных антител циркулирующих опухолевых клеток.
Иммунологическое определение опухолевых клеток в костном мозге
Исследование пунктатов костного мозга больных диссеминированным и местно-распространенным раком молочной железы проводили в 2 лабораториях НИИ Клинической Онкологии ГУ РОНЦ имени Н.Н. Блохина РАМН. В лаборатории клинической цитологии выполнялось цитологическое исследование костного мозга, в лаборатории иммунологии гемопоэза производили подсчет клеток миелограммы и осуществляли иммуноцитологическое исследование костного мозга с применением моноклональных антител с целью выявления опухолевых клеток.
В рамках данного исследования выполнено 53 иммуноцитологических исследования пунктатов костного мозга у 42 больных раком молочной железы. Костный мозг исследовали иммуноцитологическим методом флуоресцентной микроскопии с помощью моноклональных антител к панцитокератинам KL-1. При использовании этих антител метастатические клетки легко обнаруживаются среди лейкоцитов костного мозга по наличию яркого цнтоплазматического флуоресцентного свечения. Одновременно в полученных мазках костного мозга производили подсчет миелограммы стандартным способом и, в случае обнаружения опухолевых клеток в костном мозге, препараты дополнительно консультировали в лаборатории цитологии.
Единичные опухолевые клетки обнаружены в 26 реакциях из 53 (49%). Количество эпителиальных клеток, определяемых иммуноцитологически, варьировало от 1 до 464 на миллион миелокариоцитов. Количественный состав: при исследовании пунктатов костного мозга от 1 до 10 клеток обнаружено в 70,4% (в 19 из 26 позитивных реакций), от 11 до 100 клеток - в 15,4% (в 4 исследованиях), более 100 клеток - в 11,5 % (3 исследования). Возможность выявления едшшчных эпителиальных клеток в костном мозге демонстрирует большую чувствительность иммуноцптологического метода по сравнению с цитологическим исследованием и является его основным преимуществом. При стандартном цитологическом исследовании метастазы в костный мозг были выявлены у 5 больных диссеминированным раком молочной железы (11,9%). Распространенность заболевания в этой группе больных была такой: метастазы в печень - у 3 больных, в кости - у всех больных, в легкие - у 3 больных. У четырех больных заболевание было выявлено впервые, у одной пациентки - был рецидив заболевания. Краткая характеристика этих больных дана в таблице 29.
При иммуноцитологическом анализе костного мозга с помощью антител к панцитокератинам KL-1 у всех больных из этой группы были выявлены антиген-позитивные опухолевые клетки. При иммунологическом исследовании периферической крови до лечения у всех больных из этой группы были выявлены антиген-позитивные клетки (от 1 до 418 клеток/млн). После проведения системной противоопухолевой терапии анализ крови был выполнен двум больным из этой группы - в обоих случаях были выявлены клетки, позитивные по эпителиальным антигенам.
Нами была проанализирована связь исследуемого фактора с гистологической структурой опухоли. Оказалось, что у больных инфильтративно-протоковым раком молочной железы микрометастазы в костный мозг выявлялись несколько чаще (68,8%), чем у больных инфильтративно-дольковым РМЖ (50%). Разница статистически недостоверна.
При анализе взаимосвязи частоты метастазирования в костный мозг и рецепторного статуса опухоли зависимости не обнаружено. Частота детекции микрометастазов у больных с отсутствием рецепторов половых гормонов в опухоли (п=12) и у больных с хотя бы одним положительным рецептором (п= 18) в опухоли (РЭ+ и/или РП+) была равной и составила 50%.
