Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. Динамическая структура хроматина 17
Глава 1. Структура и функции клеточного ядра (Обзор литературы) 18
1.1. Молекулярный и супрамолекулярныеуровни организации ДНК в клетках эукариот. 18
1.1.1. Первичная структура ДНК 19
1.1.2. Вторичная структура ДНК 21
1.1.3. Структуры ДНК высших порядков организации . 23
1.2. Суперспиральная конформация кольцевых молекул ДНК. 30
1.3. Суперспиральная ДНК клеточного ядра эукариот. 32
Глава 2. Результаты собственных исследований 38
2.1. Капиллярная эластовискозиметрия нуклеоидов эукариот 38
2.2. Супрамолекулярная организация нуклеоидов эукариот 48
2.3. Прочно связанные с ДНК «остаточные» белки. 55
2.4. Белковый состав ядерного матрикса в клетках различных тканей . 63
2.5. Изменение супрамолекулярного комплекса ДНК под действием противоопухолевых химиотерапевтических препаратов. 73
Резюме. 80
ЧАСТЬ II. Программированная гибель опухолевых клеток при терапевтическом лечении онкологических заболеваний
Глава 3. Программированная гибель клеток (Обзор литературы) 86
3.1. Программированная гибель клеток 88
3.2. Каспазы 91
3.3. Рецепторы смерти 93
3.4. Роль митохондрий 99
3.5. Роль факторов роста 104
3.6. Гранзимы 105
3.7. Белки теплового шока 106
3.8. Транскрипционные факторы NF-кВ и р53 108
3.9. Протеасом ы 110
3.10. Другие сигнальные системы гибели/выживания клетки 112
3.11. Программированная гибель клеток в механизмах циторедуктивной терапии 113
Глава 4. Материалы и методы исследования 122
4.1. Материалы. 122
4.1.1. Клеточные линии и культуры 122
4.1.2. Противоопухолевые препараты и цитотоксины. 122
4.1.3. Моноклоналъные антитела 123
4.1.4. Реагенты и наборы реактивов 125
4.2. Методы исследования. 126
4.2.1. Реакция поверхностной иммунофлуоресценции (РИФ). 126
4.2.2. Инкубация клеток с противоопухолевыми препаратами in vitro. 126
4.2.3. Определение доли гиподиплоидных клеток. 126
4.2.4. Выявление апоптотических клеток методом TUNEL. 127
4.2.5. Выявление апоптозн ых клеток методом прижизненного двойного окрашивания Аннексином V-FITC и PI 127
4.2.6. Проточная цитофлюориметрия. 128
4.2.7. МТТ- тест пролиферативнойактивности клеток 128
4.2.8. Определение половинной ингибирующей концентрации (ІС50) противоопухолевых препаратов и цитотоксинов 129
4.2.9. Получение F(ab')2 фрагментовМКА. 130
4.2.10. Иммуноблоттинг 130
4.2.11. Определение активации каспазы-3. 131
4.2.12. Конкурентная гибридизация кДНК на экспрессионных ДНК- микрочипах. 131
4.2.13. Анализ протеинового профиля 132
4.2.14. Световая светлополъная и фазовоконтрастнаямикроскопия. 132
4.2.15. Флюоресцентная микроскопия. 133
4.2.16. Изготовление иммуномагнитного анти-Fas препарата 133
Глава 5. Рецепторно-лигандный и лекарственно-индуцированный апоптоз. 135
5.1. Характеристика методов регистрации апоптоза. 135
5.1.1. Гиподиплоидные клетки 135
5.1.2. Регистрация накопления нитевых разрывов ДНК (TUNEL) 138
5.1.3. Флиппинг фосфатидилсерина клеточной мембраны 139
5.1.4. Сопоставление результатов оценки субпопуляции погибающих клеток, полученных разными методами. 144
5.2. Индукция апоптоза МКА aHmu-CD95, TRAIL и противоопухолевыми препаратами. 145
5.3. Блокирование лекарственно-индуцированного апоптоза F(ab')2 фрагментами aumu-CD95. 149
5.4. Экспрессия CD95L на поверхности клеток Jurkat после инкубации с противоопухолевыми препаратами 152
Глава 6. Получение С095-негативных клеточных линий. 154
6.1. Деплеция СБ95-позитивной популяции Т-лимфобластных клеток 154
6.2. Лекарственная индукция апоптоза клеток линии Jurkat/wt и А4. 160
Глава 7. Сравнительные характеристики клеток двух родственных линий. 168
7.1. Сравнительный анализ транскрипционной активности генома клеток обеих линий 168
7.2. Регуляция экспрессии отдельных генов при рецепторно-лигандной индукции апоптоза. 178
7.3. Протеомный профиль клеток обеих линий. 181
7.4. Состояние про-и антиапоптогенных сигнальных путей в клетках двух линий . 183
7.5. Возможная роль CD73 в антиапоптогенной программе клеток линии А4. 186
Глава 8. Лекарственная чувствительность двух родственных клеточных линий in vitro.
8.1. Сравнительные спектры чувствительности клеток к противоопухолевым лекарственным средствам. 191
8.2. Анализ клеточных популяций двух линий, переживших цитотоксическую терапию. 192
8.3. Возможные причины расхождений результатов оценки цитотоксической эффективности. 206
Часть III. Обсуждение результатов исследования. 211
Заключение 231
Выводы 236
Список цитированной литературы 239
- Структуры ДНК высших порядков организации
- Белковый состав ядерного матрикса в клетках различных тканей
- Лекарственная индукция апоптоза клеток линии Jurkat/wt и А4.
- Состояние про-и антиапоптогенных сигнальных путей в клетках двух линий
Введение к работе
Актуальность темы
Химиотерапия является основным, а при некоторых нозологических формах и стадиях распространения - единственным методом лечения онкологических заболеваний. Несмотря на богатый арсенал высоко активных противоопухолевых химиотерапевтических препаратов, эффективность лечения ограничивается их не абсолютной селективностью в отношении опухолевых клеток, с чем связано побочное токсическое действие циторедуктивной терапии на клетки нормальных тканей, а также лекарственной резистентностью опухолей.
Понимание молекулярных механизмов цитотоксичности противоопухолевой терапии, возможности их реализации в клетках конкретной опухоли и нормальных (в том числе пролиферирующих) тканей лежат в основе повышения эффективности и избирательности существующих консервативных методов лечения злокачественных новообразований, а также рационального поиска новых соединений с потенциальной противоопухолевой активностью.
Большинство противоопухолевых препаратов, используемых в современной онкологической клинике, были отобраны в результате эмпирического скрининга соединений, избирательно или преимущественно убивающих пролиферирующие опухолевые клетки. До недавнего времени большая часть исследований механизмов действия противоопухолевых лекарств относилась к поиску их внутриклеточных мишеней, изучению природы и характера повреждений, индуцированных взаимодействием препарата с мишенью, а также механизмов резистентности, предотвращающих такое взаимодействие.
Традиционно цитотоксический эффект подавляющего большинства противоопухолевых лекарств связывали с индукцией не совместимых с жизнью необратимых химических повреждений биомакромолекул клеток-мишеней: в первую очередь нуклеиновых кислот и белков. Так, доказано существование коррелятивной связи между количеством индуцированных биомолекулярных повреждений (разрывов молекулы ДНК, внутри- и межнитевых сшивок, сшивок «ДНК-белок» и др.) и цитотоксической эффективностью отдельных противоопухолевых препаратов. Изучению биохимических и молекулярно-
биологических аспектов взаимодействия противоопухолевых лекарств с живыми системами (от отдельных биомакромолекул и их супрамолекулярных ансамблей, субклеточных органелл, изолированных клеток до органов и тканей, а также организма в целом) посвящено огромное количество работ.
Вместе с тем, разными исследователями, на разных объектах, с использованием препаратов различной природы и механизма действия обнаруживались факты, которые не могли быть интерпретированы в рамках подобного понимания механизмов цитотоксичности. Попытки поиска новых внутриклеточных мишеней химиотерапевтических агентов значительно продвинули фундаментальные представления о молекулярной структуре и биологических функциях субклеточных органелл, в первую очередь - клеточного ядра, но, вместе с тем, не дали исчерпывающего объяснения механизмов цитотоксичности противоопухолевых лекарств.
Объяснение многим обнаруженным фактам было найдено в связи с интенсивным изучением в последнее десятилетие феномена программированной гибели клеток (111 К). Открытый в начале 70-х годов прошлого века процесс последовательного саморазрушения пораженных ионизирующим облучением тимоцитов долгое время рассматривался исключительно как уникальный механизм интерфазной гибели облученных иммунокомпетентных клеток лимфоидной ткани. Позднее было продемонстрировано глобальное значение процесса программированной гибели клеток для онто- и филогенеза, возникновения органной и тканевой специфичности, процессов эволюции, дифференцировки, специфической реакции на внешние воздействия и др. Только к концу 80-х - началу 90-х годов XX века начали появляться работы о роли ПКГ в реализации цитотоксического эффекта противоопухолевых химиотерапевтических препаратов и ионизирующего облучения на нормальные и опухолевые клетки в процессе специфической терапии онкологических заболеваний. Количество научных публикаций по проблеме лекарственной индукции ПГК в 90-е годы XX века росло лавинообразно, и конец второго тысячелетия отмечен серией аналитических обзоров, суммирующих результаты этих исследований. В частности, в статье
7 С.Кауфмана и У.Ирншау* приведена таблица лекарственных препаратов, являющихся индукторами ПГК. В нее вошли противоопухолевые соединения практически всех классов, начиная от наиболее «древних» препаратов (эмбихин, 5-фторурацил) до самых современных и перспективных лекарств (гемзар, флудара, паклитаксел, гливек, ритуксимаб, TRAIL). Таким образом, начала складываться концепция, согласно которой ПГК - это активная реакция клеток на воздействие факторов, вызывающих клеточный, в том числе генотоксический, стресс.
Вместе с тем, до сих пор нет единого мнения о роли ПГК в суммарном цитотоксическом эффекте консервативных методов лечения онкологических заболеваний - химио-, радио- и биотерапии. Сохраняет актуальность вопрос, является ли ПГК тем внутриклеточным механизмом, который исполняет процесс самоликвидации поврежденной цитотоксическими воздействиями клетки и определяет в конечном итоге эффективность специфической противоопухолевой терапии.
По современным представлениям, ПГК, часто отождествляемая с апоптозом (хотя последний является лишь частным морфологическим проявлением ПГК), протекает минимум в три стадии: стадия «индукции сигнала», стадия «принятия решения», стадия «исполнения приговора». Четвертой стадией процесса, не имеющей отношения собственно к ПГК, т.е. к исполнению клеткой суицидного акта, но необходимой для утилизации продуктов клеточной деградации, является фагоцитоз клеточных остатков тканевыми макрофагами - стадия «очищения».
Первая стадия обеспечивается возбуждением специфического сенсора. Роль сенсора может исполнять как внутриклеточная молекула, так и внеклеточный домен трансмембранного белка суперсемейства TNF-подобных рецепторов (TNFR1, TNFR2, Fas/APO-l/CD95, АРО-2, АРО-3 и др.) или других рецепторных молекул. Результатом возбуждения соответствующего сенсора является активация каскада последовательных
* Kaufmann S.H., Earnshaw W.C. Induction of apoptosis by cancer chemotherapy. II Exp. Cell Res.- 2000.- 256.- P. 42-49.
8 ферментативных реакций внутриклеточной передачи и анализа сигнала ПГК. Эта стадия может реализоваться различными путями, с вовлечением разнообразных компонентов каскада. Ее завершенность или, наоборот, блокировка зависят от баланса про- и антиапоптогенных факторов, так называемого «клеточного контекста», т.е. от гистогенетических и морфо-функциональных особенностей клетки, ее физиологического состояния, обратимости и интенсивности индуцирующего ПГК стимула, его соответствия «сигналам выживания», и т.д. Таким образом, первичный сигнал к ПГК может быть отменен или заблокирован на стадии «принятия решения». Если трансдукция сигнала не прервана, то результатом каскада является активация эффекторов ПГК - киллерных каспаз, эндонуклеаз и пр., что знаменует начало последней, необратимой и быстрой стадии «исполнения приговора». Активные киллерные каспазы атакуют так называемые ключевые субстраты, в результате чего происходит прогрессивное ферментативное расщепление компонентов клеточного ядра (фрагментация ДНК, ламин ядерной стенки, ключевых ферментов, белков цитоскелета и ядерного матрикса) и органелл; ядро, а затем и вся клетка, распадается на морфологически обособленные фрагменты, окруженные мембраной. Деплеция апоптотических клеток не сопровождается излиянием содержимого их цитозоля в межклеточную среду и не вызывает воспалительной реакции.
Последовательность внутриклеточных событий при возникновении повреждений биомакромолекул представляется следующей. Химическая модификация первичного акцептора (молекулы ДНК, ключевого фермента, субстрата перекисного окисления и др.) воспринимается сенсорной молекулой сигнального пути ПГК, что приводит к остановке деления клетки в одной из «сверочных точек» клеточного цикла и попытке репарации повреждений. При несостоятельности, незавершенности или недостаточности репаративных процессов происходит активация ПГК. Этот механизм цитотоксичности может реализоваться при физическом (ионизирующее и УФ-облучение, тепловой шок и др.), химическом (алкилирующие соединения, ингибиторы топоизомераз, противоопухолевые антибиотики, индукторы оксидативного стресса) и биологическом (функциональные аналоги природных
9 лигандов TNF-подобных рецепторов, дефицит факторов роста, утрата межклеточных контактов) поражении клеток-мишеней. Структурные повреждения или дефицит отдельных компонентов сигнальных путей ПКГ затрудняют проведение сигнала смерти вплоть до его полной блокировки.
Логично предположить, что потенциальная способность клетки-мишени к восприятию сигнала ПГК, полноценность путей его трансдукции и наличие работоспособного эффекторного звена являются необходимыми условиями суицидного клеточного ответа на цитотоксическое воздействие. Напротив, неспособность клетки-мишени к реализации ПГК должна сопровождаться ее резистентностью к цитотоксическому стрессу.
Такое же заключение следует из большого количества исследований, выполненных как с использованием клинического материала, так и с использованием генетически модифицированных клеточных линий. Ряд белков - компонентов цепей внутриклеточной трансдукции сигнала ПГК (р53, bcl-2, bcl-xl, bax, XIAP, SMAC, CD95 и др.) - могут являться биологическими маркерами характера течения опухолевого процесса, чувствительности к специфической терапии и общего прогноза заболевания.
Исследования основных механизмов и закономерностей формирования клеточного ответа на применение средств циторедуктивной противоопухолевой терапии, а также оценка роли репрессии ПГК в становлении фенотипа множественной лекарственной устойчивости являются актуальными проблемами современной онкологии, сочетающими фундаментальные и прикладные аспекты исследования. Экспериментальное доказательство теоретических положений того, что механизм цитотоксического действия противоопухолевых лекарств реализуется путем активации ими программированной гибели клеток-мишеней, а спонтанная или индуцированная репрессия ПГК сопровождается закономерным снижением лекарственной чувствительности опухолевых клеток, может быть квалифицировано как новое крупное научное достижение в области медицинской и биологической науки.
Цель работы: комплексное изучение роли программированной гибели клеток-мишеней в механизмах циторедуктивной противоопухолевой терапии.
10 Задачи:
Разработать методические подходы и экспериментальные модели интерфазного хроматина для исследований формирования клеточного ответа на цитотоксическое воздействие.
Определить характер и динамику формирования структурных изменений хроматина клеток перевиваемых опухолевых штаммов мышей при циторедуктивнои химио- и радиотерапии in vivo.
Проследить динамику индукции и развития программированной гибели опухолевых клеток при действии противоопухолевых химиотерапевтических препаратов, используя комплекс методов регистрации различных стадий ПГК.
Исследовать особенности и динамику рецепторно-лигандной индукции апоптоза рецептор-позитивных опухолевых клеток, используя специфическую активацию рецептора смерти CD95 агонистическими моноклональными антителами (аМКА) анти-СЭ95.
Получить ряд стабильных СБ95-негативных клеточных линий человека, используя прием хронической стимуляции рецептора CD95 аМКА aHTH-CD95.
Исследовать возможность и особенности рецепторно-лигандной и лекарственной индукции ПГК клеток полученных СВ95-негативных линий.
Провести сравнительный морфо-функциональный, биохимический и генетический анализ полученных СВ95-негативных клеток.
8. Определить спектры лекарственной чувствительности полученных СБ95-негативных
клеток и их родительских предшественников «дикого типа».
9. Сравнить характер клеточного ответа на проведенное «лечение» и проследить динамику
репопуляции клеточных культур Jurkat и А4, используя равноценные по биологической
эффективности для клеток каждой линии концентрации противоопухолевых
химиотерапевтических средств.
Научная новизна исследований.
На момент начала выполнения работы наши представления о механизмах цитотоксического действия противоопухолевых препаратов ограничивались суммой знаний о
молекулярных мишенях различных агентов. Разработан оригинальный методический подход к изучению супрамолекулярной структуры ядра и ее изменений в живых нормальных и опухолевых клетках при их инкубации с цитотоксинами. Обнаружены ранние изменения структуры хроматина опухолевых клеток, возникающие в процессе монотерапии in vivo и in vitro алкилирующими препаратами, противоопухолевыми антибиотиками, комплексными соединениями платины. Изменения структуры хроматина регистрируются при инкубации с противоопухолевыми соединениями только живых опухолевых клеток. Эти изменения не наблюдаются при действии препаратов на частично депротеинизированные клеточные ядра.
На двух клеточных линиях Т-лимфолейкоза человека - Jurkat и Н-9 - показана лекарственная и рецепторно-лигандная индукция ПГК, продемонстрирована эффективность in vitro специфической биотерапевтической деплеции субпопуляции CD95+-ioieTOK с использованием агонистических МКА к антигену CD95 (клон IPO-4). Впервые обнаружена потенциальная опасность развития в результате подобных воздействий множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток, которую следует учитывать при разработке новых средств биотерапии.
Впервые методом иммобилизации на ферросиликатных микрочастицах неагонистических анти-СБ95 МКА (клон ICO-160) получен иммуномагнитный биопрепарат, эффективно индуцирующий образование сигнального комплекса DISC в С095+-клетках линий Jurkat и Н-9.
Впервые методом СБ95-индуктивной селекции получена уникальная С095-негативная линия А4, клетки которой, в отличие от клеток родительской линии дикого типа Jurkat/wt, не реализуют ПГК при различных воздействиях (резистентны к цис-ДЦП, циклоплатаму, адриамицину, этопозиду, стауроспорину, циклогексимиду, менадиону, перекиси водорода, рентгеновскому и УФ-облучению, дефициту факторов роста, агонистическим МКА к CD95, цитокинам TRAIL и TNFa). Резистентность клеток линии А4 не связана с мутацией гена р53 или с гиперэкспрессией белков Вс1-2 и Bcl-XL. Полученный аналогичным методом CD95-негативный клон линии Н-9 явился резистентным к С095-индуцированной ПГК, но в полной
12 мере сохранил чувствительность к химиотерапевтическим противоопухолевым препаратам, характерную для родительской линии «дикого типа».
Впервые получена библиотека кДНК интактных клеток А4; методом конкурентной гибридизации с использованием ДНК-микрочипов (Affymetrix) проведен анализ экспрессии этими клетками более двадцати тысяч генов и их транскрипционных вариантов в сравнении с интактными клетками родительской линии Jurkat/wt. Показано, что уровень транскрипционной экспрессии генов основных компонентов каскадов сигнальных путей в клетках обеих линий идентичен.
Впервые получены библиотеки кДНК TRAIL-стимулированных к индукции ПГК клеток А4 и Jurkat/wt; методом конкурентной гибридизации с кДНК соответствующих интактных клеток показано, что набор максимально активируемых и максимально репрессируемых такой стимуляцией генов в клетках обеих линий идентичен.
Впервые выполнен сравнительный анализ белкового состава клеток А4 и Jurkat/wt методом 2D JEF-NEPHGE, являющимся первым этапом протеомного анализа. Обнаружено, что при большой степени сходства протеиновых профилей клеток обеих линий, свидетельствующей о значительной степени их морфо-функционального и метаболического родства, имеются заметные различия в уровне экспрессии отдельных белков.
Впервые сравнительный анализ экспрессии компонентов сигнальных путей выявил гиперэкспрессию в клетках А4 белка теплового шока HSP-90, а также экспрессию на поверхности клеток функционально активного мембраносвязанного энзима 5'-эктонуклеотидазы (CD73) и полное подавление экспрессии молекул адгезии ICAM-3 (CD50).
Впервые исследован спектр лекарственной чувствительности клеток линии А4 в сравнении с родительской линией Jurkat/wt. Показан фенотип множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) этих клеток, коррелирующий с резистентностью к индукции ПГК.
Научно-практическая ценность.
В результате исследований показано, что механизмы циторедуктивного действия специфической противоопухолевой терапии с применением большинства лекарственных
средств реализуются путем активации собственной программы гибели клеток-мишеней. Репрессия программы клеточной гибели сопровождается формированием у клеток фенотипа МЛУ, существенно ограничивающим возможности консервативных методов лечения онкологических заболеваний. Такая ситуация является следствием несовершенства используемых до настоящего времени систем отбора синтетических и природных соединений с потенциальной противоопухолевой активностью: активные лекарственные вещества, отобранные в клеточных системах с функционирующей программой клеточной гибели, оказываются не эффективными при ее репрессии.
Полученная в результате исследований мультирезистентная линия А4 Т-лимфобластного лейкоза человека депонирована в Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, С.-Петербург) под номером РККК (П) 682Д и может быть использована в качестве прототипа скрининговой системы с подавленной функцией ПГК для отбора потенциально противоопухолевых соединений, специфическая активность которых не связана с реализацией ПГК.
Продемонстрировано, что устойчивая репрессия опухолевыми клетками ПГК может формироваться без применения средств химиотерапии, как одно из проявлений опухолевой прогрессии, в том числе под действием медиаторов неспецифического противоопухолевого иммунитета.
Положения, выносимые на защиту
Цитотоксическое действие противоопухолевых препаратов связано с активацией программы гибели клеток-мишеней.
Повреждение или репрессия ПГК ведет к становлению фенотипа мультирезистентности клеток к индукторам ПГК, сопровождающимся множественной лекарственной устойчивостью.
Репрессия ПГК может происходить без участия средств химиотерапии как проявление опухолевой прогрессии.
При репрессии функции ПГК возможности современной циторедуктивной терапии
14 опухолей оказываются исчерпанными. Такое положение является следствием применяющейся системы отбора противоопухолевых препаратов: активные в отношении клеток-мишеней с функционирующей системой 111'К, они оказываются не эффективными при репрессии суицидной программы.
Соответствие работы плану Научно-исследовательских работ Института.
На всех этапах исследования диссертационная работа выполнялась в рамках основного плана НИР НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, в частности, тем РАМН «Поиск новых противоопухолевых агентов , доклиническое изучение их специфической активности и механизма действия», Госрегистрация № 01990011388, шифр № 510 и "Изучение действия некоторых химических и физических факторов и их сочетаний на жизнедеятельность, состав и кинетику популяций опухолевых и нормальных клеток», Госрегистрация № 01200012562, шифр 535.
Апробация результатов исследования.
Апробация диссертации состоялась 20 мая 2004 г. на совместной научной конференции лаборатории фармакоцитокинетики, лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаборатории биохимической фармакологии, лаборатории экспериментальной терапии метастазов, лаборатории лучевых методов лечения опухолей, лаборатории комбинированной терапии опухолей, лаборатории медицинской биотехнологии НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ РАМН, отдела клинической иммунологии НИИ КО ГУ РОНЦ РАМН.
Основные положения диссертации опубликованы в печатных работах, были
представлены в качестве стендовых сообщений и докладов:
11-th Nuclear Workshop, Sept. 18-23, 1989, Suzdal, USSR; 15-th Int. Cancer Congress, Aug. 16-22, 1990, Hamburg, Germany; X Всесоюзн. симп. «Структура и функции клеточного ядра», 10-14 окт., 1990, Гродно, СССР; 7-th NCI-EORTC Symp. on new drugs in cancer therapy, March 17-20,
15 1992, Amsterdam, Netherlands; I Междунар. конф. «Иммунодиагностика и иммунотерапия»,
Витебск, Беларусь; 6-th Int. Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens,
UK; AACR Spec. Conf, Bolton Landing (Lake George), Oct. 19-23, 1996, New York, USA; 7-th and 8-th Int. Congr. on anti-cancer treatment, Feb. 3-6,1997 and 1998, Paris, France; Int. Conf. on Hematol. malignancies and high-dose chemotherapy, 1997, Hamburg, Germany; V Росс. Нац. конгр. «Человек и лекарство», 21-25 апр. 1998, Москва, Россия; 10-th NCI-EORTC symp. on new drugs in cancer therapy, June 16-19, 1998, Amsterdam, Netherlands; 5 Bcepocc. съезд онкологов «Высокие технологии в онкологии», 4-7 окт. 2000, Казань, Россия; Конф. «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге-2001», 21-25 мая 2001, С.-Петербург, Россия; 18-th Int. Symp. on Мої. aspects of Chemotherapy, Sept. 5-9, 2001, Gdansk, Poland; 4-th World Meeting ADRITELF/APGI/APV, Florence, Italy, April 8-11, 2002; 10-й Междунар. Плеская конф. по магнитным жидкостям, сент. 2002, Плес, Россия; 3-rd Eur. Workshop on Cell Death. Feb. 23-28, 2002, Salobrena, Spain; 18-th UICC Int. Cancer Congr., June 30 - July 5, 2002, Oslo, Norway; 10-th Euroconf. on Apoptosis "Charming to Death", Oct. 11-13, 2002, Paris, France; Мед.-фарм. форум, 29 окт.-2 нояб., 2002, Москва, Россия; I Симп. «Применение биомагнитных носителей в медицине», 19-20 нояб. 2002, Москва, Россия; 4-th Int. Conf. "Scientific and clinical applications of magnetic carriers", May 9-11, 2002, Tallahassee, Florida, USA; Miami Nature Biotech. Winter Symp., Feb. 1-5, 2003, Miami, Florida, USA; 5-th Int. Workshop on Adv. Genomics, June 26-27, 2003, Yokohama, Japan; Int. Conf. on Applied Genomics 9-th ESACP/16-th ISDQP Meeting, Oct. 1-4, 2003, Amsterdam, Netherlands; Int. Symp. "New Horizons in Мої. Sciences and Systems: An Integrated Approach", Oct. 16-18, 2003, Okinawa, Japan; 2-я и 3-я Bcepocc. Конф. «Отечественные противоопухолевые препараты», март, 2003 и 2004, Москва, Россия.
Объем и структура диссертации.
Диссертационная работа изложена на 275 стр. машинописного текста. Диссертация состоит из введения, трех тематических частей, общего заключения, выводов и списка цитированной литературы. Иллюстрации - 77 рисунков и 19 таблиц.
Структуры ДНК высших порядков организации
С-форма, образующаяся в присутствии солей лития, напротив, является более «рыхлой», чем В-форма: виток содержит 9 нуклеотидных пар. Абсолютно уникальной является открытая относительно недавно левозакрученная Z-форма ДНК, содержащая 12 нуклеотидов на один виток [280]. В пределах канонических форм возможно существование определенных вариантов, переходы между которыми осуществляются некооперативно, в отличие от кооперативных переходов от одной канонической формы к другой.
Конформационные переходы на отдельных участках гигантской молекулы ДНК важны для высших уровней организации и функционирования хроматина и будут обсуждаться в соответствующем разделе. Здесь же следует отметить, что наличие двойной спирали в любой из канонических форм возможно не только при участии двух нитей, но и на отдельном участке однонитевой молекулы, однако при условии, что этот участок будет нести палиндромную последовательность оснований. В таком случае на участке двунитевой молекулы ДНК образуется «шпилька» или «крест», представляющий собой симметричный дуплексный отросток, ось которого перпендикулярна основной оси молекулы. Обратимое образование «шпилек», как и конформационные переходы молекулы, играет определенную роль в регулировании активности отдельных генов. В предыдущих разделах кратко рассмотрена структура молекулы ДНК вне ее связи с другими компонентами хроматина. Все последующие уровни организации этого биополимера охватывают структуру супрамолекулярного комплекса ДНК. В составе хроматина молекула ДНК находится во взаимодействии с большим количеством белков (массовое соотношение ДНК:белок в ядрах разных клеток различается, но в среднем составляет величину 1:1), которые делят на две неодинаковые группы - гистоны и негистоновые белки. Гистоны (белки основного характера, растворимые в кислотах) составляют большую часть (до 80%) суммарных ядерных белков, негистоновые белки (кислые, нейтральные и некоторые слабо основные) составляют количественно меньшую часть ядерных белков, но объединяют в своей группе значительно большее разнообразие структурных, ферментативных и регуляторных белковых компонентов хроматина. Структура нуклеогистонового комплекса хорошо изучена и определяется двумя уровнями организации - нуклеосомным и нуклеомерным [220]. Нуклеосомы представляют собой нуклеопротеидные частицы диаметром 10 нм, состоящие из центральной (коровой) белковой частицы с соленоидоподобной укладкой двунитевой молекулы ДНК на ее поверхности. Коровая частица является октамером четырех гистонов (у человека - гистоны Н2а, Н2Ь, НЗ и Н4), по две молекулы каждого на одну частицу. Длина участка ДНК, непосредственно контактирующая с коровой частицей, составляет 140 пар нуклеотидов (п.н.), что соответствует ММ ок. 100 кДа. ДНК, контактирующая с коровыми частицами, стерически защищена от действия эндонуклеаз. Молекула ДНК образует на поверхности коровой частицы два витка, после чего, не обрываясь, переходит на следующую коровую частицу. Длина свободного участка ДНК между соседними коровыми частицами («спейсер») оценивается в 30-60 п.н. (10-20 нм). Морфологически нуклеосомный уровень организации хроматина выглядит как «бусинки на нитке» (Рис. 1.2. - заимствовано из [57]). Со спейсером ассоциирован гистон НІ, защищающий от действия эндонуклеаз свободный вненуклеосомный участок ДНК и имеющий значение для формирования следующего уровня организации хроматина - нуклеомеров [166, 316]. Нуклеомеры являются олигомерами нуклеосом, образующими супербидную (от англ. super beads - большие шары) спираль. Нуклеомерная организация свойственна транскрипционно неактивному хроматину и обеспечивает его высокий уровень компактизации и защиты от нуклеазного расщепления. В процессе репликации ДНК таких участков хроматина вся конструкция разбирается, ДНК проходит этап репликативного синтеза, после чего фактор сборки хроматина CAF-1 (Chromatin assembly factor 1) доставляет к вновь синтезированной ДНК димер состава НЗ/Н4. На следующем этапе сборка нуклеосом завершается встраиванием в них димеров Н2а/Н2Ь с участием нуклеоплазмина. Присутствие нуклеосом в промоторных участках генов препятствует образованию инициационного комплекса транскрипции, в состав которого входят РНК-полимераза и факторы транскрипции, и для инициации транскрипции необходимо локальное разрушение нуклеосомной структуры хроматина в окрестностях промотора и регуляторных элементов. При этом конститутивно транскрибируемые гены вовсе не имеют нуклеосомной структуры в промоторной области. Не вполне ясен механизм, посредством которого поддерживается непрерывное существование участка в виде свободной от нуклеосом последовательности ДНК: либо факторы транскрипции успевают провзаимодействовать с промоторным участком еще до сборки нуклеосом, либо эти факторы связываются с соответствующими участками ДНК, содержащими нуклеосомы, и дестабилизируют последние. Таким образом, обратимая сборка-разборка нуклеосом является регуляторным элементом функциональной активации генов, а хранение транскрипционно неактивного хроматина в форме супербидной спирали хромомеров предотвращает риск нуклеазного переваривания генетического материала. Значительно менее изучены взаимоотношения ДНК с негистоновыми белками хроматина. В первую очередь это связано с огромным количеством негистоновых белков, часть из которых обладает видовой и тканевой специфичностью. По данным двухмерного электрофореза, число негистоновых белков ядра превышает 450, включая модифицированные формы [46], однако это количество учитывает только мажорные фракции, доступные визуализации при существующих методах неспецифического окрашивания электрофореграмм. С учетом минорных белковых компонентов клеточного ядра реальное количество негистоновых белков хроматина может измеряться тысячами. До сих пор отсутствует единая классификация негистоновых белков, для их классификации используют прочность их связи с хроматином (экстрагируемость), физико 26 химические свойства (растворимость, изоэлектрическая точка, молекулярная масса, подвижность при электрофорезе и др.), функциональные свойства, ферментативную активность. Часто негистоновые белки классифицируют на основании способа их выделения из препаратов тотального хроматина в растворах различной ионной силы и с содержанием разных диссоциирующих агентов. Так, до 10% негистоновых белков может быть извлечено из хроматина экстракцией 0,35 М NaCl («глобулиновая фракция» хроматина); до 90% негистоновых белков удаляется обработкой ядер 2,0 М NaCl с 5 М мочевины или 37% раствором гуанидин-хлорида. Большая часть остаточных после такой экстракции белков может быть отделена додецилсульфатом натрия (SDS), 2-меркаптоэтанолом и щелочью. Однако и после такой обработки с ДНК остается связанной небольшое количество белка, который не удаляется даже при депротеинизации ДНК фенолом или хлороформом [258]. Следовательно, взаимоотношения ДНК с разными негистоновыми белками не равнозначны, и говорить о нативнои структуре супрамолекулярного комплекса хроматина можно только с позиции сохранения интактности тех или иных взаимодействий в конкретных препаратах изолированного хроматина.
В рамках настоящего исследования из всего многообразия негистоновых белков хроматина следует выделить компоненты ядерного матрикса (скелетной фибриллярно-гранулярной структуры ядра) и небольшую группу обычно сопутствующих им белков (компоненты подмембранного фиброзного слоя ядра - ламины, белки ядерных пор и некоторые другие).
Белковый состав ядерного матрикса в клетках различных тканей
Разумеется, только на основании одномерного электрофореза белков нельзя сделать вывода об их природе. Однако сравнение с результатами других авторов позволяет сделать предварительные заключения. Прежде всего, диапазон молекулярных масс от 40 до 70 кДа, в котором находится большинство обнаруженных нами полипептидов, характерен для прочно связанных с ДНК белков ядерного матрикса, выделенных другими методами: обработкой фенолом и протеиназами, мягкой обработкой фенолом, саркозилом и хлористым цезием, лизисом в SDS и мочевине с последующим делением на гидроксиапатите. Сходство по полипептидному составу, возможно, отражает и аналогичные функции этих белков. В частности, мы предполагаем, что «прочный» тип связи ассоциирован с репликативным комплексом; полученные другими методами прочные ДНК-белковые комплексы обогащены реплицирующейся ДНК или ДНК-РНК-гибридами [114], что указывает на их причастность к процессу репликации и/или транскрипции.
Триплет с молекулярной массой 65-75 кДа по молекулярным массам (!) весьма сходен с ламинами. Известно, что ламины играют важную роль в ДНК-белковых взаимодействиях на ядерном матриксе. Один из устойчивых к фенольной депротеинизации ДНК-связанный белок отождествлен с ламином С.
Особого внимания заслуживает полипептид 180 кДа, который по молекулярной массе близок с топоизомеразой II — основным компонентом остова метафазных хромосом. Показано, что этот фермент является структурным компонентом мета-фазного и интерфазного ядерного скелета. В интерфазном матриксе фермент локализован на внутриядерных фибриллах, в районе контакта с петлями ДНК. Комплекс ДНК и топоизомеразы образован ковалентной связью, замыкание которой сопровождается разрывом ДНК в сайте прикрепления белка. При действии ингибиторов топоизомеразы в клетках накапливаются так называемые белок-ассоциированные разрывы ДНК. Возможно, аналогичный механизм накопления разрывов [114] и сшивок ДНК-белок сопровождает физиологический переход клеток от деления к покою.
Обсуждая полученные результаты, следует подчеркнуть, что большинство полипептидов, обнаруженных нами в препаратах комплексов ДНК-матрикс с «прочным» и «слабым» типом связи, видимо, следует отнести к группе прочно связанных с ДНК белков. В этой связи критерий «прочной» и «слабой» связи, положенный в основу интерпретации результатов НПЦ-хроматографического анализа [82, 83], требует определенного уточнения при рассмотрении вопросов молекулярной организации хроматина.
Термины «слабая» и «прочная» связь адекватно обозначают способность ДНК удерживаться на целите в составе нуклеопротеида с последующей десорбцией в градиенте хлористого лития — мочевины или при нагревании до температуры плавления двойной спирали соответственно. Предполагалось, что элюция ДНК с колонки сорбента происходит при ее полной депротеинизации, т. е. при отщеплении от белковых компонентов комплекса, необратимо сорбированных на целите [82]. Данное предположение, однако, не учитывало факт существования некоторых белков, чрезвычайно прочно, возможно, ковалентно связанных с ДНК.
Представленные в настоящей разделе результаты также противоречат этому предположению, поскольку по крайней мере пять полипептидов (ММ 180, 65-75 и 58 кДа) присутствуют в обоих препаратах ДНК-белковых комплексов, т. е. не удаляются ни инкубацией в хлористом литии - мочевине, ни обработкой ДНКазой I. Наиболее вероятно, что эти белки не участвуют в процессах взаимодействия нуклеопротеида с целитными сорбентами. Видимо, в образование «слабой» и «прочной» связей ДНК-матрикс вовлечены полипептиды с ММ 47-50, 52-53 и, возможно, два белка 61 и 63 кДа, т.е. те белки, которые отличают препараты с «прочным» и «слабым» типом взаимодействия (см. Рис. 2.15.). В то же время нельзя исключить, что эти белки связываются с ДНК не непосредственно, а тандемно с участием прочно связанных с ДНК белков, т.е. структура участка прикрепления ДНК к элементам ядерного матрикса может являться мультикомпонентной. В этом случае молекулярные механизмы индукции и деградации «прочной» связи при переходе клеток от покоя к делению и обратно могут осуществляться на уровне изменения белок-белковых взаимодействий.
Ядерный матрикс представляет собой остаточную структуру интерфазного ядра клеток эукариот, устойчивую к последовательным обработкам нуклеазами, неионными детергентами и растворами с высокой ионной силой. Ядерный матрикс состоит в основном из негистоновых белков ядра и включает небольшие количества ДНК, РНК, липидов и углеводов. Являясь пространственно-организованной структурой, ядерный матрикс обеспечивает поддержание определенной архитектоники хроматина и регулируемое функционирование генома клетки. Известно несоответствие понятия «ядерный матрикс» строго ограниченному морфо-функциональному образованию клеточного ядра, в связи с чем морфология и состав препаратов ядерного матрикса в значительной мере зависят от процедуры их выделения [38].
В то же время считают, что состав и структура ядерного матрикса подвержены динамическим изменениям в процессе функционирования клетки (см. 1.2.). Отсутствие единого методического подхода к выделению препаратов ядерного матрикса затрудняет сопоставление результатов разных авторов, полученных даже при исследовании одного и того же объекта [38].
Нашей задачей явилось сравнительное изучение белкового ядерного матрикса, выделенного из большого числа различных клеток животных, но в строго одинаковых условиях получения препаратов [22, 71].
Материалы и методы. Дополнительно к описанным выше, в настоящем разделе работы применялись следующие материалы и методы:
Объектами исследования служили тимоциты и нормальные гепатоциты мышей линии DBA/2, клетки нормальной и регенерирующей (через 24 ч после частичной гепатэктомии) печени крыс Wistar, спермин и эритроциты пресноводного вьюна, первичная трипсинизированная культура эпителия почек зеленых мартышек (производство Ин-та полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, любезно предоставлена Т.А.Блохиной, Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н. Габричевского МЗ РФ), клетки перевиваемых опухолей: асцитная гепатома Зайделя, асцитный вариант саркомы-37 (С-37), лейкозы L1210, Р388 мышей и подштамм Р388/ад., адаптированный для культивирования in vitro, а также подштамм Р388/АМД с индуцированной резистентностью к актиномицину Д.
В качестве основного метода получения препаратов ядерного матрикса использовали метод [114], модифицировав его в ходе предварительных исследований. Все использующиеся растворы готовили на основе низкосолевого магниисодержащего буфера ТКМ (25 мМ трис-HCl, рН 7,6, 25 мМ КС1, 5 мМ MgCl2) с добавлением до 1,0 мМ PMSF. К 1,0 мл профильтрованной (40 мкм) клеточной суспензии в растворе Хенкса (спермин и эритроциты вьюна суспендировали в 0,5 %-ном растворе NaCl) при 0С прибавляли 1,0 мл холодного буфера для вскрытия клеток (буфер ТКМ с добавлением 0,5 % тритона Х-100, 0,5 М сахарозы, 1 мМ 2-МЕ, PMSF), дегазированного под вакуумом перед использованием. Суспензию пипетировали 3 мин при 0С и инкубировали 10 мин. Ядра осаждали центрифугированием (2000 об/мин, 5 мин, 4С, центрифуга К-23), промывали в буфере для вскрытия клеток и дважды — в буфере ТКМ. Осадок ресуспендировали в буфере для переваривания ДНК (5 ед. Кунитца в 1 мл ДНКазы I, 20 ед/мл бактериальной эндонуклеазы в буфере ТКМ), инкубировали 60 мин (20С), осаждали центрифугированием (2500 об/мин, 5 мин, 20С) и дважды по 10 мин экстрагировали в 2,0 М NaCl (в ТКМ) при 20С.
Лекарственная индукция апоптоза клеток линии Jurkat/wt и А4.
Для этого МКА предварительно диализовали против ацетатного буфера, рН 3,5. Раствор МКА обрабатывали пепсином (Sigma, США) в течение 4 ч при комнатной температуре. После образования кристаллического осадка Fc-фрагментов образец центрифугировали с угловым ускорением 400 g в течение 15 мин. Супернатант собирали и проводили его гель-фильтрацию на колонке 2,5 х 80 см Sephadex G-100 (Pharmacia, Швеция). После сбора на коллекторе фракции, соответствующей F(ab )2 фрагментам, гомогенность препаратов оценивали методом SDS-электрофореза в 10 % ПААГ в редуцирующих условиях по Лэммли, используя набор стандартных белков-маркеров.
Тотальный клеточный лизат получали лизисом 1 10 клеток в «буфере образца» с 2% SDS и 100 мМ DTT (по Лэммли), электрофорез вели в 10% ПААГ. По окончании разделения, белки переносили из геля на PVDF-мембрану (Amersham, Pharmacia Biotech, Англия) поперечным электрофорезом. Участки неспецифического связывания блокировали 5 % раствором BSA в буфере состава 125 mM NaCl, 25 тМ MOPS, 12.5 тМ КОН, 0.1% Tween-20. Мембраны с перенесенными на них белками инкубировали в течение ночи с первичными МКА (см. 4.1.3.2.), в буфере того же состава при 4С, после чего проявляли иммуноблоты реакцией с соответствующими конъюгатами вторичных антител с пероксидазой хрена. Хемилюминесцентное детектирование специфических полос выполняли с использованием ECL+ system (Amersham, Англия). Иммуноблоттинг белков выполнен на базе Центра Биотехнологии Университета г. Турку А.А.Соколовской.
Для определения активации каспазы-3 1 10 клеток обрабатывали в соответствии с Инструкцией к набору Apoptosis Kit-1 (BD PharMingen, США) и инкубировали с РЕ-меченными МКА к активной каспазе-3 из состава набора. Анализ проводили методом проточной цитофлюориметрии.
Общую активность каспазы-3 в клеточных экстрактах оценивали флюоресцентным методом с использованием набора Caspase-3 Wallak Kit (Wallak, Финляндия) в соответствии с Инструкцией изготовителя. Определение активности каспазы-3 выполнено на базе Центра Биотехнологии Университета г. Турку А.А.Соколовской и А.Д.Михайловым.
Конкурентная гибридизация кДНК на экспрессионных ДНК-микрочипах. Препараты общей РНК выделяли из 8 10 клеток с использованием процедуры и реагентов, рекомендованных производителем микрочипов. Библиотеки мРНК изолировали из препаратов общей РНК с использованием гибридизации на иммобилизованных олиго-dT-нуклеотидах. Библиотеки СуЗ- и Су5-меченных кДНК получали обратно-транскриптазной реакцией полимеризации кДНК на матрицах мРНК. Меченные различными флюорофорами библиотеки кДНК двух сопоставляемых в одной конкурентной гибридизации клеточных культур смешивали и выполняли гибридизацию с олигонуклеотидными зондами ДНК-микрочипов в дупликатах для каждого образца. Результаты гибридизации регистрировали и нормализовали с использованием оборудования и программного обеспечения производителей ДНК-микрочипов (Affymetrix, США; Centre for Biotechnology, University of Turku, Финляндия). Гибридизационный анализ выполнен на технической базе Центра Биотехнологии г.Турку (Финляндия) при любезной помощи А.Д.Михайлова и И.Е.Эрикссона.
Клеточные культуры в экспоненциальной фазе роста в питательной среде RPM1-1640 без L-метионина высевали в лунки 24-луночного культурального планшета по 1 105 клеток в объеме 500 мкл на лунку. К клеточной суспензии добавляли [358]-Ь-метионин (Amersham -Pharmacia Biotech, Англия) до конечной концентрации 8 МБк/мл и инкубировали клетки при 37С в атмосфере 5% СОг в воздухе. Через 18 ч инкубации к клеткам в контрольных лунках добавляли по 50 мкл изотонического раствора NaCl, а в опытные лунки - по 55 мкл раствора этопозида (50 мкг/мл); продолжали инкубацию в течение еще 6 ч, после чего клеточную суспензию собирали в пробирки типа Eppendorf, клетки осаждали центрифугированием, дважды промывали питательной средой без добавления сыворотки, помещали на ледяную баню и немедленно лизировали раствором, содержащим 62,5 тМ Трис-HCl, рН 6.8, 1 % NP-40, 8 М мочевины, 2 % амфолина 3-Ю (Pharmacia, Швеция), 1 mM PMSF, 10 ед/мл апротинина, при периодическом встряхивании. Через 1 ч клеточные лизаты замораживали при -70С и сохраняли в замороженном состоянии до анализа.
Анализ белкового профиля выполнен П.С.Громовым на базе Отдела протеомики Института биологии рака Датского Онкологического Общества (Копенгаген, Дания) методом двухмерного электрофореза в полиакриламидном геле по протоколу [99]. Гели, содержащие двухмерные электрофореграммы, проявляли авторадиографией на рентгеновской пленке (Kodak, США).
Светлопольную микроскопию фиксированных мазков клеточных суспензий и цитопрепаратов, окрашенных азур-эозином по Романовскому, выполняли с использованием люминесцентного микроскопа Axioscope-20 и фазовоконтрастного микроскопа Jenaval (оба производства Carl Zeiss Jena, Германия) при оптическом увеличении 200х - бООх. Захват видеоизображения осуществляли с использованием цифровой камеры 3-CCD (SONY М, Япония). Обработку и анализ изображений проводили с помощью программного обеспечения KS-100 Adobe Photoshop (Carl Zeiss Jena, Германия).
Прижизненную световую и фазовоконтрастную микроскопию суспензионных клеточных культур проводили с использованием микроскопа Labovert (Opton, Германия) с инвертированной оптической схемой.
Меченные флюоресцентными зондами или флюоресцирующими конъюгатами МКА клеточные препараты оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа Axioscope 20 (Carl Zeiss Jena, Германия) при оптическом увеличении 200х - 1250х, с использованием систем пропускающих и запирающих светофильтров для FITC/TRITC и UV/DAPI. Захват видеоизображения осуществляли с использованием цифровой камеры 3-CCD (SONY М, Япония). Обработку и анализ изображений проводили с помощью программного обеспечения KS-100 Adobe Photoshop (Carl Zeiss Jena, Германия). Флюоресцентная микроскопия выполнена А. А.Соколовской и А.АМосковцевым.
Иммуномагнитный препарат на основе МКА aHTH-CD95 (клон ICO-160, МедБиоСпектр, Россия) для индукции и изоляции сигнального комплекса DISC изготовлен путем иммобилизации неагонистических МКА на поверхности ферросиликатных микрочастиц (диаметр 2-3 мкм, намагниченность насыщения 20 emu/g), активированных ТІСЦ. Незаполненные сайты связывания белков блокировали последующей сорбцией BSA в Трис-глициновом буфере (рН 8.3). Клетки линий Н-9 и Jurkat инкубировали с иммуномагнитным препаратом в полной питательной среде при комнатной температуре в течение 20 мин, после чего лизировали добавлением Protein extraction reagent (Pierce, США), иммуномагнитный препарат собирали из клеточного лизата на магнитный стержень, дважды промывали и переносили в «буфер образца» для электрофоретического анализа по Лэммли. Ферросиликатная микродисперсная матрица магнитного препарата изготовлена на базе НПЦ МедБиоСпектр О.Л.Ершовым и В.И.Филипповым.
Состояние про-и антиапоптогенных сигнальных путей в клетках двух линий
Из неожиданных находок, результаты гибридизации кДНК выявили значительный акцент в клетках А4 на экспрессию белков теплового шока HSP-27, -70 и -90; оверэкспрессия последнего подтверждается результатами иммуноблоттинга (Рис. 7.7., Табл. 7.4. - см. ниже, раздел 7.4.). Учитывая возрастающий интерес к этим белкам как к потенциальным регуляторам процессов программированной клеточной гибели [197], они могут оказаться претендентами на ключевые роли в процессе формирования мультирезистентного фенотипа клеток А4.
Обозначились еще два возможных кандидата на ту же роль: гиперэкспрессия 5 -эктонуклеотидазы (CD73), обнаруженная в клетках А4 (Табл. 7.2., Рис. 7.3.), в ряде случаев коррелирует с фенотипом множественной лекарственной устойчивости [308, 323], а С-терминально связывающий белок-2 (Cerminal Binding Protein-2, QBP2), также оверэкспрессированный в этих клетках, рассматривается как транскрипционный супрессор ряда генов, продукты которых вовлечены в процессы внутриклеточного сигналинга [132, 133, 177, 178, 186]. К вопросу о возможной роли CD73 в осуществлении антиапоптогенной программы клетки мы вернемся в Разделе 7.5. настоящей Главы.
Получив массивный объем информации об относительной и абсолютной транскрипционной активности в интактных клетках обеих линий большого числа генов, мы практически не продвинулись в понимании причин мультирезистентности клеток А4. Оставалось надеяться, что специфическая стимуляция проапоптогенной программы даст ожидаемые результаты.
В предыдущей Главе показано, что клетки Fas/Apo-l/CD95-HeraTHBHofi линии А4 продолжают (как и клетки родительской линии Jurkat/wt) экспрессировать некоторые
179 рецепторы суперсемейства TNFRSF, в частности, рецепторы DR5 для TRAIL и TNFR-1 для TNFa (Табл. 6.1.), однако стимуляция этих рецепторов соответствующими лигандами не сопровождается, в отличие от родительских клеток «дикого типа», индукцией апоптоза клеток А4 (Рис. 6.5., С). Экспрессионный анализ библиотек кДНК, полученных из интактных и TRAIL-стимулированных в течение 4 ч клеток Jurkat/wt и А4 показал, что из 25 генов, в наибольшей степени активируемых такой стимуляцией (Up-регуляция), а также - из 25 генов, в наибольшей степени репрессируемых тем же воздействием (Down-регуляция), в обеих клеточных линиях совпадает по меньшей мере 10 активируемых и 9 репрессируемых генов; при этом степень изменения транскрипционной активности регулируемых генов в клетках обеих линий идентична (Табл. 7.3.).
И хотя в этом скудном списке встречаются отдельные участники про- и антиапоптотической программы, знакомые нам по Главе 3 («Обзор литературы»), например, протеин-киназа JNK, белок динеинового моторного комплекса DLC, альфа-субъединица протеасом, тиоредоксин-редуктаза, а также - ряд транскрипционных факторов, значительное совпадение генов-мишеней транскрипционной активации в клетках обеих линий сопровождается совершенно различным клеточным ответом на действие стимулятора.
Возможно, это связано с отсутствием необходимости транскрипционной активации программы клеточной гибели, поскольку все компоненты суицидной машины должны конститутивно присутствовать в клетке в латентном состоянии (см. Главу 3 «Обзор литературы»). В таком случае, принятие решения об активации 111К происходит на посттранскрипционном и, возможно, на пост-трансляционном уровнях. Действительно, аппарат ПГК должен быть способен к активации при возникновении нерепарируемых генетических повреждений в условиях транскрипционной репрессии. В противном случае он становится бесполезным.
Анализ протеинового профиля суммарных лизатов интактных и стимулированных к апоптозу клеток обеих линий выполнен на базе Отдела протеомики Института биологии рака Датского онкологического общества (Копенгаген, Дания) методом двухмерного электрофореза в полиакриламидном геле по протоколу [129]. Результаты IEF-NEPHGE распределения белков интактных клеток Jurkat/wt и А4 представлены на Рис. 7.4.; области гелей, соответствующие наиболее заметным различиям белкового профиля, помечены маркерами.
Инкубация клеток обеих линий с этопозидом в течение 6 ч не привела к сколь-нибудь заметному изменению их протеинового профиля: на Рис. 7.5. показаны результаты 2D-электрофореза интактных и инкубированных с этопозидом клеток Jurkat/wt, аналогичные результаты, полученные с клетками А4, не представлены.
Следует отметить, что, поскольку метод IEF-NEPHGE позволяет провести инвентаризацию белков не только по первичной последовательности составляющих их аминокислот, но и по их посттрансляционным модификациям, включая процессинг, фосфорилирование, ацетилирование, гликозилирование и др., общая картина протеинового профиля интактных клеток обеих линий весьма сходна, что свидетельствует об их значительном метаболическом родстве. Обнаруженные различия касаются нескольких мажорных белков, выявляемых методами авторадиографии и серебряного окрашивания.
Идентификация различающихся белков требует проведения их полного протеомного анализа, включающего технологию MALDIOF (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight), что при наличии соответствующей задачи может являться предметом отдельного, достаточно трудоемкого и весьма дорогостоящего исследования. В задачи настоящей работы решение данной проблемы не входило.
![Флюоресцентная диагностика и фотодинамическая терапия опухолей органа зрения с применением фотосенсибилизатора хлоринового ряда [Электронный ресурс]](/i/i/4602/185091.png "Флюоресцентная диагностика и фотодинамическая терапия опухолей органа зрения с применением фотосенсибилизатора хлоринового ряда [Электронный ресурс] Крупнов Роман Николаевич")