Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 16
1. Фосфатсодержащие противоопухолевые липиды 16
1.1.Эдельфозин 17
1.2. Илмофозин 19
1.3.Милтефозин 20
1.4.Перифозин 22
1.5.Эруфозин и эрицилфосфохолин 23
2. Бесфосфорные глицеролипиды алкильного типа с положительно 25 заряженным полярным доменом
3. Апоптотическая гибель опухолевых клеток при действии фосфатсодержащих липидов 30
3.1.Механизм действия эдельфозина и его аналогов,
опосредованный изменениями цитоплазматической мембраны 31
3.2. Механизм действия эдельфозина и его аналогов, опосредованный локализацией в эндоплазматическом ретикулуме 36
3.3.Развитие митохондриального пути апоптоза при действии фосфатсодержащих противоопухолевых липидов 38
4. Механизмы гибели опухолевых клеток 39
4.1.Рецептор-опосредованный (внешний) апоптоз 40
4.2.Митохондриальный (внутренний) апоптоз. Каспазозависимый и каспазонезависимый пути 42
4.3. Некроз, регулируемый некроз, некроптоз 45
4.4.Аутофагия 46
4.5. «Митотическая катастрофа» 47
4.6. Аноикис 48
4.7. Энтоз 48
4.8. Партанатоз 49
5. Протеинкиназы как возможные мишени противоопухолевых липидов 49
5.1.Протеинкиназы С 50
5.2. Протеинкиназа Met 53
5.3. Протеинкиназа Src 54
5.4. Киназа инсулинового рецептора 56
5.5. Протеинкиназа Pim-1
5.6 Материалы и методы исследования
1. Культивируемые клеточные линии 59
2. Препараты для исследований 59
3. МТТ-тест для исследования цитотоксичности 61
4. Исследование действия липидов на лимфоциты 61
5. Исследование способности липидов повреждать мембрану эритроцитов 62
Исследование способности липидов повреждать смоделированную мембрану липосом
Окраска клеток пропидия иодидом для исследования изменений клеточного цикла 63
8. Обратная транскрипция и ПЦР (RT-PCR) 63
9. ПЦР в реальном времени (Realime PCR) 65
10. Определение белков методом иммуноблоттинга 66
11. Окрашивание клеток аннексин V- пропидия иодид 68
12. Исследование межнуклеосомной деградации ДНК 68
13. Проверка изменения межмембранного потенциала митохондрий при действии липидов 69
14. Наблюдение локализации флуоресцентно-меченного липида в клетке 70
15. Накопление липида 6FL в клетках С6 70
16. Исследование способности липидов к ингибированию
протеинкиназ в тест-системе Streptomyces lividans aphVIII+ 70
17. Скрининг протеинкиназ как возможных мишеней действия ипидов 71
18. Исследование влияния липидов на функционирование
топоизомеразы I 71
19. Определение параметров связывания липид-ДНК 72
20. Моделирование возможного взаимодействия липидов с ДНК и топоизомеразой I 73
Результаты исследования и обсуждение 76
1. Исследование цитотоксичности катионных глицеролипидов 79
2. Исследование способности липидов повреждать мембрану
эритроцитов и смоделированную мембрану липосом 83
3. Исследование изменений клеточного цикла 85
3.1. Окраска клеток пропидия иодидом 85
3.2. Изучение влияния катионных липидов на уровень p21waf1/cip1 86
4. Определение типа гибели опухолевых клеток при действии катионных липидов 89
4.1. Окрашивание клеток аннексин V- пропидия иодид 89
4.2. Исследование межнуклеосомной деградации ДНК 91
4.3. Определение роли процессированного PARP и каспаз 3, 9, 12 в апоптозе, индуцированном липидами 91
4.4. Проверка изменения межмембранного потенциала митохондрий при действии липидов 93
4.5. Исследование влияния р53 на апоптоз, опосредованный действием липидов 95
5. Поиск мишеней действия липидов 96
5.1. Наблюдение локализации флуоресцентно-меченного липида в клетке 97
5.2. Скрининг протеинкиназ как возможных мишеней для липида 100
6. Поиск потенциальных мишеней для липидов при условии их модификации 101
6.1. Исследование влияния липидов на функционирование топоизомеразы I 102
6.2.Определение параметров связывания липид-ДНК 104
6.3. Моделирование возможного взаимодействия липидов с ДНК и топоизомеразой I 106
Заключение 110
Выводы 113
Благодарности 114
Список использованной литературы
- Илмофозин
- Механизм действия эдельфозина и его аналогов, опосредованный локализацией в эндоплазматическом ретикулуме
- «Митотическая катастрофа»
- Материалы и методы исследования
Илмофозин
Структура эдельфозина характеризуется наличием метильной группы при С(2) атоме углерода глицеринового скелета, связанной с ним простой эфирной связью (в отличие от ФАТ, у которого во 2-м положении глицерина находится ацетильный заместитель). Эдельфозин проявляет выраженную противоопухолевую активность и in vivo [12]. Однако в клинических испытаниях установлено, что эдельфозин в качестве самостоятельного лекарственного средства малопригоден для лечения опухолей из-за высокой гемолитической активности: концентрация эдельфозина, при которой он вызывает лизис 50% эритроцитов – 16 мкМ [13]. С целью снижения этого клинически неблагоприятного свойства эдельфозин заключают в липосомы [14]. При создании таких липосом в качестве липида-хелпера использовались DOPE (диолеоилфосфатидилэтаноламин), холестерин, DOPC (диолеоилфосфатидилхолин). Наиболее устойчивыми и при этом наименее токсичными для клеток крови оказались липосомы, содержащие холестерин (50%-ый гемолиз при 661 мкМ эдельфозина) [15, 16]. Эдельфозин прошел II фазу клинических испытаний при лечении немелкоклеточной карциномы легкого и рака мозга [17, 18]. Также по результатам II фазы клинических исследований сообщалось о его перспективности при обработке клеток перед аутологичной трансплантацией костного мозга при терапии острого лейкоза [19]. 1.2.Илмофозин
Противоопухолевую активность проявляет илмофозин (1-гексадецилтио-2-метоксиметил-1,3-пропандиол-фосфохолин, ВМ 41.440, 3, рис.3). Он отличается от эдельфозина наличием тиоэфирной связи при С(1) атоме глицерина, а также длиной заместителя, связанного тиоэфирной связью.
Исследования показали высокую антинеопластическую активность этого соединения для различных видов опухолей. Как и эдельфозин, илмофозин вызывает апоптоз опухолевых клеток [20]. Известны данные о цитотоксичности илмофозина в субмикромолярных концентрациях по отношению к ряду клеточных линий (таблица 2) [21].
Обнаружено, что для линий MCF7 и А549 оптические изомеры проявляют разную цитотоксичность: приведены значения показателей цитотоксичности для R-изомера относительно хирального центра при 2-м атоме углерода глицеринового остова. Для S-изомера концентрация, необходимая для 50% гибели, на 10 мкМ выше [21]. При относительно высоких цитотоксических концентрациях и необходимости проводить энантиоселективный синтез для достижения удовлетворительного противоопухолевого эффекта илмофозин пока не получил широкое практическое распространение, в отличие от эдельфозина и его аналогов, проявляющих значительную цитотоксичность для широкого набора клеточных линий в виде рацемической смеси [22-24]. Фаза I клинических испытаний илмофозина ограничила его максимальную дозу для перорального и внутривенного введения в основном за счет желудочно-кишечной токсичности [25, 26], и результаты фазы II не показали удовлетворительных результатов [27, 28].
Помимо алкильных антинеопластических липидов, содержащих в своей структуре глицериновый остов, широкое распространение получили липиды, в которых гидрофобный алкильный остаток присоединен непосредственно к фосфатной группе. Наряду с проявлением противоопухолевых свойств, у этих соединений выявлена высокая антибактериальная и антипаразитарная активность. Пример указанных алкильных фосфолипидов - милтефозин (гексадецилфосфохолин, 4, рис.4).
Милтефозин проявляет противоопухолевое действие по отношению к ряду линий клеток (таблица 3) [29, 30]. Однако у этого соединения выявлен неблагоприятный гемолитический эффект: концентрация милтефозина, при которой он вызывает лизис 50% эритроцитов - 38,3 мкМ [29, 31]. В связи с этим потенциал использования милтефозина ограничивается пероральным и местным применением.
В отличие от эдельфозина, проявляющего широкий спектр антинеопластической активности, к милтефозину чувствительны немногие опухолевые клеточные линии и модели. В клинических исследованиях милтефозин применялся против саркомы мягких тканей, метастатического колоректального рака, плоскоклеточного рака головы и шеи [32, 33]. Однако эти исследования были прекращены на фазе II, так как пероральные дозы, необходимые для системного эффекта, были токсичны для желудочно-кишечного тракта. По этой причине, с момента его появления в качестве препарата Miltex в 1992 году в Германии, клиническое применение милтефозина ограничивается местной обработкой при лечении рака молочной железы и кожных метастазов. Однако милтефозин широко исследуется, и оцениваются перспективы его перорального применения для лечения висцерального и кожного лейшманиоза, а также ряда паразитарных заболеваний [34-37]. труктура перифозина (октадецил-(N,N-диметил-пиперидин-4-ил)-фосфат, D 21266, 5, рис.5) отличается от милтефозина наличием N,N-диметил-пиперидиниевого фрагмента, присоединенного к алкилфосфатной цепи, вместо холина. Такая замена структуры полярного домена привела к увеличению его стабильности и периода полувыведения в физиологических условиях [38].
Механизм действия эдельфозина и его аналогов, опосредованный локализацией в эндоплазматическом ретикулуме
Важным событием для инициации гибели опухолевых клеток является активация рецепторов смерти. Эдельфозин и перифозин вызывают кластеризацию рафтов, активацию и олигомеризацию рецепторов смерти Fas/CD95 независимо от присутствия их лиганда FasL, что приводит к апоптозу опухолевой клетки. При активации этих рецепторов формируется комплекс DISC [76], содержащий Fas/CD95, FADD и прокаспазу 8, которые взаимодействуют друг с другом через домены смерти (DD), присутствующие в Fas и FADD и эффекторные домены смерти (DED), присутствующие в FADD и прокаспазе 8, образуя олигомерный комплекс [77-79]. Сформировавшийся комплекс DISC приводит к активации каспазы 8 с последующей активацией эффекторных каспаз 3,6,7 [80, 81] или к активации Bid, транслоцирующегося в липидных рафтах и являющегося важным компонентом сигналинга между рецепторами смерти и митохондриями, с последующим развитием митохондриального пути апоптоза [82, 83]. Кроме того, на лейкозных клетках Jurkat и Peer при действии эдельфозина и перифозина описан апоптотический сигнальный путь FAS-Daxx-JNK [62, 84-86]. Исследования апоптотического действия эдельфозина на лейкозные клетки выявили помимо образования комплекса DISC его ассоциацию со следующими сигнальными молекулами Bid, JNK и прокаспазой 10 в кластер обогащенных апоптотическими сигнальными молекулами рафтов «CASMER» (cluster of apoptotic signaling molecule-enriched rafts) [86-89]. Таким образом, после действия эдельфозина мембранные рафты служат в качестве платформы сборки различных кросс-взаимодействующих сигнальных молекул и участвуют в передаче сигналов от Fas/CD95.
После образования комплекса CASMER в ответ на накопление эдельфозина и его аналогов в липидных рафтах в зависимости от типа клеток реализуется непосредственно сигнализация к апоптотической гибели клетки (Fas/CD95, Fadd, каспаза-8, JNK) и/или ингибируется действие сигнальных путей, необходимых для выживания опухолевой клетки (ERK, Аkt). Баланс между этими процессами может модулироваться перераспределением и локальным накоплением молекул белков в рафтах [85, 90]. В этом контексте, обработка эдельфозином клеток Т-клеточного лейкоза Jurkat способствует встраиванию белка теплового шока 90 (Hsp90) и JNK в липидные рафты, что приводит к активации JNK [85]. Шаперон Hsp90 сверхэкспрессируется во многих опухолевых клетках и способствует принятию необходимой конформации синтезированными в клетке белками, в том числе обеспечивающими рост опухолевых клеток, например HER-2/Erb2, Akt, Raf-1, Bcr-Abl и мутантного p53 [91]. Действие эдельфозина способствует отдалению Hsp90 от белков, ответственных за опухолевый рост, и вместо этого он способствует развитию апоптоза, взаимодействуя с белками комплекса CASMER [85]. Таким образом, JNK становится новой мишенью белка Hsp90, при условии, что обе молекулы сосредоточены в липидных рафтах [85].
Присутствие эдельфозина, милтефозина и перифозина в липидных рафтах приводит также к ингибированию PI3K-Akt/PKB сигнального пути [92-94]. Серин-треониновая протеинкиназа Akt в активированном виде подавляет апоптоз путем ингибирования проапоптотического белка Bad и прокаспазы 9. Механизмом инактивации Akt-киназы при действии эдельфозина, перифозина и милтефозина является ее вытеснение из структуры липидных рафтов, что вызывает активацию р21 и апоптоз [92-95]. На примере перифозина это показано более подробно: нарушаются мембранные микродомены, ответственные за активацию Akt-киназы, и/или вытесняются ее лиганды PI(4,5)P2 и PI(3,4,5)P3 от РН-домена Akt, также Akt не может принять конформацию, необходимую для ее активации путем фосфорилирования по Thr308 и Ser473 [93, 94, 96, 97].
Важным аспектом действия эдельфозина и его аналогов на уровне клеточной мембраны является угнетение синтеза фосфатидилхолинов (РС) [98-102]. Поскольку РС – важнейший компонент клеточных мембран млекопитающих, их усиленный синтез необходим при делении клеток. Эдельфозин ингибирует фосфохолинцитидилтрансферазу (ССТ), что приводит к уменьшению синтеза фосфатидилхолинов [98-101]. В процессе биосинтеза РС поглощенные клеткой холины фосфорилируются холин-киназами, а затем ССТ катализирует перенос холина от фосфохолина на цитидин-5 -дифосфат (CDP-холин) [103], который используется холин-трансферазой вместе с диацилглицерином в синтезе РС [104-106]. ССТ – ключевой фермент в регуляции биосинтеза РС [104-106]. Эдельфозин и милтефозин ингибируют de novo синтез РС на этапе ССТ за счет своей схожести с природным регулятором ее физиологической активности LPC [98-102]. Такое конкурентное ингибирование препятствует синтезу CDP-холина, что угнетает синтез РС. Этот эффект, продемонстрированный при исследовании эдельфозина и милтефозина, вызывает арест в G2/M- фазе клеточного цикла и последующий апоптоз [107-109]. Если в случае лейкозных клеток механизм действия противоопухолевых алкильных фосфолипидов связан в первую очередь с активацией рецептор-опосредованного апоптоза, то для клеток солидных опухолей характерным событием перед гибелью является именно G2/M клеточный арест и последующий р53-независимый апоптоз [65]. В частности, перифозин при действии на линии HN12, HN30 и HaCaT вызывают G2/M клеточный арест за счет экспрессии р21, что не зависит от экспрессии р53 [110].
Смена фаз клеточного цикла контролируется циклин-зависимыми киназами (cdk). Регуляция их активности в основном происходит за счет стехиометрического связывания cdk-ингибиторов с комплексом cdk-циклин. Белок p21waf1/cip1 является таким cdk-ингибитором, а также эффектором опухолевого супрессора р53. Функции p21waf1/cip1 заключаются в регуляции клеточного ареста, дифференцировки, репарации ДНК и апоптоза. p21waf1/cip1 модулируется на этапе транскрипции и посттранскрипционном уровне, и р53 является транскрипционным активатором p21waf1/cip1. Тем не менее, p21waf1/cip1 не всегда связан с р53. При действии фосфатсодержащих алкильных липидов, в частности, перифозина, показана транскрипционная активация промотора p21waf1/cip1, повышение уровня мРНК и соответствующее увеличение количества белка p21waf1/cip1, что сопровождается G1/S или G2/M арестом клеточного цикла [110]. Данный эффект не зависит от р53, и воспроизводится на моделях с инактивированным р53. Повышение количества p21waf1/cip1 влечет за собой ингибирование комплексообразования cdk2/цикин Е и cdk2/циклинВ, что приводит к G1/S или G2/M арестам соответственно.
«Митотическая катастрофа»
По результатам RT-PCR на клетках НСТ116 экспрессия p21waf1/cip1 возрастает относительно контрольных необработанных проб при действии липидов 4, 6, 7, более чувствительный метод Realime PCR для расширенного диапазона концентраций показал большее увеличение экспрессии p21waf1/cip1 для липидов в концентрациях 25 мкМ после 24 часов инкубации. Липид 7 проявил наибольший эффект активации p21waf1/cip1, превысивший действие эдельфозина 8. Однако по результатам иммуноблоттинга заметное повышение уровня белка p21waf1/cip1 наблюдается в клетках НСТ116 только при действии липидов 7 и 8 (эдельфозин), и уровни этого белка в данных пробах сопоставимы. На линии НСТ116р53КО с нокаутным р53 эта тенденция воспроизводится, и, в отличие от липида 7, липид 6 не инициирует увеличение количества p21waf1/cip1 – это может быть опосредовано разной степенью наблюдаемого эффекта ареста. Полученные результаты дают основание полагать, что с активацией p21waf1/cip1 связан клеточный арест НСТ116, наиболее ярко представленный липидом 7. Помимо этого, активация p21waf1/cip1 в культуре НСТ116р53КО поставила вопрос о роли р53 в гибели опухолевых клеток, опосредованной действием катионных липидов. 4.Определение типа гибели опухолевых клеток при действии катионных липидов
На основании литературных данных об апоптотической гибели опухолевых клеток, вызываемой соединениями-предшественниками - фосфатсодержащими противоопухолевыми липидами, выявление типа гибели при действии бесфосфорных катионных глицеролипидов проводилось, исходя из гипотезы об аналогичном апоптотическом эффекте исследуемых соединений. Для ее проверки использовалось двойное окрашивание (аннексин V- пропидия иодид) и электрофоретический анализ целостности ДНК. Более детально исследовалось участие каспаз и р53 в реализации апоптоза, а также изучалось падение трансмембранного потенциала митохондрий.
Поскольку эдельфозин вызывает апоптотическую гибель опухолевых клеток, мы исследовали связывание аннексина V с мембранами клеток НСТ116, обработанных наиболее активными липидами 6, 7, 8 при совместном окрашивании с пропидия иодидом. При анализе полученных на проточном цитофлуориметре гистограмм необходимым условием определения апоптоза является наличие смещения вправо относительно контроля пика аннексина V.
Соединения 6, 7 применялись в концентрациях 12 мкМ и 25 мкМ с, а соединение 8 использовалось для сравнения в концентрации 8 мкМ; время инкубации клеток с соединениями составило 48 часов (рис. 7). Контроль
На гистограммах происходит смещение пика аннексина V вправо вдоль оси абсцисс, что соответствует мембранным проявлениям апоптоза. Наибольший сдвиг происходит при действии соединения 7 и эдельфозина (8). Для образца сравнения 6 сдвиг меньше. Наличие Sub-G1 фазы при окрашивании клеток пропидия йодидом и сдвиг пика аннексина V подтверждюат предположение об апоптотическом типе гибели клеток. 4.2.Исследование межнуклеосомной деградации ДНК
Одним из поздних морфологических признаков апотоза является межнуклеосомная фрагментация ДНК. Мы исследовали наличие этого признака при действии липидов 6, 7, 8 в концентрациях 25 мкМ после 48 и 72 часов инкубации клеток НСТ116 (рис. 8). часов 72 часа К 6 7 8 Рис.8. Электрофорез фрагментов ДНК при действии 6,7,8 на НСТ116 После 48 часов инкубации клеток с липидами 6, 7, 8 фрагментов, соответствующих межнуклеосомной деградации ДНК, не наблюдалось. После 72-часовой инкубации при разделении ДНК такие фрагменты выявлены после действия всех трех липидов. Наблюдение при электрофорезе «лестницы» фрагментированной ДНК стало подтверждением гипотезы об апоптотической гибели клеток НСТ116 в ответ на действие липидов 6 и 7. 4.3.Определение роли процессированного PARP и каспаз 3, 9, 12 в апоптозе, индуцированном липидами Более детальное установление механизма апоптоза предполагало исследование активации каспаз и PARP после действия липидов 6, 7, 8 и определение пути апоптоза. Межнуклеосомная деградация ДНК может быть опосредована расщеплением PARP, который, в свою очередь, является мишенью каспазы-3. Эти белки исследовались после 72-часовой инкубации клеток НСТ116 с липидами 6, 7, 8 в эквитоксических концентрациях. Поскольку из литературных данных известно, что эдельфозин в клетках солидных опухолей инициирует ЭПР-стресс и митохондриальный апоптотический каскад, мы проверили способность исследуемых липидов активировать каспазу-12 и каспазу-9 после 24, 48 и 72 часов инкубации. Поскольку для каспазы-9 видимый эффект наблюдался в пробах после 48 часов инкубации, а для каспазы-12 различий для проб на этих временных интервалах не было, приведены данные для 48-часовой инкубации. Контролем служил препарат митоксантрон в концентрации 2мкМ.
Результаты иммуноблоттинга белков НСТ116 с антителами к каспазам и процессированному PARP при действии липидов 6, 7, 8 По представленным результатам при действии липидов 6 и 7 каспаза-12 не активируется, однако присутствует увеличение по сравнению с контролем количества каспазы-9, уровень которой для концентраций катионных липидов 25 мкМ сопоставим с пробой для эдельфозина (8), что свидетельствует об участии митохондрий в реализации апоптоза при действии липидов. Эффект с активацией каспазы-3 и процессированием PARP присутствует лишь для контрольных проб с митоксантроном и эдельфозином, исследуемые липиды 6 и 7 не проявили подобной активности – это свидетельствует о каспазонезависимом характере апоптоза при действии соединений 6, 7. Межнуклеосомная деградация ДНК в результате каспазонезависимого апоптоза может быть опосредована выходом из межмембранного пространстава митохондрий в цитозоль фактора индукции апоптоза AIF и эндонуклеазы G (ENDOG), которые перемещаются в ядро и способствуют фрагментации ДНК без участия эффекторных каспаз.
Проверка изменения межмембранного потенциала митохондрий при действии липидов Внутренний путь апоптоза предполагает падение трансмембранного потенциала митохондрий в связи с выходом в цитозоль митохондриальных белков. После инкубации клеток НСТ116 с липидами пробы окрашивали Mitotracker red и исследовали методом проточной цитофлуориметрии. Соединения 6,7 применялись в концентрациях 12 мкМ и 25 мкМ с, а соединение 8 использовалось для сравнения в концентрации 8 мкМ; время инкубации клеток с соединениями составило 48 часов (рис. 10).
Материалы и методы исследования
Эдельфозин (8) вызывает существенно более выраженное вытекание карбоксифлуоресцеина из липосом, чем бесфосфорные липиды 4, 5, 7 в диапазоне соотношений “исследуемое соединение:липосомальный липид” от 0,008 до 0,2. Эти данные подтверждают полученные результаты исследования гемолиза. При увеличении концентрации противоопухолевых липидов (возрастании соотношения “исследуемое соединение:липосомальный липид” до 1) мембранолитические свойства бесфосфорных катионных липидов различались: соединение 4 вызвало наибольшее вытекание красителя, сравнимое с эффектом 8. Для 5 и 7, различающихся заместителем в имидазолиевой катионной головке, эффект вытекания красителя при увеличении концентраций существенно не увеличился, т.е. эти соединения не повреждали липосомы даже в относительно высоких концентрациях.
Сильная способность к нарушению целостности мембран фосфатсодержащего эдельфозина и его аналогов объясняется геометрическим преобладанием размера гидрофильной головки над размером гидрофобной части молекулы. В случае бесфосорных катионных глицеролипидов это преобладание уменьшается, что может стать объяснением снижения мембранолитической способности исследуемых соединений по сравнению с эдельфозином.
Исследование изменений клеточного цикла Под воздействием химических агентов могут происходить определённые изменения клеточного цикла. Характер таких изменений важен для понимания механизма действия исследуемых соединений.
Исследование клеточного цикла проводили методом проточной цитофлуориметрии, окрашивая фиксированные клетки НСТ116 интеркалирующим в ДНК красителем (пропидия иодидом, PI). Липиды 4, 6, 7 исследовали в концентрациях 12 и 25 мкМ после 24 и 48 часов инкубации клеток. мкМ мкМ
Обнаружен арест клеток в G1-фазе, затрудняется переход в S-фазу, а также появляются клетки с фрагментированной ДНК (пик subG1). Клеточный арест наблюдается как при действии 12 мкМ 4, 5, 6, так и для 25 мкМ концентрации. Для липида 6 эффект ареста временный, с увеличением времени инкубации с 24 до 48 часов количество клеток в G2/M фазе увеличивается. Действие липида с 7 пролонгировано, он показал наибольший эффект ареста. Наблюдалось увеличение числа пораженных клеток (фаза SubG1) как с увеличением концентрации соединений, так и с увеличением времени инкубации от 24 часов до 48 часов.
Изучение влияния катионных липидов на уровень p21waf1/cip1 Полученные данные о возникновении G1/S клеточного ареста стали основанием для проверки активности p21waf1/cip1 в ответ на действие наиболее активных из исследуемых катионных глицеролипидов на уровне экспрессии гена (рис.5) и на уровне белка с использованием в качестве контроля митоксанрона (эквитоксическая концентрация 2 мкМ), который повышает уровень p21waf1/cip1 при наличии активного р53 (рис.6). Поскольку из литературных источников известно, что фосфатсодержащие противоопухолевые липиды, такие, как эдельфозин и перифозин, независимо от р53 вызывают торможение клеточного цикла, активируя ингибитор циклинзависимых киназ p21waf1/cip1, контролирующий переходы G1/S и G2/M, мы проверили активацию p21waf1/cip1 на парных клеточных линиях: НСТ116 (клетки дикого типа) и НСТ116р53КО с нокаутированным геном р53. А. RT-PCR
По результатам RT-PCR на клетках НСТ116 экспрессия p21waf1/cip1 возрастает относительно контрольных необработанных проб при действии липидов 4, 6, 7, более чувствительный метод Realime PCR для расширенного диапазона концентраций показал большее увеличение экспрессии p21waf1/cip1 для липидов в концентрациях 25 мкМ после 24 часов инкубации. Липид 7 проявил наибольший эффект активации p21waf1/cip1, превысивший действие эдельфозина 8. Однако по результатам иммуноблоттинга заметное повышение уровня белка p21waf1/cip1 наблюдается в клетках НСТ116 только при действии липидов 7 и 8 (эдельфозин), и уровни этого белка в данных пробах сопоставимы. На линии НСТ116р53КО с нокаутным р53 эта тенденция воспроизводится, и, в отличие от липида 7, липид 6 не инициирует увеличение количества p21waf1/cip1 – это может быть опосредовано разной степенью наблюдаемого эффекта ареста. Полученные результаты дают основание полагать, что с активацией p21waf1/cip1 связан клеточный арест НСТ116, наиболее ярко представленный липидом 7. Помимо этого, активация p21waf1/cip1 в культуре НСТ116р53КО поставила вопрос о роли р53 в гибели опухолевых клеток, опосредованной действием катионных липидов. 4.Определение типа гибели опухолевых клеток при действии катионных липидов
На основании литературных данных об апоптотической гибели опухолевых клеток, вызываемой соединениями-предшественниками - фосфатсодержащими противоопухолевыми липидами, выявление типа гибели при действии бесфосфорных катионных глицеролипидов проводилось, исходя из гипотезы об аналогичном апоптотическом эффекте исследуемых соединений. Для ее проверки использовалось двойное окрашивание (аннексин V- пропидия иодид) и электрофоретический анализ целостности ДНК. Более детально исследовалось участие каспаз и р53 в реализации апоптоза, а также изучалось падение трансмембранного потенциала митохондрий.
Поскольку эдельфозин вызывает апоптотическую гибель опухолевых клеток, мы исследовали связывание аннексина V с мембранами клеток НСТ116, обработанных наиболее активными липидами 6, 7, 8 при совместном окрашивании с пропидия иодидом. При анализе полученных на проточном цитофлуориметре гистограмм необходимым условием определения апоптоза является наличие смещения вправо относительно контроля пика аннексина V.
Соединения 6, 7 применялись в концентрациях 12 мкМ и 25 мкМ с, а соединение 8 использовалось для сравнения в концентрации 8 мкМ; время инкубации клеток с соединениями составило 48 часов (рис. 7).
