Введение к работе
Актуальность проблемы
Антибиотики-производные ауреоловой кислоты - оливомицин, хромомицин A3 и митрамицин - соединения с высокой биологической активностью. Особую важность представляет оливомицин - соединение, структура которого впервые описана отечественными исследователями. Клинические испытания показали, что монохимиотерапия оливомицином приводит к значительному уменьшению объема опухолей лимфоидной ткани и саркомы матки. Побочное действие препарата - общерезорбтивная токсичность -обусловливает необходимость поиска структурных аналогов этого перспективного вещества с меньшей токсичностью и выяснения молекулярных механизмов гибели клеток при действии этого класса противоопухолевых соединений.
Выявлена внутриклеточная мишень оливомицина - двухцепочечная ДНК, с малой бороздкой которой оливомицин связывается в виде димера в присутствии Mg+, преимущественно в GC-богатые участки. Этот факт позволяет рассматривать оливомицин как агент, повреждающий структуру дуплекса. Ожидаемыми последствиями такого повреждения следует считать нарушение матричных процессов - транскрипции генов, синтеза ДНК.
Молекулярные механизмы клеточной гибели при действии производных ауреоловой кислоты не изучены. Например, клетки могут погибать по механизму апоптоза, сопровождающемуся активацией каскадов каспаз, митохондриальными событиями и фрагментацией геномной ДНК. Последнее означало бы, что гибель реализуется до необратимых этапов. Это существенно, т.к. в опухолевых клетках могут быть блокированы те или иные пути гибели в результате отбора при прогрессии опухоли и лечебных воздействий.
Цель исследования - получение новых знаний о молекулярных механизмах гибели опухолевых клеток человека при действии оливомицина и его новых производных. Задачи:
1. Изучить цитотоксичность оливомицина для культивируемых клеток опухолей человека, в том числе сублиний с молекулярными детерминантами лекарственной устойчивости.
2. Установить влияние оливомицина на матричные процессы в бесклеточной системе и в культуре клеток: синтез ДНК и генную транскрипцию.
3. Выявить роль "ядрышкового стресса" в цитотоксичности оливомицина.
4. Исследовать новые производные оливомицина, выбрать менее токсичные и
установить механизм снижения цитотоксичности для оптимизации препаратов
этого химического класса, пригодных для предклинических испытаний.
Положения, выносимые на защиту.
-
Оливомицин - высокоактивное противоопухолевое соединение. В субмикромолярных концентрациях оливомицин вызывает апоптоз опухолевых клеток благодаря связыванию с двухцепочечной ДНК и нарушению транскрипции и репликации ДНК.
-
Введение заместителя в боковую цепь оливомицина снижает связывание с ДНК и уменьшению цитотоксичности, что важно для создания клинических препаратов на основе ауреоловой кислоты.
Научная новизна
Новым являются систематическое исследование молекулярных механизмов гибели клеток при действии оливомицина и его производных. Впервые исследована токсичность новых соединений для культивируемых линий опухолей молочной железы, толстой кишки, меланомы, лейкоза - клеток дикого типа и сублиний, устойчивых к ряду лекарств.
Впервые определены типы клеточной гибели, вызываемой оливомицином. Установлено, что это соединение вызывает апоптоз в низких концентрациях (в наномолярном диапазоне) в течение 24 часов воздействия. Апоптоз сопровождается межнуклеосомной деградацией ДНК.
При исследовании механизма регуляции матричного синтеза оливомицином впервые установлен эффект оливомицина на транскрипционный аппарат: транскрипцию, опосредованную РНК-полимеразами I, II и III. Впервые проведен детальный анализ нарушений экспрессии генов в ответ на действие оливомицина методом микрочип-анализа. Показано, что соединение ингибирует транскрипцию, опосредованную РНК-полимеразами I и II, но не РНК-полимеразой III.
Впервые выявлена роль нарушений структуры ядрышка - сегрегации его компонентов - как фактора индукции клеточной гибели при действии оливомицина.
Новыми являются данные об активации оливомицином р53-зависимой транскрипции - промотор-репортерной конструкции с р53-зависимой регуляторной областью и генар27, экспрессия которого опосредована р53.
Впервые показано, что оливомицин непосредственно ингибирует синтез ДНК. Оливомицин вызывает торможение синтеза ДНК в первые часы воздействия.
Впервые изучена серия новых производных оливомицина с модификациями отдельных химических групп в молекуле. Новые производные проявляли меньшую цитотоксичность, чем оливомицин. При этом цитотоксичность новых производных оставалась достаточно высокой (в микромолярном диапазоне концентраций). Снижение цитотоксичности нового производного обусловлено более низкой константой связывания с двухцепочечной ДНК.
Научно-практическая значимость исследования
Изучение механизмов цитотоксического действия оливомицина и его новых производных позволит определить критерии для структурной оптимизации химических соединений и в перспективе создать эффективные препараты для лечения онкологических заболеваний на основе высокоактивного класса ДНК-связывающих производных ауреоловой кислоты.
Апробация работы.
Диссертация обсуждена 17 июня 2009 г. на совместной конференции лабораторий механизмов гибели опухолевых клеток, молекулярной эндокринологии, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, механизмов регуляции иммунитета, биохимии опухолей, канцерогенных веществ, вирусного канцерогенеза, механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, биохимической фармакологии, медицинской химии, лаборатории электронной микроскопии отдела патологической анатомии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.
Основные материалы диссертации представлены на следующих конференциях: III международный симпозиум по мишень-направленной терапии опухолей ТАТ-2005, Амстердам, Нидерланды, 2005, "Фундаментальная онкология. 2-е Чтения им. проф. Н.Н.Петрова", Санкт-Петербург, 2006 и конференция "Cancer therapeutics: the road ahead", Капри, Италия, 2007.
Публикации.
По материалам диссертации опубликованы 4 журнальные статьи и тезисы 3 международных конференций.
Структура и объем диссертации.
