Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ И
1.1. Факторы риска развития рака молочной железы 11
1.2. Поиск генетических маркеров предрасположенности к раку молочной железы 14
1.3. Рак молочной железы и гены, вовлеченные в процесс биосинтеза эстрогенов 15
1.4. Рак молочной железы и гены, вовлеченные в регуляцию клеточного цикла, процессы репарации ДНК и апоптоза 19
1.5. Митохондриальная ДНК и канцерогенез 27
1.6. Молекулярно-генетические исследования РМЖ в России, профилактика и диагностика рака молочной железы 32
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 33
2.1 Материалы и методы исследования 33
2.2. Молекулярно-генетическое исследование 34
2.2.1. Выделение геномной ДНК
2.2.2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК
2.2.3. Рестрикционный анализ
2.2.4. Метод гель-электрофореза
2.2.5 Определение нуклеотидной последовательности ДНК
2.3. Методы статистического анализа 40
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 41
3.1. Особенности клинического течения рака молочной железы.. 41
3.2. Анализ показателей заболеваемости и смертности рака молочной железы в РБ и в ХМАО-Югра 48
3.3. Изучение мутации 5382insC гена BRCAI у больных раком молочной железы [' 52
3.4. Изучение мутаций гена СНЕК2 IVS2+1G>A, I157T в CHEK2de\e9,\0 (5kb) у больных раком молочной железы и в группе контроля 62
3.5. Изучение мутации гена NBS1 у больных раком молочной железы и в группе контроля 71
3.6. Анализ частот аллелей и генотипов полиморфизма D302HreHa CASP8 у больных раком молочной железы и в группе контроля.. 77
3.7. Оценка распределения частот аллелей и генотипов полиморфизма L10P гена TGFbl у больных раком молочной железы и в группе контроля 82
3.8. Изучение полиморфного локуса R72P гена у больных раком молочной железы и в группе контроля 86
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 92
ВЫВОДЫ 97
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 98
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 99
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время в России сохраняется высокий уровень заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований различных локализаций. В структуре онкологической заболеваемости наблюдается тенденция к значительному увеличению случаев рака молочной железы (РМЖ). Статистические показатели последних лет свидетельствуют о том, что рак молочной железы занимает первое место в структуре онкопатологии женского населения большинства высокоразвитых стран мира и имеет тенденцию к неуклонному росту. Отмечается рост заболеваемости и в России, с 1980г. рак молочной железы занимает первое место среди злокачественных новообразований женского населения [ЧиссовВ.И., 1999; Семиглазов В.Ф., 2002].
Наряду с ростом заболеваемости происходит и увеличение смертности во всем мире. При этом в структуре смертности от всех злокачественных новообразований женщин рак молочной железы имеет наибольший удельный вес, составляя в США 18%, в странах Европы- 17% [Аксель Е.М, 1994; Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2004], в России данный показатель в 1997г. составил 17% [Чиссов В.И., 1999]. Риск возникновения заболевания в течение жизни оценивается в среднем у женщин в 11% случаев. В основе снижения смертности среди женщин от РМЖ лежит раннее выявление заболевания, качественное и полное лечение [Гарин A.M., 2006].
За последнее десятилетие произошли существенные изменения в понимании механизмов развития рака молочной железы, методов их диагностики и лечения, но закономерности функционирования генома раковой клетки еще далеки от своего понимания. На сегодняшний день картирован и клонирован целый ряд генов, вовлеченных в канцерогенез, эти гены являются и хранителями клеточного цикла, и генами общего контроля. Доказано, что мутации или структурные изменения, нарушающие функцию генов, поддерживающих стабильность генома, и прямо или косвенно участвующих в репарации повреждений ДНК, предрасполагают к возникновению опухоли. В последнее время расширяются исследования, связанные с поиском и характеристикой полиморфных вариантов ДІЖ в кодирующих и некодирующих районах генов, в той или иной степени вовлеченных в канцерогенез [Залетаев Д.В., 2001; Карпухин А.В., 2002; Rebbeck T.R., 2002; Buslov К.В., 2004].
На сегодняшний день выделяют две формы рака: наследственную и спорадическую [Любченко Л.Н., Гарькавцева Р.Ф., 2004]. Наследственная предрасположенность к РМЖ проявляется в накоплении случаев указанного заболевания в семьях. Установлен аутосомно-доминантный тип наследования рака молочной железы в семьях с высоким риском [Pharoah P.D., 2002; Antoniou А., 2003]. Большим достижением молекулярной биологии в 90-х годах прошлого века было открытие генов BRCA1 и BRCA2. Наибольшая доля наследуемых форм рака молочной железы и/или яичников связана с мутациями в этих генах [Walsh Т. et al., 2006]. Например, мутации гена BRCA1 являются высокопенетрантными и риск возникновения данной патологии у носителей таких мутаций достигает 50-90% [Grzybowska Е., 2000; Pohlreich Р., 2005; Mitchell G., et al., 2006; Walsh Т. et al., 2006]. Необходимо отметить, что спектр и частота мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 может сильно варьировать в различных популяциях и регионах [Peelen Т., 1997; Hakansson S., 1997; Stoppa-Lyonnet D., 1997; Gayther S.A., 1997; Santarosa M., 1998; Grzybowska E., 2000; Van der Looij M., 2000; Diez O., 2003; Pohlreich P., 2005].
Редкие высокопенетрантные терминальные мутации генов BRCA1/2 отвечают не более чем за 25% всех семейных форм заболевания РМЖ. Оставшееся разнообразие случаев рака молочной железы можно объяснить комбинацией более распространенных, низкопенетрантных полиморфных вариантов других генов [Pharoah Р., 2002].
Спорадическая форма рака, также как и семейная, имеет генетическую компоненту, только ее структура может быть намного сложнее. Опухоль, в этом случае, развивается под воздействием не одной мутации, а целой группы. Исследования полиморфизма генов, вовлеченных в канцерогенез, позволили выявить такие сочетания полиморфных состояний генов, которые повышают вероятность возникновения рака [Асланян М.М., 2007].
Большое внимание исследователей направлено на изучение генов NBSI (Nijmegen breakage syndrome), ATM (Ataxia telangiectasia mutated), CHEK1 (Cell-cycle checkpoint kinase), CASPS (каспаза 8), TGFbl (трансформирующий фактор роста), XRCCA (X-ray repair complementing defective in Chinese hamster) и др. [Dufault M.R. et al., 2004; Buslov K.B., 2004; Bogdanova N., 2005; Antoniou A.C. and Easton D.F., 2006; Bierie В., Moses H.L., 2006; Cox A., 2007].
Молекулярно-генетические работы, посвященные изучению рака молочной железы, проводятся и в России. Они затрагивают, в основном, исследования мутаций генов BRCA1 и BRCA2 у больных с отягощенным семейным анамнезом раком молочной железы и раком яичников (РЯ) [Логинова А.Н., 2004; Любченко Л.Н., Гарькавцева Р.Ф., 2004; Мандельштам М.Ю., 2005; Смирнова Т.Ю., Карпухин А.В., 2007; Любченко Л.Н., Гарькавцева Р.Ф., 2007]. Выявление мутаций в изучаемых генах обеспечивает объективный критерий для формирования групп повышенного риска рака молочной железы с целью его профилактики и ранней диагностики.
В связи с высоким уровнем заболеваемости и неуклонным ростом смертности от рака молочной железы во всем мире идентификация генов, вовлеченных в развитие злокачественной опухоли, является важной медико-генетической задачей, решение которой будет способствовать формированию фундаментальных представлений о патогенезе этого заболевания, а также позволит выявить генетические факторы риска развития рака молочной железы.
На основании вышесказанного были определены следующие цель и задачи.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Цель исследования: повышение уровня диагностики рака молочной железы на основе анализа клинического течения заболевания и выявления молекулярно-генетических маркеров риска развития данной патологии Задачи исследования
1. Создать банк ДНК больных раком молочной железы, проживающих на территории республики Башкортостан и Ханты-Мансийского автономного округа — Югра и дать клиническую характеристику больных раком молочной железы.
2. Провести поиск мутаций 5382insC и Cys61Gly гена BRCA1 у больных раком молочной железы.
3. Изучить частоту распространения мутаций IVS2+1G A, I157T и C#AT2dele9,10(5kb) гена СНЕК2 (Cell-cycle checkpoint kinase), делеции 657del5 гена NBS1 (Nijmegen breakage syndrome) в группе контроля и больных раком молочной железы и оценить вклад перечисленных ДНК- маркеров в развитие данной патологии.
4. У больных раком молочной железы и в группе здоровых женщин изучить распределение частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов TGFBX (transforming growth factor В), CASPS (caspase) и TP53 (cynpeccop опухоли) и провести анализ ассоциаций исследованных полиморфных вариантов генов с риском развития рака молочной железы.
5. Усовершенствовать подходы к ДНК-диагностике и определению тактики ведения больных раком молочной железы.
Эти задачи представляются чрезвычайно актуальными и требуют своего решения.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ
Впервые на базе лаборатории Молекулярной генетики человека Института биохимии и генетики УНЦ РАН (г. Уфа) создан банк ДНК больных раком молочной железы, проживающих на территории республики Башкортостан и Ханты-Мансийского автономного округа - Югры. На большом клиническом материале изучена частота встречаемости мутаций 5382insC и Cys61Gly гена BRCAI; впервые в республике Башкортостан и в ХМАО-Югра изучена частота встречаемости полиморфных локусов IVS2+1G A, I157T и CHEK2dele9,10(5kb) гена СНЕК2, делеции 657del5 гена NBS1 у больных раком молочной железы. Впервые проведен анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфизмов L10P, D302H, R72P генов TGFfil, С ASPS, ТР53, соответственно, у больных и здоровых доноров. Изучена взаимосвязь проанализированных мутаций и полиморфизмов исследованных генов с клиническим проявлением рака молочной железы.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Оценка частот распространения мутаций 5382insC и Cys61Gly в гене BRCAI, IVS2+1G A и CHEOdele9,10(5kb) в гене СНЕК2, а так же делеции 657del5 в гене JVSiS l позволяет проводить ДНК- диагностику рака молочной железы у женского населения нашего региона.
Выявление мутаций IVS2+1G A и CfffiK2dele9,10(5kb) в гене СНЕК2 и полиморфизма R72P гена ТР5Ъ у больных раком молочной железы позволит определить дальнейшую тактику лечения и, тем самым, повысить уровень выживаемости при данной патологии.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
1. Прямая зависимость между возрастом манифестации рака молочной железы и состоянием репродуктивной функции организма женщины.
2. Высокая частота носительства (4%) мутации 5382insC гена BRCA1 у больных раком молочной железы с наследственными формами заболевания, а также у женщин с неотягощенным семейным анамнезом.
3. Генетическими маркерами предрасположенности к развитию рака молочной железы являются мутации IVS2+1G A и СЯ!АГ2ёе1е9,10(5кЬ) гена СНЕК2.
4. У носителей генотипа Arg /Pro гена супрессора опухолей ТР53 высокий риск развития злокачественных новообразований молочной железы.
ТУ ТУ
Генотип Arg /Arg обладает протективным свойством.
