Содержание к диссертации
Введение
РАЗДЕЛ I. Обзор литературы 15
1.Общая характеристика муцинов 15
2. Муцин MUC1 (строение молекулы, синтез в клетке, полиморфизм) 17
3. Моноклональные антитела к MUC1 22
4. Экспрессия и функциональная роль MUC1 в норме . 26
5. Экспрессия и патофизиологическая роль MUC1 при злокачественных новообразованиях эпителия 29
6. MUC1 при предопухолевых изменениях эпителия 42
7. Циркулирующий в крови MUC1 46
8. MUC1 как мишень для терапии злокачественных опухолей 53
9. Анти-MUC1 моноклональное антитело ИКО25 . 55
РАЗДЕЛ II. Материалы и методы 57
1. Объекты исследования . 57
2. Реактивы, реагенты и лабораторные материалы 58
3. Препаративные и аналитические методы исследований 61
3.1. Методы получения антигена и антител 61
3.2. Аналитические методы . 62
3.3. Методы иммуноферментного анализа (ИФА) . 65
3.4. Методы иммуногисто- и иммуноцитохимического анализа . 69
3.5. Проточная цитофлуориметрия 73
3.6. Методы исследования 5-АЛК-индуцированной флуоресценции протопорфирина IX (ППIX) в цитологических препаратах . 73
4. Клинический материал, пациенты и дизайн клинико-экспериментальных исследований . 75
4.1. Характеристика образцов тканей молочной железы . 75
4.2. Характеристика образцов тканей легкого 76
4.3. Иммуноцитохимическое исследование бронхиального эпителия 77
4.4. Иммуноцитохимическое исследование цервикального эпителия 87
4.5. Серологические исследования 92
5. Методы статистического анализа 95
РАЗДЕЛ III. Собственные результаты . 96
ГЛАВА 1. Характеристика моноклонального антитела ИКО25 . 96
1.1. Экспрессия MUC1/ИКО25 в нормальных тканях человека 97
1.2. Экспрессия MUC1/ИКО25 в тканях злокачественных опухолей 101 человека .
1.3. MUC1/ИКО25 при доброкачественных и злокачественных изменениях эпителия молочной железы 104
1.4. Сравнительная характеристика экспрессии различных по гликозилированию форм MUC1 в нормальных и опухолевых тканях человека 108
1.5. ОБСУЖДЕНИЕ 116
ГЛАВА 2. Экспрессия MUC1 в бронхиальном эпителии при раке 122 легкого .
2.1. MUC1/ИКО25 в бронхиальном эпителии при плоскоклеточном раке легкого (гистологическое исследование) 107
2.2. MUC1/ИКО25 в бронхиальном эпителии при плоскоклеточном раке легкого (цитологическое исследование) 155
2.2.1. Отработка методики оценки экспрессии MUC1/ИКО25 в цитологических препаратах бронхиального эпителия 137
2.2.2. MUC1/ИКО25 в бронхиальном эпителии при неопухолевых заболеваниях легких и у онкологических больных 165
2.2.3. Экспрессия MUC1/ИКО25 и 5-АЛК-индуцированный протопорфирин IX в клетках бронхиального эпителия 173
2.2.4. MUС1/ИКО25 в бронхиальном эпителии у больных раком легкого после специфического лечения 179
2.2.5. Алгоритм исследования экспрессии MUC1/ИКО25 в бронхиальном эпителии в комплексном обследовании больных раком легкого после специфического лечения 200
2.3. ОБСУЖДЕНИЕ 203
ГЛАВА 3. Экспрессия MUC1 при предопухолевых изменениях в эпителии шейки матки - цитологическое исследование 219
3.1. MUC1/ИКО25 в цервикальном эпителии в норме, при воспалительных и фоновых заболеваниях шейки матки 220
3.2. MUC1/ИКО25 в клетках цервикального эпителия при начальном раке шейки матки и интраэпителиальной неоплазии шейки матки 229
3.3. Экспрессия MUС1/ИКО25 в цервикальном эпителии после органосохраняющего лечения интраэпителиальной неоплазиии шейки матки
3.4. ИКО25+ дискератоцит-подобные клетки в цервикальном эпителии и папилломавирусная инфекция 244
3.5 ОБСУЖДЕНИЕ 248
ГЛАВА 4. Серологические исследования MUС1/ИКО25 253
4.1. Разработка тест-системы для определения содержания MUC1/ИКО25 в сыворотке крови человека 254
4.2. MUC1/ИКО25 в сыворотке крови при раке молочной железы 263
4.3. MUC1/ИКО25 в сыворотке крови при первичном раке легкого 264
4.3.1. Характеристика общей группы наблюдений 264
4.3.2. MUC1/ИКО25 в сыворотке крови при аденокарциноме легкого 271
4.3.3. MUC1/ИКО25 в сыворотке крови при плоскоклеточном раке легкого 275
4.3.4. Повышенный уровень MUC1/ИКО25 в сыворотке крови как серологический маркер аденокарциномы при первичном раке легкого 280
4.3.5. МUC1/ИКО25 в сыворотке крови больных НМРЛ до и после хирургической операции 284
4.4. MUC1/ИКО25 в сыворотке крови при раке желудка 288
4.4.1. Характеристика общей группы наблюдений 288
4.4.2. MUC1/ИКО25 и послеоперационная пневмония у больных злокачественными опухолями органов верхних отделов желудочно-кишечного тракта 292
4.6. ОБСУЖДЕНИЕ 302 ВЫВОДЫ 313 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 316 Список сокращений и условных обозначений 318 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 321
- Экспрессия и патофизиологическая роль MUC1 при злокачественных новообразованиях эпителия
- Клинический материал, пациенты и дизайн клинико-экспериментальных исследований
- Экспрессия MUC1/ИКО25 и 5-АЛК-индуцированный протопорфирин IX в клетках бронхиального эпителия
- Повышенный уровень MUC1/ИКО25 в сыворотке крови как серологический маркер аденокарциномы при первичном раке легкого
Введение к работе
Актуальность проблемы. Достижения в области современных биологических наук - молекулярной биологии и молекулярной генетики, биохимии и биотехнологии к настоящему времени значительно расширили представления о сложных процессах, лежащих в основе возникновения и прогрессии неоплазии [Pecorino L., 2012]. Предметом активных исследований является поиск биологических маркеров, определение которых в тканях организма может способствовать оценке риска возникновения заболевания, выявлению злокачественной опухоли, служить индикатором ее биологических особенностей или отражать распространенность опухолевого процесса [Karley D. et al., 2011; Duffy M.J., 2013].
Муцин MUC1 в этом отношении на протяжении многих лет привлекает к себе особое внимание. В норме в организме человека MUC1 преимущественно экспрессируется клетками эпителия желез и протоков [Baldus S.E. et al., 2004]. Структура MUC1 отличается высокой изменчивостью, что обусловлено генетическим полиморфизмом, свойственным муциноподобным гликопротеинам, а также вариабельным гликозилированием его молекулы [Hanisсh F.G. & Mller S., 2000]. Физиологическая роль MUC1 тесно связана с защитой целостности эпителиального барьера при инфекционном поражении [McGuckin M.A. et al., 2007; McAuley J.L. et al., 2007].
В эпителиальных злокачественных опухолях обнаруживают повышенную, по сравнению с нормальным эпителием, экспрессию MUC1, изменение его внутриклеточной локализации и преобладание гипогликозилированных форм муцина [Baldus S.E. et al., 2004; Hanisсh F.G. & Mller S., 2000]. По результатам экспериментальных исследований, эти особенности могут приводить к увеличению инвазивного и метастатического потенциала злокачественных клеток [Jonckheere N. & Van Seuningen I., 2010; Albrecht H. & Carraway K.L., 2011]. По данным клинико-морфологических исследований, высокий уровень экспрессии и деполяризованный характер
распределения MUС1 в клетках опухоли коррелирует с неблагоприятным прогнозом заболевания [Rahn J.J. et al., 2001; Kocer B. et al., 2004; Situ D. et al., 2011; Hamada T. et al., 2012].
Изменения характера экспрессии MUC1, аналогичные тем, что наблюдаются в ткани инвазивных опухолей, описаны при внутриэпителиальных карциномах в ряде органов. Однако повышенный интерес к изучению экспрессии MUC1 при предопухолевых нарушениях в эпителии наметился только в последние годы [Garbar C. et al., 2008; Do S.I. et al., 2013; Remmers N. et al., 2013; Xiong L. et al., 2012].
При заболевании раком молочной железы (РМЖ), злокачественными эпителиальными опухолями легкого, поджелудочной железы, яичников, печени обнаруживают увеличение содержания MUC1 в циркулирующей крови [Duffy M.J. et al., 2010; Molina R. et al., 2008; Gold D.V. et al., 2007; Dupont J. et al., 2004; Xu H. et al., 2008].
Мониторинг сывороточного уровня MUC1 (CA15-3, CA27.29) у больных метастатическим РМЖ, в сочетании с оценкой клинических факторов и результатов других диагностических тестов, в настоящее время рекомендован Американским обществом клинической онкологии (ASCO) и Европейской группой по опухолевым маркерам (EGTM) для контроля эффективности консервативного лечения [Duffy M.J. et al., 2013; Harris L. et al., 2007]. Данные о сывороточном уровне MUC1 у первичных больных раком легкого немногочисленны и трудно поддаются сравнительному анализу, вследствие разнородности групп обследованных больных и различий использованных методологических подходов [Inata J. et al., 2008; Molina R. et al., 2008; Tanaka S. et al., 2012; Yoshimasu T. et al., 2012]. Работы, целенаправленно характеризующие сывороточный уровень MUC1 при раке желудка, в опубликованной литературе не представлены.
Неоднозначность и недостаточность сведений о клинической значимости МUC1 как опухоль-ассоциированного антигена в отношении ряда актуальных для онкологии направлений определили цель и задачи настоящей работы.
Цель исследования
Целью работы являлась оценка значимости муцина MUC1 как биологического маркера при эпителиальных злокачественных опухолях и изучение аспектов его возможного применения в морфологических и серологических исследованиях у онкологических больных.
Задачи исследования
1. Охарактеризовать оригинальное анти-MUC1 моноклональное
антитело (МКА) ИКО25 по эпитопной специфичности, взаимодействию с
нормальными тканями человека и тканями злокачественных опухолей
различного гистогенеза и локализации.
2. Исследовать экспрессию MUC1, узнаваемого ИКО25
(MUC1/ИКО25), а также различных по гликозилированию форм MUC1 в
ткани молочной железы при доброкачественных заболеваниях,
предопухолевых изменениях и злокачественных опухолях методами
иммуногистохимического анализа.
3. Охарактеризовать особенности экспрессии MUC1/ИКО25 в
нормальном бронхиальном эпителии, при реактивных и предопухолевых
изменениях бронхиального эпителия и при плоскоклеточном раке легкого
методами иммуногистохимического и иммуноцитохимического анализа.
-
Изучить возможность использования MUC1/ИКО25 в цитологических исследованиях как биологического маркера патологических нарушений бронхиального эпителия.
-
Методами иммуноцитохимического анализа исследовать особенности экспрессии MUC1/ИКО25 при предопухолевых изменениях в эпителии шейки матки, в том числе, в аспекте вирус-ассоциированной этиологии заболевания.
6. Разработать тест-систему для количественного определения MUC1 в
сыворотке крови человека методом твердофазного иммуноферментного
анализа на основе ИКО25 и апробировать ее на клиническом материале.
7. Исследовать уровень MUC1/ИКО25 в сыворотке крови при первичном НМРЛ и первичном раке желудка, провести анализ клинико-лабораторных данных и оценить информативность сывороточного уровня MUC1/ИКО25 как серологического маркера у данных больных.
Научная новизна исследования
С использованием оригинального моноклонального антитела ИКО25, полученного к высокомолекулярному гликопротеиду мембран жировых глобул женского молока, впервые детально охарактеризована экспрессия гипогликозилированного MUC1 (MUC1/ИКО25) в бронхиальном эпителии в норме, при реактивных изменениях и предопухолевых нарушениях.
На основании данных, полученных при мониторинге больных раком легкого, впервые установлено, что аномальная экспрессия MUC1/ИКО25 в бронхиальном эпителии является патогенетическим маркером скрытых предопухолевых изменений, характеризующихся высокой вероятностью прогрессии до плоскоклеточного рака. Показана целесообразность определения характера экспрессии MUC1/ИКО25 в бронхиальном эпителии у больных плоскоклеточным раком легкого в целях раннего выявления рецидива опухоли и прогноза развития первично-множественного центрального рака.
На цитологическом уровне исследования впервые выявлена корреляция между особенностями экспрессии MUC1/ИКО25 в клетках цервикального эпителия, цитологическими признаками, патогномоничными для инфекции вирусом папилломы человека (ВПЧ), и положительным результатом определения ДНК ВПЧ высокого канцерогенного риска. Полученные данные свидетельствуют о возможном вирус-ассоциированном характере изменений экспрессии MUC1 в клетках эпителия шейки матки.
На основе ИКО25 разработана оригинальная тест-система для
количественного определения MUC1 в сыворотке крови человека методом
твердофазного ингибиторного иммуноферментного анализа.
Охарактеризована значимость MUC1/ИКО25 как серологического маркера для уточняющей диагностики у первичных больных НМРЛ при различной гистологической и клинико-анатомической форме опухоли, а также в зависимости от возраста пациентов.
Впервые показано, что низкое относительно среднестатистических значений показателя в норме содержание MUC1 в сыворотке крови при первичном раке желудка ассоциировано с бльшей распространенностью опухолевого процесса.
Установлена корреляция между низким дооперационным сывороточным уровнем MUC1 и развитием послеоперационной пневмонии у больных злокачественными опухолями органов верхних отделов желудочно-кишечного тракта, что указывает на возможную клиническую значимость уровня циркулирующего MUC1 как показателя состоятельности местной системы резистентности в ткани легкого.
Научно- практическая значимость работы
Выявленные особенности экспрессии MUC1/ИКО25 в эпителии молочной железы, бронхов и шейки матки являются основой для дальнейшего изучения MUC1 как иммуногистохимического маркера в клинических исследованиях, направленных на определение показаний к проведению органосохраняющего лечения и оценку его эффективности.
Разработан метод оценки характера экспрессии MUC1/ИКО25 в цитологических образцах бронхиального эпителия, который может быть использован в дополнение к комплексному обследованию и при активном мониторинге больных плоскоклеточным раком легкого после специализированного лечения, в целях прогноза и раннего выявления местного рецидива заболевания. Предложен алгоритм оценки результатов иммуноцитохимического исследования бронхиальных мазков-скарификатов, который позволяет оптимизировать схему включения данного теста в программу планового обследования индивидуальных больных. Метод может
быть использован в лечебных учреждениях онкологического и пульмонологического профиля, оснащенных бронхофиброскопической аппаратурой, при поддержке лабораторных подразделений. Применение данного подхода перспективно при формировании групп повышенного риска в целях ранней диагностики центрального рака при обследовании больных хроническими неспецифическими заболеваниями легких.
Результаты, полученные при исследовании содержания MUC1/ИКО25 в сыворотке крови онкологических больных, являются предпосылкой для углубленного клинического изучения MUC1 как серологического маркера при первичном раке легкого, а также в клинических группах больных, характеризующихся повышенным риском развития послеоперационных инфекционно-воспалительных легочных осложнений. Высокий уровень корреляции между сывороточным уровнем MUС1/ИКО25 и СА15-3 делает возможным использование в этих целях существующих коммерческих диагностических наборов.
Положения, выносимые на защиту
-
Изменения в характере экспрессии MUC1, отличающие клетки нормального эпителия и клетки злокачественных эпителиальных опухолей -повышенный уровень экспрессии антигена и его деполяризованное внутриклеточное распределение, в эпителии молочной железы, бронхиальном эпителии и эпителии шейки матки возникают на этапе предопухолевых нарушений до появления морфологических признаков злокачественности.
-
Аномальная для бронхиального эпителия в норме экспрессия гипогликозилированного MUC1 (MUC1/ИКО25) в клетках метаплазированного плоского эпителия и резервных клетках пролиферирующего цилиндрического эпителия является патогенетическим маркером ранних предопухолевых нарушений, характеризующихся высоким риском прогрессии до плоскоклеточного рака.
-
Определение характера экспрессии MUC1/ИКО25 в цитологических образцах бронхиального эпителия в комплексе с бронхоскопическим исследованием позволяет формировать группу риска развития первично-множественного центрального плоскоклеточного рака и местного рецидива заболевания после хирургического и/или эндоскопического лечения у больных плоскоклеточным раком легкого.
-
Высокая экспрессия MUC1/ИКО25 в дискератоцитах, патогномоничных для папилломавирусной инфекции, корреляция между MUC1-положительными дискератоцитами и инфекцией вирусом папилломы человека высокого канцерогенного риска, а также высокий уровень экспрессии антигена в атипических клетках при цервикальной интраэпителиальной неоплазии косвенно указывают на вирус-ассоциированный характер изменений экспрессии MUC1 в эпителии шейки матки.
-
При первичной аденокарциноме легкого увеличение уровня MUC1/ИКО25 в сыворотке крови коррелирует со стадией заболевания. Значимость повышенного сывороточного уровня MUC1/ИКО25 при раке легкого как серологического маркера для уточняющей диагностики зависит от клинико-анатомической локализации новообразования и возраста больных.
-
При первичном раке желудка с распространенной стадией заболевания коррелирует низкий (относительно среднестатистических значений показателя в норме) сывороточный уровень MUC1/ИКО25. Низкий дооперационный уровень MUC1/ИКО25 в сыворотке крови у больных раком желудка и раком пищевода является независимым фактором риска развития послеоперационной пневмонии.
Апробация научных положений. Основные результаты исследований доложены на V съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Санкт-Петербург, 2003); XIII World Congress for Bronchology (Barselona,
Spain, 2004); Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2005; 2006; 2007; 2009;) III Российской конференции по иммунотерапии (Москва, 2006); VIII Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2007); 35th Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, ISOBM (Prague, 2007); 25th International Papillomavirus Conference (Malmo, Sweeden. 2009); Первой Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы флюоресцентной диагностики и фотодинамической терапии» (Москва, 2012); Втором Конгрессе Евро-Азиатской ассоциации дерматовенерологов, ЕААД (Москва, 2012); Второй Всероссийской конференции. «Актуальные вопросы фотодинамической терапии и фотодиагностики» (Москва, 2013); Научно-практическом симпозиуме «Новые медицинские технологии в эндоскопической диагностике и лечении раннего рака желудка и раннего центрального рака легкого» (Москва, 2013); 15th World Conference on Lung Cancer (Sydney, Australia, 2013); VIII Всероссийском съезде онкологов (Санкт-Петербург, 2013).
Апробация состоялась 26.09.2013 г. на межотделенческой конференции ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» МЗ РФ.
Внедрение результатов исследования в практику. Полученные результаты, относящиеся к исследованию экспрессии MUC1 в бронхиальном эпителии, используются в работе эндоскопического отделения ФГБУ «МНИОИ им.П.А.Герцена».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 44 печатные работы: 14 статей в рецензируемых журналах, 1 статья в сборнике научных трудов, 25 тезисов в материалах научных форумов, 4 патента Российской Федерации.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, раздела, содержащего собственные результаты (4 главы), выводов и практических рекомендаций.
Экспрессия и патофизиологическая роль MUC1 при злокачественных новообразованиях эпителия
MUC1 экспрессируется клетками большинства эпителиальных злокачественных опухолей человека: при раке молочной железы (РМЖ), яичников, матки, поджелудочной железы, предстательной железы, легкого и органов верхних дыхательных путей, органов желудочно-кишечного тракта, оро-фарингеальной зоны [166 - 169], а также клетками ряда новообразований гемопоэтической ткани [53, 170].
В отличие от клеток нормального эпителия, в которых экспрессия MUC1 ограничена апикальной мембраной, в клетках эпителиальных злокачественных опухолей часто обнаруживают деполяризованное внутриклеточное распределение антигена по всей поверхностной мембране и накопление MUC1 в цитоплазме [89].
Анализ данных, полученных методами иммуногистохимии, показывает, что частота MUC1-положительных (MUC1+) случаев и распределение антигена в опухолевых клетках зависят от органной локализации, гистологического типа, степени дифференцировки новообразования. Кроме того, относительная доля клеток, окрашенных иммунохимической реакцией в ткани опухоли, варьирует в зависимости от типа МКА, которые используют для анализа.
Клинико-морфологические исследования Рак молочной железы
При РМЖ экспрессию MUC1 обнаруживают в подавляющем большинстве случаев (cм. табл.4). Частота случаев с высоким уровнем экспрессии антигена, т.е. в которых интенсивное окрашивание наблюдается более чем в 50% опухолевых клеток, составляет, по данным различных авторов, от 24% до 88%.
В большинстве случаев, независимо от эпитопной специфичности анти-MUC1 МКА, при РМЖ наблюдают цитоплазматическое окрашивание клеток и деполяризованное распределение MUC1 на поверхностной мембране. В части случаев MUC1 преимущественно локализуется по краю просвета протоковоподобных структур (апикально-люминальное распределение), либо имеет место сочетание указанных вариантов распределения. В публикациях, наиболее репрезентативных по количеству наблюдений, доля случаев инфильтративного протокового РМЖ, в которых внутриклеточное распределение MUC1 соответствует деполяризованному, апикально-люминальному или смешанному типу, составляет 62-77%, 4% и 18-27%, соответственно [33, 19].
Деполяризованный цитоплазматический и/или мембранный тип внутриклеточного распределения MUC1 достоверно ассоциирован с большей степенью злокачественности опухоли и меньшей продолжительностью жизни больных [17, 18, 19]. Как самостоятельный показатель экспрессии MUC1 при РМЖ, высокая доля интенсивно окрашенных клеток в ткани опухоли, безотносительно внутриклеточного распределения антигена, не коррелирует с параметрами TNM и экспрессией HER2, но коррелирует с более высокой степенью гистологической дифференцировки опухоли, положительным статусом по рецепторам эстрогенов и более благоприятным клиническим прогнозом [18, 19, 32, 33, 121, 171].
Полное отсутствие экспрессии MUС1 в опухолевых клетках при РМЖ наблюдается в 2-9% случаев, как правило, при анапластическом раке и коррелирует с повышенной экспрессией Ki-67, утратой экспрессии гормональных рецепторов и HER2, коротким безрецидивным периодом заболевания после лечения [19, 32, 33, 172].
Между индивидуальными опухолями наблюдается существенная вариабельность по представленности эпитопов, которые узнаются различными анти-MUC1 МКА [121, 173, 174]. Отличается и характер корреляции между экспрессией некоторых MUC1-ассоциированных эпитопов и клинико-морфологическими параметрами опухоли [18, 121, 175]. Эти особенности служат основанием для постоянного поиска моноклональных антител, узнающих фенотипические варианты антигена, наиболее информативные для уточняющей диагностики, мониторинга или прогноза онкологического заболевания.
Рак легкого При аденокарциноме (АК) легкого экспрессия MUC1 в опухолевых клетках определяется в подавляющем большинстве (80-100%) случаев (табл.5). При ПКР легкого результат иммуногистохимического окрашивания существенным образом зависит от эпитопной специфичности МКА и частота MUC1+ случаев варьирует от 36 до 95% (табл.5). Можно отметить, что частота подобных случаев при ПКР легкого выше при использовании МКА, узнающих независимые или слабо зависимые от гликозилирования антигенные эпитопы в составе MUC1.
Общий уровень экспрессии MUС1 при раке легкого не коррелирует с прогностически значимыми морфологическими особенностями опухоли. Более того, по данным Awaya Н. с соавт., экспрессия MUC1, который детектируется МКА Ma695, снижается в ряду: атипическая аденоматозная гиперплазия, бронхиолоальвеолярный рак и аденокарцинома легкого, а при раке легкого – снижается с увеличением размера опухоли [176]. Kuemmel A. с соавт. в прямом сравнительном исследовании выявили, что при НМРЛ легкого высокий уровень экспрессии в опухолевых клетках MUC1, узнаваемого PankoMab, в отличие от MUC1, узнаваемого МКА Е29 или 214D14, коррелирует с большей продолжительностью жизни больных [117].
Деполяризованное внутриклеточное распределение MUC1 в опухолевых клетках при АК легкого отмечают в 34 – 50% случаев, как правило, в умеренно и низко дифференцированных опухолях, при ПКР легкого – в 48-100% случаев, безотносительно степени гистологической дифференцировки [21, 177 - 179], при аденоплоскоклеточном и крупноклеточном раке легкого – в 100% случаев [21, 178], при бронхиолоальвеолярном раке – в 15% случаев [176].
Клинический материал, пациенты и дизайн клинико-экспериментальных исследований
Основная часть исследований выполнена на базе МНИОИ им.П.А.Герцена в рамках текущих клинических исследований и протоколов. Анализ клинических данных выполнен с использованием документации клинических и диагностических подразделений МНИОИ им.П.А.Герцена.
Диагноз у больных установлен на основании данных комплексного клинического обследования и верифицирован морфологическим исследованием тканей, полученных при хирургическом вмешательстве, диагностической пункции или биопсии. Морфологический диагноз классифицирован в соответствии с действующей Международной классификацией ВОЗ для соответствующей нозологии, клиническая стадия заболевания у онкологических больных классифицирована по Международной системе TNM [367].
Иммуногистохимическое исследование тканей молочной железы выполнено на архивном материале отделения патологической анатомии МНИОИ им.П.А.Герцена. В числе исследованных образцов тканей: РМЖ (n=179), железисто-фиброзная мастопатия (n=30), доброкачественные опухоли молочной железы (n=18). При РМЖ в 34 случаях исследованы образцы тканей пораженных метастазами лимфатических узлов, в 40 случаях - окружающие опухоль ткани.
Иммуногистохимическое исследование тканей легкого выполнено на архивном материале МНИОИ им.П.А.Герцена: операционном материале и материале биопсий, полученных при плановой диагностической фибробронхоскопии.
Операционный материал получен при плановом хирургическом вмешательстве у 37 больных плоскоклеточным раком (ПКР) легкого, центральный рак – 30, периферический рак – 7, I-IIIА стадия заболевания, Т1-3N0-2M0. Возраст больных на момент выполнения хирургической операции составлял от 49 до 70 лет (медиана 59 лет). Все пациенты – мужчины. Статус курения у больных неизвестен.
У 23 больных злокачественная опухоль локализовалась в верхней доле легкого, у 1 – в средней доле легкого, у 1 - в промежуточном бронхе, у 12 – в нижней доле легкого (центральный рак – 27, периферический рак - 10).
Ткань опухоли исследована во всех 37 клинических случаях. Бронхи пораженной опухолью доли легкого (перитуморальные бронхи) в тех же образцах ткани были представлены в 31 клиническом случае. В 16 случаях были дополнительно исследованы образцы ткани бронха, соответствующего линии хирургической резекции, в 9 случаях – бронхов непораженной опухолью доли легкого, удаленного при пневмонэктомии (дистальные бронхи). Гистологический материал, в котором была представлена слизистая оболочка бронхов, систематизирован в соответствии с документированным описанием патологического исследования и результатами морфологического анализа срезов, окрашенных гематоксилином и эозином (Г&Э). Образцы ткани бронха одного пациента, соответствующие разным анатомическим отделам легкого, или образцы, соответствующие одному анатомическому отделу легкого, но существенно отличающиеся по морфологии бронхиального эпителия, считали топологически разными участками.
Всего исследовано 117 образцов ткани, в которых были представлены 53 разных тополого-анатомических участков перитуморальных бронхов, 19 участков бронхов линии резекции, 14 участков дистальных бронхов. Протяженность слизистой оболочки бронхов составляла от 3 до 20 мм (в среднем 9±5 мм, медиана 8 мм).
Морфологический анализ выполнен по критериям, описанным в специальной литературе [368 - 371], оценка степени тяжести плоскоэпителиальной дисплазии - согласно критериям ВОЗ (2004 г.) [372]. Морфологическим фоном считали микроскопическую картину в слизистой оболочке бронха вне атипического эпителия в пределах гистологического среза.
В пределах исследованного участка слизистой оболочки бронха в 40 образцах ткани отсутствовали признаки инвазивного роста опухоли (дистальные бронхи – 14/14, бронхи линии хирургической резекции -17/19, перитуморальные бронхи – 9/53). Подрастание инвазивной опухоли к слизистой оболочке перитуморального бронха или бронха линии хирургической резекции наблюдалось в 26 образцах ткани. В 20 образцах ткани перитуморальные бронхи непосредственно граничили с опухолевым образованием, либо имело место локальное прорастание опухоли в слизистую оболочку бронха.
Образцы биопсии получены у 12 больных ПКР легкого (стадия заболевания Т1N0M0) до начала лечения или после лечения (всего – 39 образцов ткани).
Методика и критерии оценки иммуногистохимического окрашивания с ИКО25 описаны выше (п.3.4).
Иммуноцитохимическое исследование бронхиального эпителия выполнено на материале, полученном у 316 больных, которые в период с 1990 по 2012 г. проходили обследование и/или лечение в МНИОИ им.П.А.Герцена. Пациенты. Основную группу пациентов, вошедших в исследование, составили больные раком легкого (n=208). У 102 больных иммуноцитохимическое исследование экспрессии MUC1/ИКО25 в бронхиальном эпителии выполнено до начала специфического лечения, у 63 больных - после эндоскопического лечения первичного или первично-множественного начального центрального рака легкого (НЦРЛ), у 43 больных - после хирургического или комбинированного лечения рака легкого.
У больных с первичным или первично-множественным НЦРЛ фибробронхоскопия (ФБС) проводилась с диагностической или лечебной целью, у больных с местно-распространенным раком легкого до лечения - с целью уточнения объема хирургического вмешательства. У больных после эндоскопического лечения первичного или первично-множественного метахронного НЦРЛ и у больных после хирургического или комбинированного лечения рака легкого - с целью профилактики эндобронхиального рецидива опухоли.
Диагноз у больных установлен на основании данных комплексного клинического обследования, гистологическая форма опухоли – по данным планового морфологического исследования операционного материала или биопсии. Клиническая характеристика пациентов представлена в табл. 9 - 11.
Основную группу сравнения составили больные хроническими неспецифическими заболеваниями легких (ХНЗЛ, n=80), которым ФБС проводилась для оценки состояния бронхиального дерева и выявления сопутствующей бронхиальной патологии. Клиническая характеристика пациентов представлена в табл.12.
Экспрессия MUC1/ИКО25 и 5-АЛК-индуцированный протопорфирин IX в клетках бронхиального эпителия
В настоящее время при бронхоскопическом исследовании широко используются методы флуоресцентной диагностики, основанные на снижении уровня эндогенной флуоресценции или повышенном накоплении протопорфирина IX (ППIX) при поступлении в организм 5-аминолевулиновой кислоты (5-АЛК) в патологически измененных участках слизистой оболочки бронхов [390, 391]. Их применение позволяет значительно увеличить чувствительность диагностики ранних форм центрального ПКР легкого, а также предопухолевых изменений в бронхах. Однако специфичность данных методов не превышает 55%, вследствие высокой доли ложно-положительных результатов.
В группе больных центральным ПКР легкого, которые на различных этапах обследования до и после лечения обследованы методом флуоресцентной диагностики с использованием препарата «Аласенс» (12 больных), исследована экспрессия MUC1/ИКО25 в мазках-скарификатах бронхиального эпителия в участках слизистой оболочки, характеризующихся повышенной флуоресценцией 5-АЛК индуцированного ППIX.
Как видно из данных, представленных в таблице 33, аномальная экспрессия MUC1/ИКО25 в участке, характеризующейся высоким (Фн 3,0 – 16,4), или умеренно повышенным (Фн 1,4 – 2,7) показателем нормированной флуоресценции достоверно коррелировала с CIS или дисплазией в исследованном участке слизистой оболочки бронхов. Так, при гистологически верифицированном интраэпителиальном поражении положительный результат MUC1-теста установлен во всех 13 случаях, при отсутствии патологических изменений – в 10/12 случаев (p 0,001; точный тест Фишера). При этом «ложно-положительный» результат в обоих случаях получен в перитуморальных участках слизистой оболочки бронхов.
Нормальный показатель Фн (0,8 -1,2) во всех случаях коррелировал с отрицательным результатом MUC1-теста и отсутствием патологических изменений в исследованном участке.
Распределение 5-АЛК-индуцированного ППIX в бронхиальном эпителии на клеточном уровне исследовано методами микроспектрального анализа и эпифлуоресцентной микроскопии в цитологических образцах, полученных в участках повышенной флуоресценции со слизистой оболочки пораженных бронхов у больных первично-множественным НЦРЛ. При плановом морфологическом исследовании CIS верифицирован в двух случаях, в двух других случаях признаков опухоли не обнаружено.
Таблица 33 Данные спектральной флуоресцентной фибробронхоскопии (5-АЛК-индуцированная флуоресценция) и результаты иммуноцитохимического исследования экспрессии MUC1/ИКО25 в этих участках слизистой оболочки бронхов у больных центральным ПКР легкого
Микроскопическое исследование специфической визуальной флуоресценции ППIX в сочетании с микроспектральным исследованием мазков-скарификатов, полученных в участках ложно-положительной 5-АЛК индуцированной флуоресценции, выявило интенсивное накопление ППIX в морфологически нормальных клетках цилиндрического бронхиального эпителия, а также в клетках метаплазированного плоского эпителия (рис.41 и 42). Специфичность регистрируемого флуоресцентного сигнала для ППIX подтверждена методами спектроскопического анализа (рис.43). В бокаловидных и кератинизированных клетках флуоресценции ППIХ не регистрировалась.
. ППХ в клетках покровного бронхиального эпителия. Микрофотографии мазков-скарификатов больного первично-множественным раком легкого, полученных в зоне повышенной 5-АЛК индуцированной флуоресценции через 3 часа после приема аласенса.
А, C: общий вид участка в цитологическом препарате, окрашивание гематоксилином-эозином (ув.х200), рамка - участки, соответствующие зоне сканирования. B и D -спектральные изображения, соответствующие распределению специфической флуоресценции ППХ (негативные изображения). ППХ в клетках метаплазированного плоского эпителия, в кератинизированной клетке (D, стрелка) специфический сигнал отсутствует. ППХ в клетках покровного бронхиального эпителия. Микрофотографии мазков-скарификатов больного первично-множественным раком легкого, полученных в зоне повышенной 5-АЛК индуцированной флуоресценции через 3 часа после приема аласенса.
А, C: общий вид участка в цитологическом препарате, окрашивание гематоксилином-эозином (ув. х200), рамка - участки, соответствующие флуоресцентному изображению. B и D - эпифлуоресценция ППХ.
Иммуноцитохимическое исследование тех же препаратов с ИКО25 показало, что среди клеточных элементов цилиндрического бронхиального эпителия интенсивное окрашивание маркирует только клетки базального и/или промежуточного типа и отсутствует в дифференцированных клетках, которые, в свою очередь, отличаются повышенной 5-АЛК-индуцированной флуоресценцией. Сочетание аномальной экспрессия MUC1/ИКО25 и накопления ППIX наблюдалось в клетках метаплазированного плоского эпителия, в мазках, полученных в участке дисплазии (рис.44 и 45).
Таким образом, по сравнению с повышенным накоплением в клетках 5-АЛК-индуцированного ППIX, аномальная экспрессия MUC1/ИКО25 более специфична для участков с патологическими изменениями в бронхиальном эпителии.
Повышенный уровень MUC1/ИКО25 в сыворотке крови как серологический маркер аденокарциномы при первичном раке легкого
По данным Molina R. с соавт., повышенное содержание в сыворотке крови больных СА15-3 ( 35 U/ml), в панели с другими серологическими маркерами, может быть полезным для уточняющей диагностики гистологического типа опухоли у неоперабельных больных раком легкого [58]. По результатам нашего исследования, среди наиболее часто встречающихся типов НМРЛ сывороточный уровень MUC1/ИКО25, превышающий ДУ60, достоверно коррелировал с гистологическим диагнозом АК, однако наблюдался не у всех больных АК и был выявлен в части случаев при распространенном ПКР легкого.
Для того чтобы оценить значимость данного показателя как серологического маркера аденокарциномы для дифференциальной диагностики гистологического типа злокачественной опухоли в легком, выполнен сравнительный анализ частоты случаев МиС1 ДУ60 в общей группе обследованных больных (п=296).
Таблица 66 демонстрирует распределение наблюдений в зависимости от уровня MUC1/ИКО25 в сыворотке крови, гистологического диагноза, клинико-анатомической локализации новообразования и возраста пациентов.
Как видно из представленных данных, при периферическом раке легкого МиС1 ДУ60 с большим уровнем достоверности коррелирует с гистологическим диагнозом АК, чем при опухолевом поражении центральных отделов легкого. В отдельно взятой группе больных периферическим раком легкого МиС1 ДУ60 достоверно коррелирует с гистологическим диагнозом АК только в старшей возрастной группе больных.
Совокупная доля истинно положительных (МиС1 ДУ60 при АК) и истинно отрицательных случаев (МиС1 ДУ60 при других гистологических формах злокачественной опухоли легкого, «не АК») среди больных в возрасте старше 64 лет была достоверно выше, чем в младшей возрастной группе пациентов (47/93 против 50/70, р=0,008, х2-тест).
Отличия диагностической значимости МІГСКДУбО в данных группах больных демонстрирует различная форма ROC-кривых, построенных на основании оценки показателей специфичности и чувствительности (рис.77).
В старшей возрастной группе больных периферическим раком легкого специфичность MUC1 ДУ60 как маркера АК составила 97% (84 – 100%; 95% доверительный интервал), предсказательная значимость положительного результата (PPV) – 95% (75 – 99%), при чувствительности -50% (33 – 67%) и предсказательной значимости отрицательного результата (NPV) - 63% (49 – 76%; см. табл.67).
Диагностические показатели для MUC1 ( ДУ60) как серологического маркера аденогенного рака при злокачественном поражении легкого в различных клинических группах больных со злокачественным поражением легкого
Доля истинно положительных случаев и истинно отрицательных случаев существенно возрастала в отдельно взятой старшей возрастной группе больных периферическим раком легкого, у которых установлена III или IV стадия заболевания: специфичность МІГСКДУбО как маркера АК составила 94% (71 - 99%), чувствительность - 80% (56 - 94%), PPV - 94 (71 -99%), NPV - 80 (56 - 94%).
В общей группе наблюдений у больных злокачественными опухолями легкого, среди всех случаев, в которых клинически установлена IV стадия заболевания, не выявлено зависимости между степенью увеличения содержания MUC1/ИКО25 в сыворотке крови и органной локализацией отдаленных метастазов. При периферической локализации новообразования в легком доля случаев МиС1 ДУ40 или МиС1 ДУ60 не коррелировала с опухолевым поражением плевры. Среди клинических случаев, сопоставимых по гистологическому типу опухоли, стадии заболевания и клинико анатомической форме роста новообразования, не выявлено зависимости между уровнем MUC1/ИКО25 в сыворотке крови и степенью гистологической дифференцировки опухоли. Не найдено достоверных корреляций между повышенным значением показателя и сопутствующими неопухолевыми заболеваниями легких, органов желудочно-кишечного тракта, носительством вируса гепатита В или С.
Похожие диссертации на Муцин MUC1 как биологический маркер в морфологических и серологических исследованиях у онкологических больных
