Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы серологические опухолевые маркеры в онкоурологии 10
1.1. Серологические и уринологические маркеры рака мочевого пузыря 10
1.1.1 Уринологический маркер рака мочевого пузыря UBC (Urinary Bladder Cancer).. 10
1.1.2 Серологические маркеры при раке мочевого пузыря 14
1.2 Серологические маркеры рака почек 19
1.2.1 Ти М2-РК (опухолевая пируваткиназа М2-типа) 19
1.2.2. Дополнительные серологические маркеры рака почек 23
1.2.3. Молекулы адгезии и некоторые цитокины в сыворотке крови при раке почек .31
1.3. TPS как дополнительный маркер рака предстательной железы 34
ГЛАВА II.Материалы и методы 38
II. 1.Характеристика клинических случаев 38
И. 1.1.Исследование клинической значимости UBC 38
И. 1.2. Исследование клинической значимости Ти М2-РК 38
П.1.3. Исследование клинической значимости TPS 39
ІІ.2. Определение опухолевых маркеров в биологических жидкостях 39
Н.2.1.Подготовка мочи для определения UBC 39
И.2.2. Определение UBC в моче 40
П.2.3. Метод определения креатинина в моче 41
П.2.4.Подготовка плазмы для определения Ти М2-РК 41
И.2.5.Определение Ти М2-РК в ЭДТА плазме крови 41
П.2.6.Подготовка сыворотки крови для определения TPS 42
И.2.7.0пределение TPS в сыворотке крови 43
П.З.Статистическая обработка 43
ГЛАВА III. Результаты и их обсуждение 44
III. 1.Исследование чувствительности и специфичности UBC при раке мочевого пузыря.44
III. 1.1. Определение дискриминационного уровня (ДУ) 44
ПІЛ .2. Исследование уровня UBC у первичных больных раком мочевого пузыря 52
Ш.1.3 Исследование уровня UBC у больных с рецидивом рака мочевого пузыря 58
ПІ 1 .4. Сравнение диагностической чувствительности UBC и цитологического исследования клеточного осадка мочи у больных раком мочевого пузыря 62
ПІЛ .5. Первый опыт использования UBC в мониторинге больных раком мочевого пузыря 64
Ш.2.Исследование чувствительности и специфичности Ти М2-РК при раке почек 73
Ш.З Исследование чувствительности и специфичности TPS у больных раком предстательной железы до и на этапах лечения 88
ГЛАВА IV. Заключение 100
Выводы 111
Практические рекомендации 113
Список литературы 114
- Серологические и уринологические маркеры рака мочевого пузыря
- Ти М2-РК (опухолевая пируваткиназа М2-типа)
- Определение опухолевых маркеров в биологических жидкостях
- Сравнение диагностической чувствительности UBC и цитологического исследования клеточного осадка мочи у больных раком мочевого пузыря
Введение к работе
В России наблюдается постоянный рост онкоурологических заболеваний: рака мочевого пузыря - прирост за последние 10 лет составляет 29,6%, рака почек - по темпам прироста заболеваемости в России занимает 2 место и рака предстательной железы - в настоящее время занимает 4 место среди онкологических заболеваний мужчин [9]. Несмотря на успехи в использовании традиционных (операция, химио- и лучевая терапии), а также нетрадиционных (фотодинамическая, гормоно- и иммунотерапии) методов лечения, выживаемость больных в целом остается низкой. Одной из причин этого является большая распространенность опухолевого процесса примерно у трети первично выявленных больных. Тем самым очевидным является необходимость использования в лечении комбинированных и комплексных подходов, а также осуществления длительного наблюдения за больными с целью как можно раньше выявить развитие рецидива заболевания.
В мониторинге онкоурологических больных также есть ряд вопросов, приблизить к решению которых могли бы серологические и уринологические опухолевые маркеры (ОМ). Так, при раке мочевого пузыря особую проблему составляют поверхностные опухоли (Та, Tis, ТІ), составляющие 70-80% первичных случаев [6;8]. Среди них крайне важно выявить наиболее агрессивные формы, которые после органосохранного лечения склонны к многократному рецидивированию, а также способны переходить в инвазивные с течением времени, что требует иной, более агрессивной тактики лечения. Традиционно основными методами диагностики и мониторинга больных раком мочевого пузыря являются ультразвуковое исследование (УЗИ), которое дополняется такими инвазивными методами, как цистоскопия с последующим гистологическим исследованием биоптатов, а также применяемая в последнее время флуоресцентная диагностика [3-5;7]. Поэтому проблема поиска более простых неинвазивных методов уточняющей диагностики, которые позволили бы, с одной стороны, сократить количество промежуточных цистоскопии, а, с дру-
5 гой стороны, при подозрении на рецидив явились бы основанием для дообследования больного при мониторинге, остается актуальной. Одним из таких лабораторных методов диагностики рака мочевого пузыря является цитологическое исследование клеточного осадка мочи, которое многие авторы называют «золотым стандартом» [7]. Однако при ранних стадиях заболевания и высокодифференцированном раке мочевого пузыря чувствительность данного метода довольно низка из-за малого количества атипических клеток уротелия в моче. Попытки использовать для диагностики и мониторинга больных раком мочевого пузыря известные серологические маркеры, такие как (РЭА, СА 19-9, С А 125 и др.) не привели к успеху вследствие их низкой диагностической чувствительности при этом заболевании. В настоящее время в ряде публикаций заявлено о новых перспективных маркерах рака мочевого пузыря, одним из которых является UBC (Urinary Bladder Cancer antigen). Количество публикаций, посвященных UBC пока невелико, и клинико-лабораторная концепция использования этого маркера пока не сформирована. И если относительно диагностической чувствительности UBC авторы единодушны в том, что она составляет 60-80%, то вопросы, касающиеся специфичности этого антигена, практически не изучены [95;97]. Мнения разных исследователей расходятся даже в том, каков его дискриминационный уровень. Практически не освещены в литературе и вопросы об уровнях UBC при поверхностном и ин-вазивном раке мочевого пузыря и возможности использования маркера для мониторинга эффективности консервативных методов лечения. Не изучены пока и сроки анализа UBC после проведения трансуретральной резекции (ТУР) или фотодинамической терапии (ФДТ). Таким образом, исследование и апробация UBC у больных раком мочевого пузыря представляется нам актуальной своевременной задачей.
Целесообразность использования серологического ОМ при раке почек также очевидна: около половины злокачественных новообразований почек выявляются на поздних стадиях процесса, причем у 25% пациентов при первом обращении процесс расценивается как местно-распространенный [8].
Больные раком почек, особенно с распространенными формами опухолевого процесса, подвергаются наряду с хирургическим лечением длительной иммунотерапии или химио-иммунотерапии. Такое комбинированное лечение требует постоянного динамического контроля его эффективности. Не менее важным аспектом ведения больных раком почек является доклиническое выявление рецидивов болезни. Основным методом диагностики рака почек является в настоящее время УЗИ и лучевые методы. Лабораторных методов уточняющей диагностики до недавнего времени разработано не было, а известные опухолевые маркеры не обладали достаточной чувствительностью и специфичностью для решения поставленных задач. В последние годы был описан принципиально новый тип опухолевых маркеров - метаболических маркеров, одним из представителей которых является, в частности, Ти М2-РК. Авторами было установлено, что в клетках многих опухолей вследствие особенностей их метаболизма функционирует особая (димерная) форма пируваткиназы (Ти М2-РК) [71]. Несмотря на то, что количество исследований, посвященных этому новому маркеру, невелико, авторы отмечают значимые различия между концентрацией в плазме крови Ти М2-РК у больных раком почек и у пациентов с воспалительными заболеваниями почек [34]. Кроме того, данные исследователей позволяют предположить, что существует корреляционная связь между концентрацией маркера и стадией опухолевого процесса [19]. Таким образом, появилась перспектива осуществлять как уточняющую лабораторную неинвазивную диагностику у больных с подозрением на рак почек, так и мониторинг больных. В то же время, как и для UBC, клинико-диагностическая концепция использования этого маркера, в частности при раке почек, пока не сформирована: нет единого мнения о его дискриминационном уровне (вследствие малого количества данных, сопоставляющих его концентрации у больных раком почек и пациентов с незлокачественными заболеваниями почек и доноров), малоисследованными являются вопросы возможности использования этого маркера для оценки эффективности лечения и доклинического выявления рецидивов заболевания.
В отличие от рака мочевого пузыря и рака почек, для ранней диагностики и мониторинга рака предстательной железы существует надежный стади-оспецифический маркер - простатспецифический антиген (ПСА). Несмотря на то, что в большинстве случаев мониторинг больных раком предстательной железы по уровню ПСА отражает течение болезни и эффективность лечения, существуют и исключения. В частности, к таким ситуациям можно отнести гормонорефрактерный рак предстательной железы. При развитии гормоно-рефрактерности, по мнению ряда авторов, уровень ПСА в ряде случаев неадекватно отражает течение болезни, а именно не «чувствует» прогрессирования процесса. Кроме того, ПСА обладает недостаточной диагностической чувствительностью при низкодифференцированном раке предстательной железы [117]. Поэтому маркер, который мог бы дополнить ПСА в мониторинге или заменить его при изначально ПСА-негативных опухолях, был бы востребованным клиникой. Подойти для этой цели, по мнению некоторых авторов, мог бы TPS (tissue polypeptide specific antigen). Трудно ожидать, что его будет целесообразно использовать (вместо ПСА) для выявления рака предстательной железы или различения доброкачественной гиперплазии простаты и рака. Тем не менее, в отдельных исследованиях отмечено снижение высокого стартового уровня TPS в процессе андрогеносупрессивной терапии, что свидетельствует о его адекватности при раке предстательной железы и позволяет надеяться на возможность его использования в мониторинге больных с низкодиффе-ренцированным или гормонорефрактерным раком предстательной железы.
Таким образом, в последние несколько лет были предложены тест-системы для определения в биологических жидкостях новых онкоурологиче-ских маркеров, перспективных для решения некоторых клинических задач: UBC - в качестве неинвазивного метода для мониторинга больных раком мочевого пузыря; Ти М2-РК - в качестве маркера рака почек и TPS - при исходной или приобретенной ПСА-негативности рака предстательной железы. Это определило цель и задачи настоящего исследования.
8 ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Цель работы - оценить значимость новых опухолевых маркеров UBC для рака мочевого пузыря, Ти М2-РК для рака почек и TPS для рака предстательной железы.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Исследовать диагностическую чувствительность UBC у первичных и больных с рецидивом рака мочевого пузыря с различными стадиями опухолевого процесса.
Исследовать специфичность UBC для рака мочевого пузыря.
Исследовать целесообразность использования UBC в мониторинге больных раком мочевого пузыря.
Исследовать влияние лечебно-диагностических процедур на концентрацию UBC в моче.
Исследовать роль Ти М2-РК в уточняющей диагностике первичного рака почек и в доклиническом выявлении рецидивов процесса.
Исследовать диагностическую чувствительность TPS при раке предстательной железы и возможности его использования для мониторинга больных при развитии гормонорезистентности.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА.
Впервые исследован уровень UBC в моче сравнительно большой (264 чел.) популяции больных разных клинических групп и доноров, что позволило установить такой дискриминационный уровень этого маркера, который обеспечивает высокую диагностическую чувствительность (86,4%) и специфичность (85,7%) у пациентов с раком мочевого пузыря.
Установлены достоверные различия в средних уровнях UBC у больных поверхностным и инвазивным раком мочевого пузыря.
Путем анализа данных об уровнях Ти М2-РК у больных разных клинических групп и доноров установлен дискриминационный уровень этого мар-
9 кера, при котором его диагностическая чувствительность и специфичность у больных раком почек сравнительно велики (76,0% и 81,6%).
На основании анализа уровней UBC (у больных раком мочевого пузыря) и Ти М2-РК (у больных раком почек) в ремиссии, в динамике наблюдения и при клинически доказанном рецидиве заболевания показана целесообразность мониторинга соответствующих категорий больных с использованием этих маркеров для оценки эффективности лечения и доклинического выявления рецидивов заболевания.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.
На основании анализа уровней 3-х онкомаркеров (UBC, Ти М2-РК и TPS в биологических жидкостях 617 больных разных клинических групп (со злокачественными новообразованиями мочевого пузыря, почек, предстательной железы, других локализаций, доброкачественных опухолей, при острых и хронических воспалительных заболеваниях) и у доноров сформированы практические рекомендации по использованию этих маркеров в онкологической практике.
Выявлены возможные неспецифические причины повышения маркеров, которые необходимо учитывать как при назначении этих анализов, так и при интерпретации результатов.
Установлена нецелесообразность исследования TPS на этапах лечения и наблюдения у больных раком предстательной железы, в том числе и при развитии гормонорезистентности.
Серологические и уринологические маркеры рака мочевого пузыря
В настоящее время описан новый класс ОМ - цитокератины. Они относятся к семейству белков промежуточных филаментов эпителиальных клеток. Все промежуточные филаменты подразделяются на 3 класса: цитокератины (основной класс), виментин (или виментино-подобные белки) и нейрофила-менты, которые образуются путем полимеризации белковых субъединиц. В настоящее время в человеческих эпителиальных клетках описано уже около 4итокератинов с молекулярной массой от 40 до 68 кГЭа. Цитокератины, в свою очередь, подразделяются на два основных типа. Цитокератины I типа (10-19) - это небольшие (с молекулярной массой 40-56,5 кЕ)а) кислые полипептиды, и II типа (1 - 9) - более крупные (с молекулярной массой 53-68 кОа) и более щелочные молекулы. При сборке промежуточных филаментов в клетках происходит объединение по одному представителю обоих типов этих белков.
В переходно-клеточном эпителии мочевого пузыря выявлена экспрессия двух цитокератинов-8 и 18. Растворимые фрагменты цитокератинов 8/18 в моче обладают антигенными свойствами и относятся к маркерам эпителиальной дифференцировки. При пролиферации и злокачественной трансформации клеток экспрессия цитокератинов усиливается. Растворимые фрагменты цитокератинов секретируются клетками уротелия в мочу, и у больных раком мочевого пузыря их концентрация часто бывает повышенной. Эти данные послужили основанием для получения специфических (перекрестнореа-гирующих с одной из антигенных детерминант цитокератинов 8/18) мышиных моноклональных антител и создания на их основе иммуноферментного метода выявления цитокератинового антигена 8/18 в моче. Метод получил название UBC-тест, а выявляемый с его помощью эпитоп (общий для цитокератинов 8 и 18) - UBC. Число публикаций, посвященных изучению UBC у онкологических больных, пока невелико, и клинико-диагностическая концепция его использования в онкоурологии пока не сформирована. Так, авторы, исследующие UBC, пока даже не пришли к единому мнению о дискриминационном уровне (ДУ - верхней границе нормы) этого маркера, поэтому необходимы дополнительные исследования для его установления. В целом, ДУ UBC, вероятно, находится в диапазоне 14,1 - 53,0 мкг/л. Окончательно не решен вопрос о необходимости корректировки концентрации UBC в моче по креатинину (CREA). Большинство авторов полагают, что пересчет UBC с учетом количества креатинина в моче необходим, так как корректирует степень разбавления мочи у разных лиц.
По данным литературы [28;75;78] повышенная концентрация цитокера-тинов 8/18 может наблюдаться при некоторых неопухолевых заболеваниях, в частности при диабете, сепсисе. Кроме того, такие заболевания, как цистит, гломерулонефрит, мочекаменная болезнь и гематурия различного генеза в 15-20% случаев могут сопровождаться некоторым увеличением содержания UBC в моче пациентов [78;97;99]. При других (отличных от рака мочевого пузыря) злокачественных новообразованиях этот маркер повышается редко [95].
Общая специфичность UBC в отношении рака мочевого пузыря, по мнениям разных авторов, колеблется от 76,6% до 92,0%. Чувствительность UBC у первичных больных колеблется от 60% до 87% [96;98;106;112]. UBC проявляет некоторые свойства стадиоспецифичности при раке мочевого пузыря, т.е. его чувствительность несколько возрастает со стадией опухолевого процесса. Так, при Та стадии рака мочевого пузыря повышенные уровни UBC встречаются в 60,7%-62,1% , ТІ- в 53,8 - 69,2% , а при ТЗ - в 80% случаев [43;74;75]. Таким образом, авторы предполагают, что UBC можно использовать для различения поверхностного и инвазивного рака мочевого пузыря. Кроме того, установлена зависимость уровня UBC от степени злокачественности опухоли: повышенные концентрации UBC обнаружены в 41,0% - 66,6% случаев высокодифференцированного рака мочевого пузыря и в 68,7% - 75,0% при низкодифференцированных опухолях [43;74;103;112].
Все это позволяет предложить целесообразность изучения этого маркера в качестве фактора прогноза течения рака мочевого пузыря и для оценки эффективности лечения. И первые данные литературы в этом плане являются обнадеживающими. Так у больных раком мочевого пузыря, находящихся в стадии ремиссии, UBC был отрицателен в 97,4% случаев и, напротив, был повышенным в 40% случаев рецидивов болезни [16;96]. Среди больных инва-зивным раком мочевого пузыря, переживших 5-летний рубеж, 35% составляли пациенты, имеющие низкодифференцированный рак и исходно высокий уровень UBC, а 60% - высокодифференцированный рак и исходно низкий уровень UBC [27; 103].
«Золотым стандартом» в лабораторной диагностике рака мочевого пузыря является цитологический метод исследования клеточного осадка мочи, который отличается высокой специфичностью (91,5%-100%) [18;39; 113]. Однако недостатком цитологического исследования клеточного осадка мочи является сравнительно низкая чувствительность - в целом - около 50% [23;47;90;112], особенно для высокодифференцированных карцином мочевого пузыря ( 20%) [20; 87]. Недостаточной является и чувствительность этого метода для начальных стадий рака мочевого пузыря: 26,6% (Та), 40,0% (ТІ), 80,0% (Т2-4) [39]. Цитологическое исследование клеточного осадка мочи также имеет сравнительно низкую чувствительность при мониторинге больных раком мочевого пузыря в плане выявления рецидива опухоли - всего 10-15% [20].
Ти М2-РК (опухолевая пируваткиназа М2-типа)
Каждый год в литературе появляются сообщения о новых ОМ, предназначенных для уточняющей диагностики и мониторинга онкологических больных. Очевидно, что отбор антигенов, пригодных для этих целей, ведется иммунологическими методами, поэтому функции большинства из них в клетках пока мало изучены. Однако при поиске новых ОМ возможно сочетать иммунологический подход с патогенетическим: использовать в качестве антигенов для получения антител изоформы белков (или сложных белков) с изученной функцией, про которые заранее известно , что их количество в опухолевых и нормальных клетках различаются. Одним из таких белков является пируваткиназа. Этот фермент был получен в кристаллическом виде (молекулярная масса - 250 кД) и сравнительно хорошо изучен.
Пируваткиназа является одним из ферментов гликолиза и катализирует перенос фосфатной группы от фосфоенолпирувата на АДФ с образованием пирувата и АТФ. Таким образом, этот фермент обеспечивает синтез АТФ в тканях с низким содержанием кислорода[1].
В нормальных тканях в клетках человека молекула пируваткиназы функционирует в виде тетрамера из изоформ - L-PK, R-PK, М1-РК типов и обладает высоким аффинитетом к субстрату - фосфоенолпирувату (ФЭП). В опухолевых клетках в условиях гипоксии функционирует особый тип фермен та - так называемая опухолевая пируваткиназа - М2-типа (Ти М2-РК), которая является димером и обладает низким аффинитетом к ФЭП.
Предложение использовать Ти М2-РК в качестве универсального опу-холеассоциированного маркера базируется на представлении о том, что опухолевые клетки обладают особым метаболизмом (преобладание гликолиза над аэробным дыханием), связанным с недостаточным неоангиогенезом вследствие быстрой пролиферации опухолевых клеток. Этот «опухолевый» тип метаболизма по мнению Л.М.Шабата характеризуется тем, что клетки как бы «срезают углы» обмена в целях экономии энергии, необходимой для их размножения [2]. Для обеспечения такого энергетического пути в клетках опухолей возрастает количество особой формы пируваткиназы - опухолевой РК М2-типа. И именно благодаря этим особенностям злокачественной опухоли, по мнению разработчиков теста, можно использовать Ти М2-РК как для выявления людей с различными опухолями, так и для мониторинга онкологических больных с целью оценки эффективности лечения и доклинического выявления рецидивов заболевания. Повышение уровня Ти М2-РК в плазме крови, по мнению авторов теста, отражает базовые сдвиги в клеточном метаболизме при многих видах опухолей: раке молочной железы, легких, пищевода, поджелудочной железы, почек и др.
, Хотя утверждение об универсальности Ти М2-РК теоретически обосновано, оно пока носит декларативный характер, так как количество статей, посвященных использованию этого маркера для диагностики онкологических заболеваний и мониторинга онкологических больных, пока лишь несколько. В то же время даже этот небольшой опыт свидетельствует о перспективности применения этого маркера в онкологии.
Обследование доноров позволило выбрать ДУ Ти М2-РК, который, по мнению разработчиков, составляет 15 ед/мл [34;67;85;100]. Однако первые исследователи Ти М2-РК утверждают, что в целях уточняющей диагностики злокачественных новообразований различных органов необходимо использовать разный ДУ. Так ДУ, при котором наблюдается оптимальное соотношение чувствительности и специфичности Ти М2-РК для рака поджелудочной железы составляет 28 ед/мл [34], а для рака молочной железы, рака легкого и рака почек - 15 ед/мл [67;84;85;100]. Такое положение характерно для малоисследованных ОМ - окончательный выбор ДУ, как правило, осуществляется при накоплении больших массивов данных об уровнях маркера у доноров и больных с воспалительными и злокачественными новообразованиями. В то же время мы не можем исключить того, что для метаболических маркеров (при их использовании для уточняющей диагностики) ДУ для разных опухолей действительно будет различаться.
Немногочисленные данные литературы свидетельствуют о том, что у Ти М2-РК мало выражены свойства острофазного белка: при воспалительных процессах маркер, как правило, остается в пределах нормы [84;85;100]. Однако существуют и другие данные. Так было обнаружено, что Ти М2-РК иногда повышается у пациентов с бактериальными инфекциями, ревматоидным артритом, диабетической нефропатией (Oremek et al., 2003), диабетической ретинопатией (Oehler et al., 2000). Наиболее высокий процент повышенных значений маркера (до 64,3%) был отмечен у пациентов с доброкачественными опухолями поджелудочной железы [34].
При злокачественных новообразованиях Ти М2-РК показал сравнительно высокую чувствительность [41;83]. Так при раке поджелудочной железы чувствительность этого маркера составила 79% [34]. Кроме того, у этих больных была отмечена хорошая корреляция между уровнем маркера и степенью распространенности опухолевого процесса.
При раке легкого чувствительность Ти М2-РК по данным J.Schneider et al. в целом составляет 58% [100]. Авторы показали и существенное увеличение уровней Ти М2-РК при прогрессировании злокачественного процесса у этих больных. Исследователи отмечают, что сходные данные при раке легкого получены и для маркера Cyfra 21-1. Однако для одной и той же выборки больных чувствительность Ти М2-РК была несколько выше, чем Cyfra 21-1 -58% и 48% соответственно. Авторы предполагают, что этот метаболический маркер может быть пригоден и для мониторинга больных раком легкого с целью доклинического выявления прогрессирования процесса.
Определение опухолевых маркеров в биологических жидкостях
Материалом для исследования UBC антигена служила средняя порция утренней мочи. Полученные образцы мочи центрифугировали при 1000 g в те чение 30 мин. Для анализа использовали супернатант. Подготовленную мочу до постановки анализа хранили при +2 - +8С; более длительное хранение осуществляли при t = - 20 С. Непосредственно перед анализом мочу разводили в 10 раз специальным «разбавителем мочи», входящим в набор.
Определение UBC в моче.
Уровень UBC в моче определяли иммуноферментным «IDEAL Biotech ELISA» (Швеция) методом с помощью моноклональных анти-UBC антител. Для этого образцы мочи, стандарты и контроли инкубировали с моноклональ-ными анти-UBC антителами, нанесенными на лунках микропланше-тов.Одновременно в лунки вносили HRP-меченные (пероксидазой хрена) вторые антитела. При последующей инкубации (в течение 2-х часов), как иммобилизованные антитела, так и HRP-меченные, связывались с UBC антигеном, формируя «сэндвич» на твердой фазе. Далее лунки отмывали от несвя-завшихся реагентов и добавляли хромогенный субстрат (3,3 5,5 тетраметилбензидин (ТМВ)), разложение которого катализируется пероксидазой хрена, входящей в состав "сандвича". Количество образовавшегося окрашенного в синий цвет продукта пропорционально количеству UBC антигена в моче (в диапазоне 0-15 мкг/л). Через 15 мин реакцию останавливали с помощью 0,5М серной кислоты. Оптическую плотность измеряли на Ридере для микропланшет фирмы «Labsystem» (Финляндия) с фильтром 450 нм. Концентрацию антигена UBC в исследуемых образцах мочи определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартам с известными концентрациями UBC. Концентрацию UBC в образцах мочи рассчитывали в соответствии с фактором разведения (1:10) и корректировали на уровень креатинина в моче (CREA).
UBC корр. (мкг иВС/мкмоль CREA) = ЦВС(мкг/л)/ CREA (мкмоль/л). Уровень креатинина в моче рассчитывали по методу Яффе. Уровень креатинина в утренней моче определяли кинетическим (без де-протеинизации) методом Яффе. Определение креатинина осуществляли сотрудники клинико-диагностической лаборатории МНИОИ им.П.А.Герцена.
Принцип метода: креатинин в щелочной среде образует с пикриновой кислотой окрашенный (оранжево-красный) комплекс. Изменение экстин-ции инкубационной смеси за фиксированное время прямо пропорционально концентрации креатинина в образце. Моча перед исследованием разводят в 100 раз .Анализ проводили на автоматическом биохимическом анализаторе при длине волны 505 нм.
Уровни Ти М2-РК определяют только в плазме крови, которую получают в результате обработки венозной крови пациента, взятой из локтевой вены натощак, 1,5% раствором ЭДТА. Полученные образцы ЭДТА-плазмы центрифугировали в течение 15-20 минут при 1500 об/мин. Для анализа использовали супернатант. Хранение образцов плазмы осуществляли при +2 - +8 С не более 3 суток. При невозможности немедленного определения ОМ, биологические образцы хранили при температуре -20 С (не более одного года). Перед анализом образцы ЭДТА-плазма разводится в 100 раз раствором ФСБ, входящим в набор. Образцы с концентрацией Ти М2-РК, превышающей значения аналитического диапазона ( 100 Ед/мл), необходимо разбавить дополнительно и повторить анализ, учтя коэффициент добавочного разведения. Для определения в ЭДТА-плазме крови уровня Ти М2-РК используется иммуноферментный метод на основе тест-системы Schebo Biotech» Ти М2-РК (Швеция), который выявляет димерную форму опухолеассоциирован-ной пируваткиназы. Метод представляет собой высокочувствительный
ELISA метод, основанный на использовании двух моноклональных антител (МКАТ), специфичных для антигена Ти М2-РК и не реагирующих пе-рекресно с другими изоформами пируваткиназы (типов L, R, МІ). На первом этапе исследуемый в плазме антиген Ти М2-РК связывается со специфическими МКАТ, иммобилизованными на поверхности полистиролового микропланшета. Вторым этапом реакции добавленные биотинилированные МКАТ против Ти М2-РК («вторые» антитела) связываются с комплексом антиген-антитело. Затем добавляется стрептавидин (который связывается с биотином комплекса), конъюгированный с пероксидазой хрена ПХ. Последний этап реакции - добавление хромогенного субстрата (3,3 5,5 тетраметилбензидин (ТМВ), разрушение которого катализируется ферментом ПХ, входящим в состав иммобилизованного на поверхности плашки комплекса. В результате образуется окрашенный в голубой цвет продукт окисленного субстрата. Реакцию останавливали раствором 0,5М серной кислотыы, цвет продукта становится желтым. Концентрацию оксида пе-роксидазы, которая была прямо пропорциональна количеству антигена Ти М2-РК определяли фотометрически с использованием Ридера фирмы «Labsystem» (Финляндия) с длиной волны 450 и 620 нм. Концентрацию антигена Ти М2-РК в исследуемых образцах определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартам с известными концентрациями Ти М2-РК. Концентрацию Ти М2-РК в плазме рассчитывали в соответствии с фактором разведения ЭДТА плазмы (1:100).
Сравнение диагностической чувствительности UBC и цитологического исследования клеточного осадка мочи у больных раком мочевого пузыря
Для дальнейшего суждения о диагностической ценности UBC мы сравнили чувствительность выявления рака мочевого пузыря с помощью UBC-теста и цитологического исследования клеточного осадка мочи, которое считают одним из «золотыхстандартов» среди неинвазивных методов диагностики. Результаты UBC-теста, превышающие дискриминационный уровень, расценивали как положительные, а отрицательные - когда он был ниже верхней границы нормы. Цитологическое исследование клеточного осадка мочи проводили в лаборатории цитологии МНИОИ им.П.А.Герцена под руководством Н.Н.Волченко. За положительное цитологичекое заключение принимали обнаружение клеток рака мочевого пузыря, а за отрицательное - нормальную цитограмму и цитограмму воспаления; мазок считался неинформативным при недостаточном количестве клеток или их лизисе. В анализ вошли данные 39 больных с гистологически подтвержденным раком мочевого пузыря - 19 первичным и 20 - с рецидивами (Рис.8). Среди всех больных раком мочевого пузыря оба теста дали положительные результаты в 41,0% случаев (16 из 39); в 36,0% случаев (14 из 39) UBC был положительным, в то время как цитологическое исследование клеточного осадка мочи дало отрицательный результат (из них в 7,7% отрицательное цитологическое заключение было связано с неинформативностью мазка, а в остальных случаях отмечались выраженные воспалительные изменения слизистой). В 20,5% (8 случаев из 39) и UBC, и цитологическое исследование дали отрицательные значения (из них истинно цитологически отрицательными были 12,8%, а в оставшихся 7,7% отрицательное цитологическое заключение также было связано с неинформативностью мазка); 2,5% составляли случаи, когда UBC-тест был отрицательным, а цитологическое исследование клеточного осадка мочи имело положительное значение. В целом, 15,4% из 56,5% (когда цитологическое исследование давало отрицательный результат) мазков были расценены как неинформативные при цитологическом анализе. Данные о распределении случаев были близкими как для больных первичным раком мочевого пузыря, так и пациентов с рецидивами. Таким образом, чувствительность UBC для уточняющей диагностики рака мочевого пузыря превосходит чувствительность цитологического исследования клеточного осадка мочи на 33,5%.
Важным в плане практического использования UBC является экспериментальное подтверждение тезиса о целесообразности его использования для мониторинга эффективности лечения и доклинического выявления рецидивов. В настоящее время нами в динамике наблюдаются 29 пациентов раком мочевого пузыря, но лишь у части из них исследование уровня маркера проведено с нужной периодичностью (не превышающей 2-3 месяцев). Тем не менее, данные, проанализированные в отношении этих больных, позволяют сделать несколько заключений.
На первом этапе мы проанализировали динамику UBC после ТУР у 21 больных раком мочевого пузыря (табл.5). По результатам лечения больные были разделены на 2 группы - а) у которых в результате лечения достигнута ремиссия (до 8 месяцев); б) у которых в сроки 1-3 месяца после ТУР установлен продолженный рост опухоли.
В группе больных, у которых оперативное лечение привело к ремиссии, лишь у 1 больного наблюдался несколько превышающий норму (7,5х10"4 мкг/мкмоль CREA) уровень UBC, в ранние сроки (1-2 месяца) после ТУР (что может быть связано с неполным стиханием цистита после оперативного вмешательства). Средний же уровень маркера через 1-2 месяца после проведения оперативного лечения находился в пределах нормы, составляя 2,4x10 мкг/ мкмоль CREA. Но уже через 3-4 месяца после ТУР уровень UBC нормализовался у всех больных, в среднем составляя 2,2x10-4 мкг/ мкмоль CREA. Через 5-6 месяцев среднее значение UBC было равно 1,9 и наконец, через 7-8 месяцев - ОДхІО"4 мкг/ мкмоль CREA. Эти данные свидетельствуют о том, что если после ТУР достигнута ремиссия, уровень маркера с течением времени (1-7 месяцев) стремится к «0», как и у доноров.
Если же в ранние сроки после ТУР диагностируется рецидив (или продолженный рост опухоли), то уровень маркера оказывался выше нормы. Так, нами зафиксированы 4 случая, когда через 1-3 месяца после проведения ТУР у пациентов наблюдался рецидив рака мочевого пузыря. Средняя концентрация UBC в этой группе больных составила 25 10-4 мкг/ мкмоль CREA, причем у всех пациентов маркер был повышен, а у одного из обследуемых это повышение в 9 раз превышало верхнее значение нормы. Данные табл.5 позволяют сделать заключение о том, что исследование UBC целесообразно проводить через 2-3 месяца (при стихании воспалительных явлений) после ТУР, а повышенный уровень маркера в эти сроки свидетельствует о не радикальности лечения.
Сходный анализ был проведен нами относительно больных, получивших на первом этапе лечения ФДТ. Нам удалось обследовать 8 человек, UBC-мониторинг у которых после лечения проведен в течение 1-6 месяцев. Полученные данные систематизированыв таблице 6.
Хотя выборка больных, включенных в данный этап исследования, небольшая, все же можно отметить некоторые факты. Прежде всего, нормализация уровня UBC после ФДТ в случае клинической ремиссии происходит несколько позже, чем после ТУР : в первые 2 месяца у всех пациентов этой группы концентрация маркера была выше верхней границы нормы и составила в среднем 9,0x10"4 мкг/ мкмоль CREA, но в дальнейшем снижалась, и уже к 3-6 месяцу средний уровень UBC у этих больных составил 2,3x10"4 мкг/ мкмоль CREA, причем ни у одного обследуемого он не был повышен. При продолженном (после ФДТ) росте опухоли даже через 3-6 месяцев уровень маркера в среднем в 3 раза превышал норму. Таким образом, мы полагаем, что нормализация уровня UBC после проведения ФДТ происходит к 3 месяцу в случае достижения клинической ремиссии. И если в эти сроки наблюдаются повышенные значения маркера - это, как и в случаях после ТУР, свидетельствует о не радикальности лечения (продолженном росте опухоли).
