Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современный уровень знаний о раково-тестикулярных генах 11
1.1. Основные характеристики раково-тестикулярных генов 12
1.2. Раково-тестикулярные гены и их экспрессия в гематологических опухолях 17
1.3. Характеристика раково-тестикулярных генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 mPRAME 19
1.4. Опыт использования методов иммунотерапии для лечения онкогемато логических заболеваний 42
1.5. Некоторые представления о регуляции экспрессии раково-тестикулярных антигенов 43
1.6. Возможность использования раково-тестикулярных антигенов в качестве мишеней для иммунотерапии 48
1.7. Диагностическое значение экспрессии раково-тестикулярных генов при гемабластозах... 50
1.8. Заключение 50
Глава 2. Материалы и методы исследования 52
2.1. Исследованные больные 52
2.2. Клеточные линии и методика их культивирования 53
2.3. Здоровые доноры 53
2.4. Выделение геномной ДНК для определения мутации JAK2V617F 53
2.5. Системы для определения мРНК целевого гена в исследуемых образцах 54
2.6. Предварительная подготовка клеточного материала к выделению общей РНК 55
2.7. Выделение РНК 56
2.8. Получение кДНК з
2.9. Проверка специфичности работы систем 57
2.10. Проведение количественной полимеразно-цепной реакции в реальном времени 57
2.11. Обработка экспериментальных данных 58
2.12. Проверка воспроизводимости результата 58
2.13. Методы статистического анализа полученных данных 59
Глава 3. Результаты 60
3.1. Активность раково-тестикулярных генов HAGE и SLLP1 в клетках крови здоровых доноров 60
3.2. Экспрессия раково-тестикулярных генов в клетках крови у больных в дебюте ХМЛ и Ph -негативных хМПЗ 60
3.3. Экспрессия раково-тестикулярных генов в крови и костном мозге больных хроническим миелоидным лейкозом, получающих терапию Иматинибом 61
3.4. Экспрессия раково-тестикулярных генов у больных острым промиелоцитарным лейкозом... 62
3.5. Экспрессия раково-тестикулярных генов у больных с диагнозом диффузная В-крупноклеточная лимфома 65
3.6. Экспрессия раково-тестикулярных генов у больных с диагнозом лимфома Ходжкина 66
3.7. Экспрессия раково-тестикулярных генов у больных с диагнозом фолликулярная лимфома... 68
3.8. Экспрессия раково-тестикулярных генов в клетках линий К562 и WI38 69
3.9. Экспрессия раково-тестикулярных генов в клеточных линиях меланомы 69
Глава 4. Обсуждение 71
4.1. Экспрессия раково-тестикулярных генов HAGE и SLLP1 у здоровых доноров 71
4.2. Профиль экспрессии раково-тестикулярных генов GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD, SCP1, SLLP1,SEMG1,SPANXA1,SSX1 и PRAME у больных ХМЛ и хМПЗ 71
4.3. Значение величины уровня экспрессии генов PRAME и PML/RARa в дебюте острого промиелоцитарного лейкоза 74
4.4. Прогностическая значимось уровня экспрессии гена HAGE в дебюте диффузной В-крупноклеточной лимфомы 77
4.5. Результат исследования профиля экспрессии раково-тестикулярных генов в у больных с диагнозом лимфома Ходжкина 77
4.6. Влияние уровня экспрессии гена PRAME у больных фолликулярной лимфомой 77
4.7. Особенности активности раково-тестикулярных генов в клеточных линиях К562, WI-38 и семи линий меланомы 78
4.8. Заключение 81 Глава 5. Выводы 84
Список сокращений 85
Список литературы 87
Приложения 1
- Опыт использования методов иммунотерапии для лечения онкогемато логических заболеваний
- Выделение геномной ДНК для определения мутации JAK2V617F
- Экспрессия раково-тестикулярных генов в крови и костном мозге больных хроническим миелоидным лейкозом, получающих терапию Иматинибом
- Значение величины уровня экспрессии генов PRAME и PML/RARa в дебюте острого промиелоцитарного лейкоза
Опыт использования методов иммунотерапии для лечения онкогемато логических заболеваний
Исследования, начатые не так давно, показали, что при своём развитии герминогенные клетки экспрессируют большое количество генов. Многие из этих генов были открыты в качестве онко-, или протоонкогенов, которые не активны, или же экспрессируются на очень низком уровне в немалигнизированных клетках. Однако, здоровые семенные железы per se не являются раком. К тому же, герминогенные клетки, проходящие конкретные стадии своего развития при сперматогенезе, экспрессируют эти гены в течение короткого времени, меня общий профиль экспрессии от стадии к стадии. Таким образом, экспрессия раково-тестикулярных генов в герминогенных клетках является нормальным процессом, и этот процесс подчинён жёсткому контролю. Более того, некоторые временно экспрессирующиеся белки имеют очень важные функции при сперматогенезе. В частности, они отвечают за слияние гамет. Такие белки, предназначенные для взаимодействия сперматозоида с яйцеклеткой, часто экспрессируются на поверхности клеток, выделенных из опухолевого метастаза. Из этих белки могут индуцировать спонтанную выработку антител, за что получили название раково-тестикулярных антигенов. Коротко, семенники не являются раком per se, однако отличается активностью онкогенов, экспрессия которых характерна только для малигнизированных клеток. [38-40].
Ниже приведена компиляция некоторых результатов последних исследований, касающихся роли раково-тестикулярных антигенов в сперматогенезе и канцерогенезе. Сбор базовых знаний об этой группе генов способствует не только пониманию процессов, происходящих при сперматогенезе, но и позволит быстрее развить подходы иммунотерапии рака, разработанные на основе раково-тестикулярных антигенов. Впервые термин «раково-тестикулярный антиген», или РТА, был упомянут в 1997 году [41]. Список РТА, так же известных, как опухоль-герминогенные антигены, очень обширен, и пополняется с середины 80х годов [42-48] Специфическая экспрессия РТА происходит в опухолях, имеющих самое разнообразное гистологическое происхождение. В здоровых, не трансформированных клетках, случаи экспрессии данных генов крайне редки. Высокий уровень их активности характерен только для половых клеток (таких, как сперматогональные стволовые клетки, сперматогонии, сперматоциты, сперматиды и созревающие сперматозоиды), находящихся в семенниках (но не в клетках Сертоли и, или Лейдинга) [49-54]. Некоторые РТА экспрессируются в клетках яичников и плаценты (обычно в трофобластах). Так, в тканях плаценты экспрессируется ген NY-ESO-1, кодирующий одноимённый РТА (антиген впервые был обнаружен у больной с диагнозом рак пищевода) [55].
Важно отметить, что гены, кодирующие РТА, спонтанно активируются и экспрессируются на высоком уровне в опухолевых тканях, и они отличаются высокой иммуногенностью у больных онкологическими заболеваниями.
Огромное количество новых РТА открыто при исследовании взаимодействия тканевой жидкости с экспрессированной библиотекой кДНК человеческих семенников. [56].
Обычно РТА делят на две группы. В первой группе оказываются РТА, кодируемые генами, расположенными на Х-хромосоме. Гены из другой группы, так называемые не-Х-хромосомные антигены, располагаются на соматических хромосомах [50]. Гены из первой группы составляют более половины от общего числа генов, кодирующих РТА. Х-хромосомные гены чаще всего организованы в кластеры, содержащие мультигенные семейства, организованные в комплексы, причём описаны как прямые, так и инвертированные повторы [57]. Гены, не состоящие в группе Х-хромосомных, как правило, не имеют гомологов, и выражены единственной копией [50]. Подсчитано, что 10% генов на Х 16 хромосоме кодируют РТА. В целом, Х-хромосомные РТА экспрессируются в сперматогониях, а группа не-Х-хромосомных РТА экспрессируется в половых клетках, находящихся на поздних стадиях дифференцировки, таких, как сперматоциты.
Хотя функции большинства белков, кодируемых РТГ, остаются неизвестными, в некоторых работах показано, что эти белки участвуют в процессах клеточной дифференцировки, регуляции клеточного цикла, осуществляют контроль транскрипции, а так же задействованы в процессах апоптоза. Исследование особенностей экспрессии РТГ показало, что решающую роль в регуляции их активности играет статус метилирования ДНК. Это одинаково верно как для половых, так и для трансформированных клеток [58]. Кроме того, показано, что РТА трансформированных клеток часто подвергаются мутациям [59]. С учётом того, что экспрессия РТА вне иммунопривилегированных зон происходит в опухолевых клетках, некоторые РТА используются в качестве мишеней для иммунотерапии, что возможно благодаря их высокой иммуногенности. Наиболее изученные РТА определены как биомаркеры многих типов онкологических заболеваний, в частности рака яичников, плоскоклеточного рака шеи, рака молочной железы, лёгких, плоскоклеточного рака мочевого пузыря и остеосарком [60-66]. К сожалению, в недавно опубликованных результатах клинических испытаний показано, что специфическая иммунотерапия хотя и позволила уменьшить размер опухоли, это не привело к увеличению выживаемости по сравнению с группой плацебо [51]. Это демонстрирует высокую сложность рассматриваемой проблемы. Поскольку при любом типе рака часто наблюдается экспрессия нескольких РТГ, эффективная вакцина может работать сразу против нескольких типов РТА на поверхности одной опухолевой клетки. В обзоре литературы освещен современный уровень знаний о роли наиболее изученных РТА в процессах онкогенеза.
Выделение геномной ДНК для определения мутации JAK2V617F
Системы специфических праймеров и зондов для определения уровня экспрессии раково-тестикулярных генов SP17, GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME, генов АЫ, JACK2V617F, BCR-ABL и изотипов гена PML-RARa были разработаны на основе данных о последовательностях генов, предоставленных ресурсом http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (таб. 2). Анализ нуклеотидных последовательностей проводился в программе Vector NTI Advance 10 (Invitrogen, США). При составлении олигонуклеотдиных последовательностей были учтены длины интронных участков. Праймеры подобраны таким образом, чтобы они могли гибридизоваться на концевых участках соседних экзонов. Последовательность каждого флуоресцентного зонда была разработана так, чтобы срабатывание флуоресцентной метки происходило исключительно после связывания зонда по принципу комплиментарности с последовательностью кДНК. Праймеры и флуоресцентные зонды синтезировали в компании ДНК-технология, Россия. Для флуоресцентных зондов был выбран флуорофор Hex и гаситель BHQ1.
Для создания положительного контроля проведения эксперимента кодирующая последовательность каждого из исследуемых генов была клонирована в экспрессирующий вектор pET-15b (Novagen, USA) согласно протоколу, предоставленному разработчиком. 2.6. Предварительная подготовка клеточного материала к выделению общей РНК В зависимости от вида исследуемого материала применялись различные подходы к выделению мРНК.
Периферическую кровь или костный мозг (объём 5 ml и 2 ml, соответственно), полученный от больного, или периферическую кровь здорового донора перед выделением мРНК обрабатывали гемолизирующим раствором (0,8% NH4CI) для удаления эритроцитов. Для этого кровь (или костный мозг) смешивали с гемолизирующим раствором в объёмном соотношении 1:14. Смесь инкубировалась в течение 15 мин. при температуре +4С. После этого смесь центрифугировали в течение 10 мин. при 1200 об/мин. Супернатант удаляли, а клеточный осадок ресуспендировали в 1 ml гемолизирующего раствора, затем снова центрифугировали в течение 5 мин. При 2400 об/мин. Супернатант удаляли, а выпавший осадок был готов к выделению общей РНК.
Лимфатические узлы, полученные от больных, переносились на предметное стекло и измельчали скальпелем. После измельчения образец лимфатические узлы были готовы к выделению из них РНК.
Клетки, инкубируемые в виде суспензионной культуры, центрифугировались в течение 5 мин. при 1200 об/мин. Супернатант удаляли, а клеточный осадок ресуспендировали в 5 ml физиологического раствора, после чего центрифугировали в течение 5 мин. при 1200 об/мин. Супернатант удаляли, а полученный осадок был готов к выделению РНК.
Клетки, инкубируемые в виде прикреплённой культуры, освобождались от среды и снимались со стенки культурального флакона 2 ml 0,02% раствором Версена, содержащем 0,25% трипсина. Обработка клеток трипсином занимала 2 мин. при непрерывном наблюдении за состоянием культуры под бинокуляром при увеличении в 100 раз. После отделения клеток от стенки флакона к ним добавляли 10 ml 0,02% раствора Версена, после чего центрифугировали в течение 5 мин. при 1200 об/мин. Супернатант удаляли, а клеточный осадок ресуспендировали в 5 ml физиологического раствора, после чего центрифугировали в течение 5 мин. при 1200 об/мин. После удаления супернатанта полученный осадок клеток был готов к выделению РНК.
Выделение РНК из предварительно обработанных образцов производилось по протоколу, предложенному Chomczynski и Sacchi [208]. Кратко: подготовленный клеточный материал лизировали в 0,5 ml гуанидин-тиоционатного буфера (4М гуанидан-тиоционата, 25тМ цитрата Na, 0,5% N-лаурилсаркозила Na и 0,1М меркаптоэтанола). Во время лизиса материал пропускали через иглу 19G не менее 20 раз. Далее в пробирку добавляли 0,5 ml водонасыщенного фенола (рН 5,2), и 0,125 ml раствора ацетата Na (рН 4,2), встряхивали, и добавляли 0,25 ml хлороформа. Полученную смесь встряхивали до молочно-белого цвета и центрифугировали в течение 10 мин. при 1200 об/мин при охлаждении до +4С. После центрифугирования отбирали 0,5 ml верхней водной фазы, содержащей клеточную РНК, и смешивали с 0,5 ml изопропанола. Инкубация РНК в изопропаноле проводилась в течение 20 часов при температуре -20С. После инкубации РНК осаждали центрифугированием в течение 10 мин. при 12000 об/мин., удаляли супернатант, и дважды промывали в 80% этаноле. После промывок осадок РНК высушивали в термостате, растворяли в деионизованной воде, и измеряли концентрацию раствора.
Матричная РНК, выделенная на предыдущем этапе, использовалась для синтеза кДНК с использованием ревертазы. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием фермента RevertAid Reverse и набора реактивов (Fermentas, США) в условиях, предложенных фирмой-производителем. Для отжига использовали смесь случайных шестичленных праймеров (Синтол, Россия). В качестве отрицательного контроля использовали рабочую смесь без добавления РНК, пробу доводили до конечного объема деионизованной водой.
Если транскрипция генома и обратная транскрипция мРНК прошли безошибочно, то полученная кДНК представляет собой непрерывную последовательность гена, лишённую интронов. Теоретически, системы для проведения количественной ПЦР могут сработать и на геномной ДНК, содержащей интроны. Данная особенность потребовала проведения серии экспериментов, в которых вместо кДНК использовались пробы очищенной геномной ДНК и выделенной тотальной РНК. В результате были найдены условия, в которых не происходило неспецифического срабатывания систем праймеров и зондов. Оптимальные условия постановки реакции количесвтенной ПНР в реальном времени изложены в следующем разделе.
Экспрессия раково-тестикулярных генов в крови и костном мозге больных хроническим миелоидным лейкозом, получающих терапию Иматинибом
Таким образом, определение профиля экспрессии РТА проводилось в образцах 22 больных с впервые установленным диагнозом эритремия, 17 больных с диагнозом эссенциальная тромбоцитемия и 11 больных с диагнозом хронический миелоидный лейкоз (таб. 3).
У двух первичных больных с диагнозом эритремия и двух больных с диагнозом эссенциальная тромбоцитемия мы наблюдали спонтанную экспрессию ещё одного РТГ - FRAME. Поскольку эритремия и эссенциальная тромбоцитемия, согласно современным представлениям, отнесены к так называемым Ph -негативным хроническим миелопролиферативным заболеваниям (хМПЗ), в дальнейшем анализе они рассмотрены как одна группа.
У одного больного и диагнозом ХМЛ экспрессировался ген PRAME. Профили экспрессии РТГ в клетках крови у больных со впервые диагностированными хМПЗ и ХФ ХМЛ не отличаются друг от друга (р=0,199). Только у единичных представителей этих групп экспрессирутеся ген PRAME, причём на сопоставимом уровне относительно контрольного гена (р=0,001). Активность других рассматриваемых РТГ не выявлена.
Экспрессия раково-тестикулярных генов в крови и костном мозге больных хроническим миелоидным лейкозом, получающих терапию Иматинибом У одного из больных, находящихся в стадии ХФ ХМЛ и получающих специфическую терапию, в крови обнаружена экспрессия гена SPANXA1. Частота встречаемости активного гена FRAME у этих больных была приблизительно такой же, как у нелеченных (р=0,346).
В крови больных, находящихся в стадиях ФА и БК ХМЛ, экспрессируется больше генов, чем при ХФ (достоверность отличий р=0,032 и р=0,048, соответственно). В частности, при ФА, кроме экспрессии SPANXA1 и PRAME, наблюдалась активность генов GAGE1, MAGEA1, SEMG1 и SSX1. При БК экспедировались гены GAGE1, SEMG1, SSX1 и PRAME.
При рассмотрении результатов исследования крови пациентов, получающих лечение, отмечено увеличение уровня экспрессии FRAME в БК относительно стадий ХФ (р=0,001) и ФА (р=0,048) (таб. 4).
В костном мозге исследованных больных в дебюте заболевания ХМЛ не обнаружено экспрессии каких-либо из исследованных генов. Однако у леченных больных стадии ХФ ХМЛ в костном мозге в единичных случаях экспрессируются гены NY-ESO-1 и SCP1, в ФА экспрессировались гены SEMG и SSX1,HBBK-GAGE1.
Только один ген экспрессировался клетках костного мозга леченных больных с диагнозом ХФ, ФА и БК ХМЛ - FRAME. Наблюдаемые значения уровня экспрессии у больных в стадии БК были выше, чем при ХФ (р=0,06) и при ФА (р=0,026) (таб. 5).
В костном мозге у каждого из 30 пациентов, ещё не получивших специфического лечения ОПЛ, были обнаружены транскрипты химерного гена PML/RARa и мРНК гена PRAME. Изотип bcrl химерного гена был обнаружен у 16 пациентов (53% от общего числа пациентов), с медианным уровнем экспрессии относительно гена ABL 353% (разброс значений был от 230% до 985%). У остальных 14 (46%) первичных пациентов был выявлен тип перестройки гена ЬсгЗ, со среднемедианным уровнем экспрессии относительно контрольного гена 107% (при разбросе значений от 12% до 482%).
У всех больных, находящихся в дебюте заболевания, в клетках костного мозга была обнаружена мРНК PRAME. Среднемедианный уровень экспрессии PRAME для больных, имеющих перестройку в точке bcrl, составил 2,9% (при наблюдаемых значениях от 0,001% до 200%). Для пациентов с перестройкой ЬсгЗ медиана уровня экспрессии гена PRAME составила 48,4% (разброс значений от 0,5% до 460%).
Ни одна проба клеток костного мозга, полученная от пациентов в дебюте заболевания, не содержала мРНК генов GAGE1, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD, SCP1, SEMG1, SPANXA1 и SSX1.
В крови здоровых доноров не было обнаружено присутствия мРНК гена PML/RARa (изоформы bcrl или ЬсгЗ).
Начиная с момента установки диагноза, в течение 18 месяцев проводилось наблюдение за больными. Установлено, что пациенты, имевшие хромосомную перестройку в точке bcrl, достигали морфологической и молекулярной ремиссии в среднем на 35-й день от начала терапии по протоколу AIDA. При экспрессии изоформы ЬсгЗ химерного гена констатация костно-мозговой и молекулярной ремиссии происходила в среднем через 40 дней с момента начала терапии.
Для каждого пациента было рассчитано соотношение уровня экспрессии генов PRAME и PML/RARa. В качестве граничного значения мы выбрали уровень соотношения равным 0,05, и разделили всех пациентов на четыре субгруппы (рисунок 2).
Мы сопоставили соотношение уровня экспрессии PRAME к PML/RARa со временем развития клинического рецидива заболевания (рисунок 3). Наибольшая частота развития рецидивов наблюдалась у пациентов, экспрессирующих изотип ЬсгЗ гена PML/RARa и значением соотношения уровня экспрессии гена PRAME к гену PML/RARa находящимся ниже 0,05. В этой группе из 6 человек у половины развился рецидив (р=0,0231). Что же касается пациентов, имеющих хромосомную перестройку в точке bcrl, то среди них наблюдался всего один случай рецидива. У этого больного из группы PML/RARa bcrl - позитивных отношение уровня экспрессии гена FRAME к химерному гену было ниже 0,05.
Было проведено тестирование уровня экспрессии FRAME и транскриптов PML/RARa для проведения мониторинга минимальной остаточной болезни при ОПЛ. Кроме 30 пациентов, рассмотренных выше, в наше исследование были включены образцы костного мозга 60 пациентов с диагнозом ОПЛ, проходящих мониторинг МОБ. Время наблюдения пациентов из этой группы составило в среднем 9 месяцев, в течение которых четверо из всей группы развили клинический рецидив. Изотип ЬсгЗ гена PML/RARa экспрессировался у пяти пациентов. У оставшихся трёх химерный ген сформировался в точке bcrl.
С момента обнаружения молекулярного рецидива до момента выявления костно-мозгового рецидива проходило в среднем 3 месяца. При выявлении экспрессии транскрипта PML/RARa констатировался молекулярный рецидив (п=8). Ни в одном из этих образцов мы не наблюдали экспрессии гена PRAME. Его мРНК появлялась в пробе костного мозг только в тот момент, когда рецидив проявлялся уже клинически. Не было зафиксировано экспрессии PRAME в PML/RARa - отрицательных пробах.
Наблюдалась динамика коэкспрессии гена PRAME и транскриптов PML/RARa. Исследования образцов, полученных при мониторинге ОПЛ, показали, что изменение соотношение количества мРНК гена PRAME и химерного PML/RARa различаются между началом заболевания и рецидивом. Все четверо больных, развившие рецидив за время нашего наблюдения, в дебюте заболевания имели показатель отношения уровней экспрессии двух генов ниже 0,05. В момент обнаружения у них костно-мозгового рецидива это соотношение менялось, и у всех четверых превысило показатель 0,05 (рисунок 4). Наблюдаемое изменение этого соотношения было вызвано повышением относительного уровня экспрессии PRAME.
Значение величины уровня экспрессии генов PRAME и PML/RARa в дебюте острого промиелоцитарного лейкоза
Согласно экспериментальным наблюдениям и статистическому расчёту, культуры клеток были можно разделить на две группы. Признаки первой группы - множественная активность РТГ в совокупности с их высокими уровнями экспрессии, характерны для линий mel IL, mel Hn, mel Ibr и mel Kor. Интересно, что Михайлова и др. определи линии mel Ibr и mel Kor как низко дифференцированные. С другой стороны, линии mel Р, mel Si и mel Mtp, по нашим данным, характеризуются в целом более низкими уровнями экспрессии РТГ и меньшей частотой их активации. Но по данным Михайлова и др. линия mel Mtp является низкодифференцированной, линия mel Р умереннодифференцированной, и линия mel Si высокодиффенецированной.
Классификация по степени дифференцировки, проведенная Михайловой и др., основана на таких признаках, как клеточная морфология и экспрессия дифференцировочных антигенов меланомы, позволила разделить линии на три группы. Другая классификация, основанная исключительно на уровнях экспрессии множества РТГ, выделяет только две группы среди этих линий.
Высокий уровень экспрессии генов оказался характерным для двух низкодифференцированных и двух умереннодифференцированных линий. В то же время более низкий уровень экспрессии РТГ выявлен у низко-, умеренно- и высокодифференцированных линий. Следует отметить, что разделение на три группы по признаку уровня экспрессии и частоты активации РТГ оказался невозможным в силу статистической недостоверности полученных результатов.
Таким образом, мы получили данные о том, что для низкодифференцированных клеток меланомы характерен как высокий, так и более низкий уровень экспрессии РТГ. При этом у высокодифференцированной линии обнаружен достоверно более низкий уровень экспрессии РТГ, чем у низкодифференцированных линий. Поскольку для человека, страдающего от меланомы, низкодифференцированные опухолевые клетки являются плохим прогностическим фактором, может иметь значение и профиль экспрессии РТГ.
Для подтверждения этого вывода требуется провести работу по определению профиля экспрессии РТГ в клеточных образцах, полученных непосредственно от больных, и не прошедших ни единой стадии культивирования.
Наши результаты открывают широкие возможности для использования транскриптов раково-тестикулярных генов SP17, GAGE1, И AGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSXl и PRAME для первичной диагностики и последующего мониторинга некоторых хронических и острых форм онкогематологических заболеваний.
Мы показали сходство на молекулярном уровне впервые выявленных случаев хронических миелопролиферативных заболеваний и хронического миелоидного лейкоза. Мы выявили молекулярные различия между хронической фазой и фазой акселерации и бластным кризом при хроническом миелоидном лейкозе. Активация экспрессии генов GAGE1, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SPANXA1, SSX1 и PRAME в хронической фазе хронического миелоидного лейкоза может быть первым предвестником трансформации заболевания в терминальную стадию.
Мы определили, что в дебюте заболевания В-клеточными лимфомами (диффузная В-крупноклеточная лимфома, лимфома Ходжкина и фолликулярная лимфома) профиль экспрессии раково-тестикулярных генов GAGE1, HAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SCP1, SEMG1, SLLP1, SPANXA1, SSX1 и PRAME очень разнообразен, и целом является практически индивидуальным для каждого больного. С другой стороны, несмотря на это разнообразие, для диффузной В-крупноклеточвной лимфомы уровень экспрессии гена И AGE в клетках костного мозга удалось установить в качестве прогностического фактора. Для фолликулярной лимфомы в качестве важного прогностического установлен высокий уровень экспрессии гена PRAME в лимфатических узлах.
Ещё никем в мире не сообщалось, что существует онкологическое заболевание, при котором с такой с частотой, близкой к 100% рассмотренных случаев, экспрессируется какой-либо представитель из группы раково-тестикулярных генов. Согласно нашим результатам всех исследованных РМ/У& а-положительных больных острым промиелоцитарным лейкозом в костном мозге экспрессируется ген PRAME. Интересно, что, несмотря на высокую агрессивность, присущую острому промиелоцитарному лейкозу, в дебюте заболевания совершенно не характерна множественная экспрессия РТГ. Это говорит о существовании некого высокоспецифичного механизма, срабатывающего при остром промиелоцитарном лецкозе, и приводящем к экспрессии РТГ PRAME.
Важно отметить, что экспрессия гена PRAME была либо очень интенсивной, сопоставимой с уровнем экспрессии изо форм гена PML/RARa, либо наблюдалась на низком уровне относительно химерного гена. Во втором случае, - при низком уровне экспрессии, у больных с высокой частотой развивался гематологический рецидив заболевания. Этого достаточно, чтобы рекомендовать определение уровня экспрессии гена FRAME у вех больных в дебюте острого промиелоцитарного лейкоза.
Мы исследовали клеточные линии, в частности, линии клеток меланомы. Показано, что множественная экспрессия РТГ больше характерна для линий, охарактеризованных ранее как низко- и умереннодифференцированные, но не высокодифференцированные. В случае высокодифференцированных линий, наблюдался существенно более низкий уровень экспрессии генов при меньшем количестве активированных генов.
Похожие диссертации на «Исследование особенностей экспрессии и распространённости раково-тестикулярных генов»
