Введение к работе
з .
1. Актуальность проблемы.
Множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток (МЛУ) -интенсивно исследуемое в данное время явление, заключающееся в невосприимчивости клеток и клеточных популяций к широкому спектру химиотерапевтических препаратов, различающихся по строению и механизму действия на клетку. МЛУ представляет собой серьезное препятствие на пути успешного лечения злокачественных новообразований. Одним из основных механизмов формирования МЛУ является активация Р-гликопротеина (Pgp) - трансмембранного белка, транспортирующего различные вещества из клетки. Цель настоящей работы - исследование регуляции Pgp и кодирующего его гена MDR1.
Активация гена MDR1 в опухолевых клетках происходит при весьма разнообразных воздействиях: под влиянием цитостатнков, агентов, вызывающих дифференцировку, стимуляторов и ингибиторов протеннкнназы С, облучения, теплового шока, различных цитокинов (Chaudhary, Roninson, 1993; Chin et al., 1990; Uchiumi et al., 1993; Bertilsson et al., 2001), а также ряда генов: p53, ras, c-raf, c-fos, c-jun, генов рецепторов ретиноевой кислоты и др. Тем не менее, пути сигнальной трансдукції», участвующие в регуляции экспрессии гена MDR1 и активности Pgp, изучены недостаточно. Исследования сигнальных путей, участвующих в регуляции пролиферации, дифференцировки и программируемой гибели клеток, являются одной из центральных задач современной биологии и медицины. Систематическое изучение их роли в регуляции гена MDRI и активности Pgp, могут открыть новые подходы к решению таких актуальных проблем как преодоление МЛУ, опосредованной Pgp и разработка новых противоопухолевых препаратов и схем химиотерапии.
К началу нашей работы в литературе отсутствовали сведения относительно возможного участия сфингомиелинового сигнального пути в регуляции гена MDR1 и Pgp. Этот путь активно изучается в последние годы, поскольку он вовлекает сфинголипиды
4 клеточной мембраны в передачу сигналов клеточной дифференцировки, пролиферации и
апоптоза. Его роль в формировании МЛУ оставалась неисследованной. Между тем,
некоторые химиопрепараты, используемые при терапии опухолей, вызывают повышение
уровня внутриклеточного церамида (Senchenkov et al., 2001) и их цитотоксический
эффект, по-видимому, вызван активацией сфингомиелинового сигнального пути. Кроме
того, в последнее время исследователи связывают роль Pgp в клетке не только с его
транспортной функцией, но также с такими процессами, как дифференцировка и апоптоз.
Поэтому исследование роли сфингомиелинового пути сигнальной трансдукции в
регуляции активности MDRl/Pgp представляет интерес не только с точки зрения
практической онкологии, но и с точки зрения понимания механизмов координированной
регуляции важнейших процессов жизнедеятельности клетки.
2. Цели и задачи исследования.
Целью данной работы явилось исследование возможного участия пути сигнальной трансдукции, вовлекающего сфинголипиды клеточной мембраны, в регуляции активности гена MDR1 и Pgp и выяснение роли этого сигнального пути в координированной регуляции активности MDRl/Pgp и одного из важнейших биологических процессов -программируемой гибели клетки, апоптоза. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
-
Выбрать модели исследования (культуры клеток) и детально охарактеризовать их с точки зрения экспрессии и функциональной активности MDRl/Pgp, а также чувствительности к химиотерапевтическим препаратам и сфинголипидам.
-
Выяснить, является ли С2-церамид, растворимый синтетический аналог внутриклеточного церамида, субстратом Pgp.
-
Выяснить, участвует ли сфингомиелиновый путь сигнальной трансдукции в регуляции активности MDRl/Pgp и определяется ли это участие клеточным контекстом.
4. Выяснить, осуществляется ли координированная регуляция гена MDRI и
апоптоза через сфингомиелиновый путь сигнальной трансдукции.
5. Изучить участие гена Raf-І, компонента сигнального пути, активируемого
сфинголипидами, в регуляции активности гена MDRI, Pgp и апоптоза в исследуемых
клетках.
3. Научная новизна и практическая значимость работы.
В работе впервые показано, что синтетический растворимый аналог внутриклеточного церамида, С2-церамнд, активирует экспрессию гена MDRI в культивируемых клетках лейкозов человека разных типов дифференцировки. Эти данные впервые свидетельствуют в пользу того, что вторичный мессенджер церамнд и, следовательно, сфингомиелиновый путь сигнальной трансдукции, вовлечены в регуляцию гена MDR1. Показано, что С2-церамнд не является субстратом Pgp. Впервые показано, что влияние С2-церамида на экспрессию гена MDRI зависит от дозы препарата, времени воздействия и от клеточного контекста. Обнаружено, что другой синтетический сфннголнпид, D-сфингозин, не вызывает активацию гена MDRI, что свидетельствует о специфичном для церамида механизме регуляции активности этого гена. Показано, что влияние химиопрепаратов (адриабластина и l-P-D-арабинознлцитозина (АраС)), активирующих сфингомиелиновый путь сигнальной трансдукции, на степень экспрессии гена MDRI зависит от типа клеток. Впервые показано, что прерывание сфингомиелинового сигнального пути введением в клетки К562 доминантно-негативного мутанта гена Raf-I (Raf-C4) отменяет как повышение экспрессии гена MDRI, вызванное С2-церамидом, так и апоптоз, вызванный обоими сфинголипидами, что свидетельствует в пользу общего начального этапа регуляции апоптоза и экспрессии гена MDRI в популяциях опухолевых клеток системы кроветворения.
Результаты проведенной работы способствуют пониманию механизмов регуляции экспрессии гена MDR1, обнаруживают механизмы связи активации этого гена с процессами апоптоза в опухолевых клетках и зависимости индуцибельности гена MDR1 от клеточного контекста. Эти результаты могут быть полезными при разработке новых методов лечения злокачественных новообразований.
4. Апробация работы.
Апробация диссертационной работы была проведена 12 сентября 2000 года на совместной научной конференции лабораторий генетики опухолевых клеток, цитогенетики, механизмов канцерогенеза и биохимии опухолей НИИ канцерогенеза РОНЦРАМН.
Основные материалы диссертационной работы были представлены на XIII Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Россия, Санкт-Петербург, 1999 г.), международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» (Россия, Санкт-Петербург, 2000 г.), и международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Россия, Санкт-Петербург, 2001 г.).
5. Публикации.
По материалам диссертации опубликованоЮработ
6. Структура н объем диссертации
Материал диссертации изложен на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение» и выводов. Работа иллюстрирована 27 рисунками и 8 таблицами. Библиографический материал включает в себя ссылки на 185 источников литературы, в том числе 11 отечественных.
