Введение к работе
Актуальность темы
Канцерогенез представляет огромный интерес для фундаментальной молекулярной биологии, поскольку причиной возникновения всех опухолевых заболеваний являются нарушения в сложных механизмах регуляции клеточной жизнедеятельности, до сих пор до конца не изученных даже в норме. Одной из актуальнейших проблем является идентификация белков, активность которых изменяется при прогрессии заболевания. Исследование таких нарушений может в будущем привести к разработке новых мишеней для направленной терапии.
В настоящее время не вызывает сомнения огромная роль онкогена Ras как в инициации, так и в прогрессии злокачественных опухолей человека. Активированный Ras может передавать сигнал на несколько сигнальных путей, участие каждого из которых в трансформации клеток и опухолевой прогрессии может быть различным. Среди таких путей наиболее известны Ras-Raf-ERK, Ras-PI3K-PDK1 и Ras-RalGEFs-Ral сигнальные каскады. До недавнего времени важнейшая роль в онко-генезе приписывалась Raf-ERK пути, однако современные исследования показали, что он играет столь большое значение в первую очередь в моделях мышиных клеток, в то время как для трансформации человеческих клеток более важным может являться путь активации малых ГТФаз Ral. Таким образом, изучение механизмов действия двух высокогомологичных белков RaLA и RalB является крайне актуальным для понимания механизмов онкогенеза у человека.
Одним из широко-используемых современных подходов к исследованию вклада отдельных сигнальных каскадов, ассоциированных с малыми ГТФазами (или G-белками) является использование эффекгорных мутантов, способных избирательно активировать определенные белки. Мутации в эффекторном домене малых ГТФаз, ответственном за взаимодействие с белками-партнерами, могут прекращать активацию того или иного эффектора. При суперэкспрессии таких генов (далее - эффекгорных мутантов), прекращается передача сигнала, опосредованного взаимодействием малого G-белка с соответствующей мишенью, что позволяет исследователям оценивать вклад белков-партнеров в исследуемые характеристики клеток.
В лаборатории регуляции вирусных и клеточных онкогенов ранее показано, что онкогенная форма Ha-Ras способна усиливать спонтанное органоспецифиче-ское метастазирование в легкие трансформированных v-src эмбриональных фиб-робластов Сирийского хомяка (клеточной линии Het-SR). Более того, при исследовании вклада эффекторных мутантов Ha-Ras, способных активировать в отдельности PI3K-, Raf- или RalGDS-ассоциированные сигнальные каскады (V12C40, V12S35 и V12G37 соответственно), показано, что именно активация последнего является основным событием, приводящим к усилению метастазирования в данной модели (Tchevkina et al., 2005).
Белки RalA и RalB высокогомологичны друг другу как по последовательности, так и по спектру белков-партнеров, основными из которых являются RalBPl, PLD и комплекс экзоциста. Активация этих мишеней может регулировать такие ключевые внутриклеточные процессы, как мембранный транспорт, передача сигнала, регуляция экспрессии генов, прохождение клеточного цикла и др. До настоящего времени не проводилось комплексной оценки вклада взаимодействия белков Ral с отдельными эффекторами в такие изменения. Таким образом, данное исследование вклада RalA и RalB в различные характеристики злокачественных клеток, а также молекулярных механизмов, с помощью которых белки Ral оказывают влияние на различные этапы опухолевой прогрессии, и, в конечном счете, на метастазирование, крайне актуально и представляют значительный научный интерес. Кроме того, вопрос о том, активация каких Ral-опосредованных сигнальных каскадов может приводить к изменению свойств злокачественных клеток остается открытым.
Цель и задачи исследования Цель данной работы - изучить влияние белков RalA и RalB на потенциально ассоциированные с метастазированием характеристики трансформированных клеток.
Для достижения цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1. Получить клеточные линии Het-SR, стабильно экспрессирующие ГТФ-
связанные формы RalA и RalB, а также их эффекторные мутанты, неспособные активировать каждый из трех наиболее хорошо изученных Ral-
ассоциированных сигнальных каскадов.
2. Изучить характеристики полученных линий in vitro:
динамику пролиферации
подвижность
способность к колониеобразованию в условиях разреженной популяции и неприкрепленного роста
способность к инвазии и движению по градиенту факторов роста.
Исследовать влияние различных форм Ral на секрецию протеаз, ответственных за ремоделирование внеклеточного матрикса, а также на внутриклеточную передачу сигнала.
Исследовать влияние различных форм белков Ral на туморогенность и спонтанную метастатическую активность клеток Het-SR.
Сопоставить результаты исследований влияния различных форм белков Ral на клетки in vivo и in vitro.
Научная новизна и практическая значимость исследования
Модель клеточных линий, полученных в данной работе, позволяет оценивать вклад двух близкородственных ГТФаз RalA и RalB, а также их основных белков партнеров в изменении характеристик трасформированных клеток не только in vitro, но и in vivo, начиная с формирования первичного очага опухолевого роста до развития метастазов в отдаленных органах. Данная модель состоит из производных v-src-трансформированных эмбриональных фибробластов сирийского хомяка. Родительская линия Het-SR является высокотуморогенной на сингенных животных, однако обладает слабым метастатическим потенциалом при подкожном введении.
Полученные в работе результаты расширяют представления о роли малых ГТФаз Ral в канцерогенезе и о Ral-опосредованных сигнальных каскадах, активация которых необходима для приобретения клетками злокачественных характеристик. Данное исследование свидетельствуют в пользу активного участия белков Ral и Ral-ассоциированных сигнальных каскадов в различных этапах прогрессии опухолей, и в том числе в метастазировании.
Работа носит в первую очередь теоретический характер, однако полученные
данные о роли данных белков в опухолевой прогрессии могут быть использованы
при дальнейшем изучении участия белков Ral как на модельных системах,
так и в клинических исследованиях. Возможно, что такие исследования приведут к открытию новых диагностических маркеров и мишеней для таргетной терапии опухолей.
Положения, выносимые на защиту
Малые ГТФазы RalA и RalB (в большей степени) стимулируют спонтанную метастатическую активность клеток. Эффекторный мутант RalA, неспособный взаимодействовать с комплексом экзоциста является наиболее активным по данному параметру. Взаимодействие RalB с PLD является критичным для стимуляции метастазирования.
Активные формы белков Ral, а также их эффеторные мутанты могут в той или иной степени влиять на деление клеток, как при стандартных методах культивирования, так и в условиях неприкрепленного роста или разреженной популяции. Они оказывают влияние на подвижность клеток, а также могут стимулировать миграцию по градиенту сыворотки и инвазию через мембраны, покрытые матригелем.
Белки Ral активно участвуют во внутриклеточной передаче сигнала, стимулируя как активацию различных сигнальных каскадов, так и экспрессию белков, потенциально ассоциированных с опухолевой прогрессией. В частности, активная форма RalA стимулирует секрецию протеазы, влияющей на ремоделирование внеклеточного матрикса uPA и экспрессию поверхностного гликопротеина CD24, а RalB снижает экспрессию белка кавеолин-1.
Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации
Все исследования проведены лично автором. В ходе исследования получены клеточные линии, стабильно экспрессирующие различные формы белков Ral. Проведен анализ спонтанной метастатической активности и туморогенносги всей панели лний на экспериментальных животных, а также изучены клеточные характеристики in vitro.
Апробация работы
Диссертация апробирована и рекомендована к защите 24 сентября 2008 года на совместной научной конференции лабораторий регуляции клеточных и вирусных онкогенов, молекулярной биологии вирусов, вирусного канцерогенеза, цитогенетики, механизмов прогрессии эпителиальных опухолей и противоопухо-
левого иммунитета НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Материалы работы докладывались на конференциях «Second International Congress on Molecular Staging of Cancer» в 2005 г. (Гейдельберг, Германия), «Методы культивирования клеток» в 2009 г. (Санкт-Петербург).
Публикации
Результаты диссертационной работы отражены в 8-ми печатных работах соискателя, в том числе 2 статьи и 3 тезиса опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата биологических наук.
Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 44 рисунка, 3 таблицы. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Список использованной литературы». Список литературы содержит 162 источника, в том числе 2 в отечественных рецензируемых изданиях.
