Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 6
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Роль пролина в работе мозга в норме и при патологии 12
Взаимосвязь пролина и ноотропов 15
Эффекты пролинсодержащих пептидов при нарушениях
памяти, ишемических повреждениях мозга и пренатальной
патологии 20
1.4. Проблемы нейродегенерации и нейропротекции при
паркинсонизме 29
Влияние ионов кальция на нейрональные структуры 31
Нейропротекция при паркинсонизме 33
1.5. Синаптонейросомы - как модель исследования в норме и при
патологии синаптических процессов 35
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 38
2.1. Выделение синаптонейросом по методу Akerman et al. (1987 г.)..40
Определение белка по методу Лоури 41
Измерение мембранного потенциала синаптонейросом 41
2.2. Эксперименты на культуре клеток
Процедура приготовления культуры клеток 42
Измерения внутриклеточных концентраций кальция 43
Измерение токов через Са -каналы 44
2.3. Создание модели экспериментального паркинсоннческого
синдрома 44
Схема введения препаратов животным 46
Оценка выраженности паркинсоннческого синдрома 46
Используемые приборы и реактивы 47
Статистическая обработка полученных результатов 48
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изменение мембранного потенциала, вызванного пролинсодержащими соединениями 49
Взаимодействие пролинсодержащих соединений с блокаторами
К -каналов 56
3.3. Пролинсодержащий активный участок нейротензина препятствует
развитию экспериментального паркинсонического синдрома 61
3.3.{.Обоснование и выбор модели для экспериментального
паркинсонического синдрома 61
3.3.2.Пролинсодержащий активный участок нейротензина препятствует
развитию экспериментального паркинсонического синдрома у
мышей линии C57BL/6 62
3.4. Влияние пролинсодержащих соединений на кальциевый
гомеостаз в культуре нейронов стриатума 71
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 83
ВЫВОДЫ 98
ЛИТЕРАТУРА 101
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АВП - аргинин-вазопрессин
АТФ - аденозинтрифосфат
АХ - ацетилхолин
БП — болезнь Паркинсона
ГАМК - гамма-аминомасляная кислота
Грам.- грамицидин
ГЭБ - гематоэнцефалический барьер
ДА - дофамин
ДА-ергический - дофаминергический
ДАГ - диацилглицерол
ИФз - инозитол 1,4,5-трифосфат
МАО-Б- моноаминоксидаза Б
МП - мембранный потенциал
МФП+ - 1-метил-4-фенилпиридиний йодид
МФТП - 1-метил~4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин
НМДА - N-MeTHJi-D-acnapTaT
НТ - нейротензин
НТ - нейротензин
ПАСК - потенциал-активируемые Са -каналы
ПК С — протеинкиназа С
ПНС - периферическая нервная система
ПС - паркинсонический синдром
[Са ],- внутриклеточные концентрации кальция
СаМ - кальмодулин
СНС - синаптонейросомы
СС- синаптосомы
ТЭА - тетраэтиламмоний
5 УРПИ - условный рефлекс пассивного избегания ФЛС - фосфолипаза С ЦНС — центральная нервная система ЦПГ - цикл о-пролил глицин ЧС - чёрная субстанция ЭС - электростимуляция ЭШ- электрический шок
Введение к работе
Проблема апоптоза - программированной клеточной смерти играет важную роль не только в нейрональном развитии (Oppenheim R.W. et al., 2001), но и в различных нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Паркинсона, Гентингтона и Альцгеймера (Stefanis et al., 1997). Несмотря на многочисленные исследования, молекулярные механизмы клеточной смерти требуют более глубокого изучения при этих нейрональных расстройствах.
Из наиболее часто встречающихся форм патологии мозга людей пожилого возраста является болезнь Паркинсона (БП), характеризующаяся повреждением и дегенерацией значительной части пула дофаминергических нигростриатных нейронов, приводящее к дефициту тормозного нейротрансмиттера дофамина (ДА) в стриатуме (Отеллин В.А., Арушанян Э.Б., 1989; Bums R.S. et al., 1983; Birkmayer W., Riederer P., 1983; Heikkila R.H. et al., 1984; Barbeau A., 1986, Hornykiewicz 0., Kish S.J., 1986; Wooten G.F., 1987; Jellinger K.A., 1994), структуры которого регулируют моторную активность и мышечный тонус.
При болезни Паркинсона используется только заместительная терапия. Например, предшественник дофамина (ДА) Ь-3,4-дигидроксифенилаланин (L-ДОФА), потому что ДА не проникает через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Длительное применение леводопа-содержащих препаратов приводит к возникновению двигательных нарушений и тяжелых побочных эффектов (дискинезий, деменций, и др.). Недостаточность данных о нейрохимических и патофизиологических механизмах, лежащих в основе дегенерации дофаминергических нигростриатных нейронов, препятствует разработке эффективной патогенетической терапии при БП. Это делает актуальным поиск химических соединений, которые бы вмешивались в процесс нейродегенерации.
В настоящее время проблема нарушения памяти становится все более актуальной по мере старения населения планеты и роста различных форм
7 патологии мозга, вызываемых травматическими, токсическими, лекарственными воздействиями, а так же при боли, стрессе, нарушении сна, алкоголизации и т.д. Нарушение когнитивных функций — распространенный симптом различных заболеваний нервной системы, прежде всего нейродегенеративных (болезнь Альцгеймера, Паркинсона и другие) - наиболее общая причина деменции у взрослых. Нарушения памяти имеют место у 65 % больных с ишемических повреждением мозговых структур (Островская Р.У., 1998).
Для терапии указанных заболеваний перспективно использование соединений, сочетающих свойства нейропротекторов и усилителей когнитивных функций. Соединениями с подобными свойствами являются ноотропы. К их числу относятся пирацетам, а также высокоэффективные пролинсодержащие пептиды, синтезированные Т.А. ГудашевоЙ и сотр. (1985-2002) в ГУ НИИ фармакологии РАМН. Ноотропы усиливают когнитивные процессы, противодействуют амнезии, вызываемой самыми разными формами патогенных воздействий: ишемией, гипоксией, нарушением холинергической передачи, электрошоком, травмой и старением (Гудашева Т.А. и др., 1985; Воронина Т.А. и Серединин СБ., 1998; Sarter М, 1991; Pizzi М„ 1993; Gouliaev А.Н. and Senning А., 1994; Островская Р.У. и др. 1999, 2001). Пролинсодержащие пептиды подобно синтетическим ноотропам обладают нейропротективным действием (Воронина Т.А., 1998; Андреева Н.А. и др., 2000; Островская Р.У., 2002).
В физиологическом и патофизиологическом плане привлекательна гипотеза о существовании собственной ноотропной системы мозга. Эндогенными лигандами которой могли быть пролинсодержащие пептиды, а экзогенными - пирацетам и другие рацетамы. В 1996 г. Т.А. Гудашева и сотр. обнаружили в мозге - циклопроли л глицин (ЦГТГ), структура и фармакологический спектр действия которого оказались сходными с таковыми,
8 как и у пирацетама. Мембранные и клеточные механизмы действия эндогенного ноотропа не были известны.
Научный интерес представляет исследование клеточных механизмов нейропротекторного и ноотропного действия пролинсодержащих эндогенных соединений и их синтетических производных, имеющих клиническую перспективу.
Цель настоящего исследования состояла в выяснении особенностей изменения мембранного потенциала синаптонейросом и ионного кальциевого гомеостаза в культуре нейронов стриатума при действии пролинсодержащих дипептидов, а также изучение нейропротекторного действия пролинсодержащего дипептида ТГС-79 на модели МФТП - индуцированного экспериментального паркинсонического синдрома.
Для осуществления поставленной цели решались следующие задачи:
Исследовать влияние пролинсодержащих неиропептидов на мембранный потенциал синаптонейросом и изучить ионную основу этих эффектов.
На модели МФТП - индуцированного экспериментального паркинсонического синдрома изучить возможное нейропротекторное действие пролил-тирозинового аналога активной последовательности нейротензина.
Измерить сдвиги внутриклеточных концентраций кальция - общего конечного пути гибели клеток, при действии пролинсодержащих дипептидов.
Научная новизна исследования определяется её основными результатами. Настоящее исследование является поисковым, и представленные в нём результаты оригинальны.
Впервые показано, что эндогенный ноотроп циклопролилглицин (ЦІJ1 ), пролин, и другие исследуемые пролинсодержащие соединения (ГВС-111 (ноопепт), ТГС-20, ТГС-79) вызывают изменения мембранного потенциала синаптонейросом (СНС). ЦПГ И ГВС-111 вызывают деполяризацию и
9 гиперполяризацию мембраны СНС. Оба ответа подавляются блокаторами калиевых каналов, обуславливая участие ионов К+ в генерации обнаруженных сдвигов мембранного потенциала СНС.
Впервые показано нейропротекторное действие пролин-содержащего дипептида ТГС-79 на модели МФТП-инАудированного экспериментального паркинсонического синдрома у мышей линии C57BL/6.
Впервые показано, что нейропротекторные эффекты ГВС-111 и ТГС-79 обусловлены нормализацией кальциевого гомеостаза в нейронах стриатума. Предложен вариант метода получения первичной культуры нейронов стриатума.
Теоретическое значение. Описание электрогенных свойств некоторых пролинсодержащих дипептидов наводит на мысль о существовании эндогенной ноотропной системы. Она может быть мишенью действия коротких фрагментов регуляторних пептидов - ЦПГ, пироглутаминовоЙ кислоты и экзогенных синтетических ноотропов. Нейропротекторные и мнестические эффекты пролинсодержащих ноотропов обусловлены модуляцией активности ионных каналов. Пролилтирозиновый дипептид соответствующей активной последовательности нейротензина может предотвращать развитие МФТП-индуцированного экспериментального паркинсонического синдрома у мышей. Результаты дают основание предполагать, что пролилтирозиновый дипептид вероятно вмешивается в процесс нейродегенерации при экспериментальном паркинсоническом синдроме.
Практическое значение настоящей работы состоит в том, что в ней изучены возможные механизмы действия ГВС-111 (ноопепт) на нейроны теплокровного животного, который синтезирован в ГУ НИИ фармакологии РАМН, Недавно успешно завершилась первая и частично вторая фаза клинических испытаний ноопепта, как ноотропного препарата. Выявленные в нашей работе особенности влияния ноопепта на нейрональную мембрану СНС и взаимодействия с эндогенным пролинсо держащим ноотропом, могут
10 оказаться полезными для дальнейшего совершенствования препарата. Обнаруженная нами способность активной последовательности нейротензина препятствовать развитию экспериментального паркинсонического синдрома может оказаться принципиально новым подходом для разработки нового подхода в терапии паркинсонизма, направленного на предотвращение гибели нейронов.
Основные положения, выносимые на защиту:
Впервые исследованы клеточные механизмы дипептидного ноотропа ЦПГ. Описаны сдвиги мембранного потенциала синаптонейросом, дозовая зависимость и показано участие калиевых каналов в наблюдаемых мембранных эффектах.
ГВС-111 - мощный нейропротектор вызывает качественно сходное с ЦПГ изменение мембранного потенциала синаптонейросом. Нейропротекторное действие ГВС-П1 может быть объяснено, как изменением мембранного потенциала синаптонейросом, так и блокадой входа кальция в нейроны стриатума через потенциал-управляемые кальциевые каналы.
Описаны клеточные механизмы действия пролина (амнестическое вещество и эксайтотоксин) и ТГС-20 (производное пироглутаминовой кислоты).
Показана способность пролинсодержащего активного участка нейротензина защищать нейроны от гибели и предотвращать развитие МФТП-индуцированного экспериментального паркинсонического синдрома у мышей линии C57BL/6. Защитное действие обусловлено способностью ТГС-79 предотвращать кальциевую перегрузку. Данные с ТГС-79 являются экспериментальным обоснованием принципиально нового подхода для терапии паркинсонизма.
Апробация работы.
Основные результаты проведенных исследований были доложены на:
2-ом Российском конгрессе по патофизиологии "Экспериментальные и клинические аспекты" (Москва, 2000); 4-ой конференции Чешского нейронаучного общества с международным участием (Прага, Чехия, 2001); совместном митинге физиологического общества Великобритании с физиологическим обществом Италии, Университет Ливерпуля (Ливерпуль, Великобритания, 2002); 2-ом съезде Российского научного общества фармакологов "Фундаментальные проблемы фармакологии" (Москва, 2003); 3-м конгрессе федерации европейских физиологических обществ (Ницца, Франция, 2003).
