Введение к работе
Актуальность проблемы. Эндотоксиновый шок является ведущей причиной смертности при грамотрицательном сепсисе, в патогенезе которого ключевая роль принадлежит эндотоксинам [Rietschel et al, 1994] В США [Angus et al, 2001] и в странах Европы [Riederman et al, 2003] ежегодно более чем у 500000 пациентов развивается сепсис, причём количество подтвержденных случаев растет на -1,5% в год, несмотря на многолетние исследования, направленные на поиск подходов к лечению Летальность при сепсисе (даже в условиях комплексной терапии) варьирует в пределах от 20% до 40%, а в случае развития инфекционно-токсического шока может достигать 40-80% [Bone, 1991, Martin et al, 2003]
Попадая в кровоток, эндотоксины (несекретируемые липополисахариды (LPS)) взаимодействуют с миелоидными клетками - нейтрофилами и моноцитами, играющими важную роль в патогенезе сепсиса Установлено, что в патогенезе сепсиса ключевую роль играет активация этих клеток [Ulmer et al, 2002, Weigand et al, 2004] и увеличение их числа Активация клеток-мишеней эндотоксинами вызывает синтез провоспалительных цитокинов, обладающих ауто- и паракринным действием Высвободившиеся циркулирующие свободные цитокины активируют клетки различных тканей и органов, индуцируя метаболические, гормональные и нейроэндокринные изменения в организме, что в конечном итоге приводит к развитию эндотоксинового шока [Rietschel et al, 1996]
Результаты исследования механизмов действия эндотоксинов нашли отражение в развитии терапии бактериальных инфекций, начиная с применения сорбентов и заканчивая вмешательством в механизмы нарушения гемостаза Современная терапия включает ингибирование синтеза простагландинов, блокирование медиаторов воспаления, использование кортикостероидов и ингибиторов коагуляции [Пак, 2003] Следует, однако, отметить, что большинство клинических приемов, направленных на блокаду специфических провоспалительных медиаторов, а также использование растворимых рецепторов для связывания цитокинов, оказались безуспешными [Riedermann et al, 2003, Van Amersfoort et al, 2003]
Поскольку клетки врожденного иммунитета в ответ на эндотоксины экспрессируют специфические для них рецепторы, в настоящее время пытаются для лечения эндотоксинового шока использовать вещества, способные конкурировать с
эндотоксинами за рецепторы к ним В связи с этим в данной работе в качестве антагониста эндотоксинов использовался липополисахарид из Rhodobacter capsulatus PG (LPSffl,C4w) Ранее для LPS из Rhodobacter capsulatus BIO была показана способность защитного действия от некоторых эффектов эндотоксинов на мышах линии С57/В16 - от ингибирующего действия эндотоксинов на ферментативную активность, связанную с системой цитохрома Р450, и на нейтрофилах человека - по подавлению Са+2-ответа, индуцируемого различными эндотоксинами [Грачев и др , 1998, Асташкин и др , 1999]
Помимо воздействия на функциональную активность фагоцитов крови, эндотоксины изменяют регуляцию апоптоза этих клеток Эндотоксины увеличивают время жизни нейтрофилов, ингибируя их апоптоз, и нарушают процесс клиренса этих клеток из тканей, что приводит к усилению повреждения тканей при воспалении [Keel et al, 1997, Jimenez et al, 1997, Sheth et al, 2001, Marshall et al, 2007] В настоящее время направленная регуляция апоптоза нейтрофилов рассматривается как возможный терапевтический подход для коррекции рада заболеваний, в том числе сепсиса [Oberholzer et al, 2001, Perl et al, 2006], однако число работ, посвященных направленной модуляции апоптоза нейтрофилов при сепсисе, невелико [Oberholzer et al, 2001]
В литературе описаны различные механизмы активации апоптоза нейтрофилов Установлено, что ключевая роль в его активации принадлежит суперсемейству TNF-альфа рецепторов, в том числе и Fas-рецептору [Маянский и др , 2000, Наши et al, 2005] Выявлено, что индукция апоптоза нейтрофилов под действием Fas-лиганда снижает экстравазацию нейтрофилов и повреждение тканей при воспалении [Suzuki et al, 2006] Тримеризация Fas-рецептора, помимо действия Fas-лиганда и анти-Fas моноклональных антител (анти-Fas AT), может быть вызвана действием ультрафиолетового излучения диапазона С (УФС) [Rehemtulla et al, 1997], являющегося индуктором апоптоза в некоторых типах клеток [Martin et al, 1995, Новожилова и др , 1996, Li et al, 2002, Takasawa et al, 2005]
Работы по исследованию действия эндотоксинов на апоптоз нейтрофилов проводятся в основном с использованием липополисахаридов S-хемотипа, характерного для большинства клинических изолятов Е coh [Hemnchs et al, 1998] И хотя известно, что структура эндотоксинов влияет на патогенетические механизмы сепсиса, влияние олигосахаридов кора и полисахаридной составляющей (О-антигена)
з
липополисахаридов на развитие патологических процессов, вызываемых
эндотоксинами, изучено значительно меньше [Feist et al, 1989, Lentschat et al, 1999,
Loppnow et al, 1989] по сравнению с эффектами, обусловленными липидом А
[Muller-Loennies et al, 1998] Число работ, посвященных выяснению влияния
хемотипа эндотоксинов на активацию нейтрофилов, невелико Отсутствуют работы,
касающиеся изучения влияния хемотипа эндотоксинов на апоптоз нейтрофилов
Все вышеизложенное обусловило необходимость проведения экспериментов, направленных на выявление возможного модулирующего действия липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG и ультрафиолетового излучения на функционирование фагоцитов крови человека при действии эндотоксинов разной структуры Полученные новые данные позволят расширить понимание закономерностей и особенностей функционирования миелоидных клеток при действии липополисахаридов разной структуры и разработать подходы для направленной коррекции функционального состояния клеток врожденного иммунитета периферической крови, вызванного действием эндотоксинов
Цель и задачи диссертационного исследования. Цель данной работы заключалась в исследовании механизмов действия липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG на функциональные ответы и апоптоз фагоцитов крови человека при действии эндотоксинов
Задачи исследования
1 Исследовать действие LPS Rhodobacter capsulatus PG на функциональные ответы
миелоидных клеток при действии эндотоксинов, в том числе на
адгезионные свойства нейтрофилов,
генерацию активных форм кислорода нейтрофилами и моноцитами,
поглощение нейтрофилами объектов фагоцитоза.
Исследовать влияние LPS Rhodobacter capsulatus PG на регуляцию апоптоза фагоцитов при действии эндотоксинов
Исследовать защитное действие LPS Rhodobacter capsulatus PG от эффектов, вызываемых разными хемотипами эндотоксинов
Исследовать взаимодействие LPS разной структуры с рецепторами миелоидных клеток, входящими в рецепторный комплекс эндотоксинов
5 Исследовать влияние Fas- и ультрафиолет С-опосредованного апоптоза на
клеточный ответ нейтрофилов при действии эндотоксинов
Научная новизна исследования Значительная часть результатов,
приведенных в данной работе, носит приоритетный характер В работе впервые проведено систематическое исследование действия лшгополисахарида Rhodobacter capsulatus PG (LPSrj, caps) на функциональные ответы миелоидных клеток периферической крови человека при действии эндотоксинов разной структуры Показано, что LPS^,.^ снижает адгезию нейтрофилов, индуцированную эндотоксинами, по механизму подавления экспрессии рУинтегринов нейтрофилов
В проведенных экспериментах установлена способность LPS^^^ снижать эндотоксин-индуцируемое ингибирование апоптоза нейтрофилов
Показано, что при действии LPSRbCaps происходит подавление продукции активных форм кислорода (АФК) нейтрофилами и моноцитами, индуцированное эндотоксинами WSRbcaps ингибирует эндотоксин-индуцированное увеличение фагоцитоза нейтрофилами различных объектов фагоцитоза При этом у нейтрофилов, не активированных эндотоксином, не происходит увеличения фагоцитарной активности
Обнаружено, что время защиты функциональных ответов нейтрофилов липополисахаридом Rhodobacter capsulatus PG реализуется в интервале 2-5 мин Установлено, что липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG (в диапазоне концентраций от 10 нг/мл до 1000 нг/мл) в отсутствии эндотоксинов не вызывает изменения экспрессии мембранных рецепторов, участвующих в эндотоксин-индуцируемой активации этих клеток
Проведено сравнительное исследование действия разных хемотипов эндотоксина Е coh (S-, Ra-, Re- и Re-) на продукцию АФК и апоптоз нейтрофилов Показано, что возрастание величины продукции АФК нейтрофилами в ряду хемотипов (S-LPS > Ra-LPS > Rc-LPS > Re-LPS) зависит от длины полисахаридной цепи эндотоксина и максимально для S- хемотипа исследованных эндотоксинов С уменьшением длины полисахаридной цепи наблюдается увеличение ингибирования апоптоза нейтрофилов под действием исследованных эндотоксинов Показано, что липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG одинаково снижает активацию нейтрофилов при действии эндотоксинов независимо от их хемотипа
Исследование механизмов действия LPSRt,caps на фагоциты крови при их активации эндотоксинами показало, что защитные эффекты липополисахарида
Rhodobacter capsulatus PG связаны с его способностью конкурировать с
эндотоксинами за специфические клеточные рецепторы
При сравнительном изучении эффективности задержки эндотоксин-индуцированного ингибирования апоптоза нейтрофилов при действии индукторов апоптоза (УФС и анти-Fas AT) установлена большая эффективность ультрафиолетового излучения
Практическая значимость работы
Результаты работы указывают на то, что липополисахарид из Rhodobacter capsulatus PG не только не активирует фагоциты крови человека в широком диапазоне исследованных концентраций, но и проявляет свойства антагониста эндотоксинов различных хемотипов, блокируя связывание эндотоксинов со специфическими рецепторами исследованных клеток-мишеней
Оценка функциональной активности клеток врожденного иммунитета использованным в работе комплексом методов может быть применена для рекомендаций по выбору восстановительной терапии сепсиса.
LPSja,.c<w может быть рекомендован для разработки и создания препарата для профилактики и лечения эндотоксинового шока
Полученные в результате проведенных исследований данные позволяют рекомендовать LPS^,.,^ в качестве инструмента для изучения механизмов действия антагонистов эндотоксинов, а также для тестирования потенциальных антагонистов эндотоксинов
Ультрафиолетовое излучение диапазона С снижает время жизни активированных эндотоксином нейтрофилов, активируя их апоптоз
Основные положения, выносимые на защиту:
1 Липополисахарид из Rhodobacter capsulatus PG обладает способностью
блокировать эндотоксин-индуцированные функциональные ответы фагоцитов
периферической крови человека при последующем действии эндотоксинов
2 Хемотип эндотоксина влияет на характер ингибирования апоптоза и
продукцию активных форм кислорода нейтрофилами
3 Липополисахарид из Rhodobacter capsulatus PG подавляет эндотоксин-
индуцированную задержку апоптоза миелоидных клеток человека
4 Липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG снижает эндотоксин-
индунируемую активацию миелоидных клеток по механизму взаимодействия со специфическими рецепторами эндотоксинов клеток-мишеней
5 Ультрафиолетовое излучение диапазона С более эффективно, чем анти-Fas
моноклинальные антитела, снижает зндотоксин-индуцированное ингибирование
апоптоза нейтрофилов.
Внедрение результатов в практику. Результаты проведенной работы дополняют представления о механизмах взаимодействия эндотоксинов разной структуры и их антагонистов с клетками врожденного иммунитета, а также о механизмах защиты организма на клеточном уровне Полученные результаты используются в учебном процессе при преподавании раздела о патогенезе сепсиса магистрантам Пущинского ГУ, а также при выполнении магистерских и кандидатских диссертаций Полученные результаты применяются также в отделении кардиологии Больницы Пущинского научного центра РАН при проведении терапии с использованием аутотрансфузии облученной ультрафиолетом крови
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на научно-практической конференции "Здоровье, профилактика и эндоэкологическая реабилитация Новые медицинские технологии" (Пущино, 1998), III открытой городской научной конференции молодых ученых (Пущино, 1998), конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), Международной конференции "Митохондрии, клетки и активные формы кислорода" (Пущино, 2000), конференции "Патофизиология и современная медицина" (Москва, 2000), Международном симпозиуме "Biological motility new trends in research" (Pushchino, 2001), П Всероссийском симпозиуме по кардиологии (Москва, 2001), конференции "От современной фундаментальной науки к новым наукоемким технологиям" (Пущино, 2001), XIV зимней международной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2002), 6 Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2002), конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино, 2002), 7 Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2003), Международном семинаре «Экология и здоровье, экологическая медицина Управление качеством жизни» (Москва, 2003), конференции "Инфекционные и паразитарные болезни в
современном обществе" (Москва, 2003), Международном симпозиуме «Biological motility» (Pushchmo, 2004), I Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность" (Москва, 2004), конференции «Фундаментальные науки -медицине Программа фундаментальных исследований Президиума РАН» (Москва, 2004), I Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004), Всероссийской конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино, 2005), конференции «Фундаментальные науки - медицине Программа фундаментальных исследований Президиума РАН» (Москва, 2005)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 52 научные работы, из них 29 в рецензируемых журналах
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 205 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 435 источников, из которых 23 - отечественных авторов Диссертационная работа иллюстрирована 3 таблицами и 45 рисунками
![Влияние липополисахарида Rhodobacter capsulatus на функциональные ответы фагоцитов крови и показатели сердечно-сосудистой системы при эндотоксиновом шоке [Электронный ресурс]](/i/i/4299/197898.png "Влияние липополисахарида Rhodobacter capsulatus на функциональные ответы фагоцитов крови и показатели сердечно-сосудистой системы при эндотоксиновом шоке [Электронный ресурс] Прохоренко Сергей Владимирович")
