Введение к работе
Актуальность проблемы. В организмах человека и животных постоянно протекают реакции с участием высокореакционных активированных кислородных метаболитов (АКМ О 2, ОН" и др) На образование АКМ расходуется от 5 до 10% потребляемого кислорода [Esterbauer Н, 1993] Сегодня нет единого мнения о биологической роли окислительных процессов с участием АКМ Нельзя однозначно сказать, насколько токсичны АКМ или насколько они необходимы при развитии типовых патологических процессов Исследования, проведенные на животных-нокаутах, показывают, что ключевые элементы продукции АКМ и антиоксидантной защиты в своем большинстве не являются критическими для жизнедеятельности организма Мыши, нокаутированные по каталазе, Cu,Zn- и эксграцеллюлярной супероксидцисмутазе, глутатионпероксидазе 1, металлотионеинам 1 и 2, фактору транскрипции NrG рождаются и развиваются нормально, однако генетические нарушения продукции АКМ и элементов антиоксидантной защиты проявляются с возрастом, а также при различных воздействиях, таких как гипероксия, ионизирующая радиация, введение параквата или Н2О2
В настоящее время большинство исследователей считают АКМ важными регуляторами клеточных процессов и ключевым элементом изменения программ дифференциров-ки, пролиферации и апоптоза клеток [Турпаев КТ 2002, Linnane AW et al, 2006] Так как развитие типовых патологических процессов в той или иной степени связано с изменением клеточных программ, то ясно, что течение многих заболеваний и патологических процессов определяется балансом прооксидантов и антиоксидантов Однако в большинстве случаев неизвестно, каков механизм регуляторного действия АКМ - воздействие ли это на мембраны, киназы, редокс-чувствительные факторы транскрипции или другие клеточные элементы Таким образом, участие одних и тех же молекул в повреждении клеток и тканей, в их защите от агрессии микроорганизмов, а также в процессах внутриклеточной и межорганной регуляции заставило исследователей по-новому взглянуть на биологическую роль АКМ в патофизиологических процессах [Surh У J et al, 2005] Это делает актуальным изучение молекулярно-клеточных механизмов генерации АКМ, их биологическую роль и возможности антиоксидантной терапии при типовых патологических процессах, среди которых одним из важнейших является воспаление
Цель исследования: изучить молекулярно-клеточные механизмы развития окислительного стресса при патологических процессах воспалительной природы и возможности коррекции его деструктивных эффектов антиоксидантами
Задачи исследования
Разработать комплекс био- и хемилюминесцентных методов оценки параметров окислительного стресса m vitro на клеточных культурах и m vivo в организмах человека и животных
В условиях, моделирующих состояния фагоцитирующих клеток в организме, изучить особенности их окислительного метаболизма при ишемии и реперфузии, а также трансформации в "пенистые" клетки
На модели трансформации перитонеальных макрофагов в "пенистые" клетки при инкубации с модифицированными липопротеинами низкой плотности изучить изменение основных механизмов генерации АКМ
В экспериментальных системах исследовать антиокислительные и защитные свойства новых водорастворимых фенольньгх антиоксидантов, синтезированных на основе бромзамещенных алкилфенолов
Исследовать возможность регуляции воспалительного процесса с помощью водорастворимых фенольных антиоксидантов с бифункциональным действием
3 |
/~ л ,
Исследовать изменение показателей хемилюминесцентного ответа гранулоцитов в динамике экспериментальных типовых патологических процессов у животных (зимозан-индуцированное воспаление, гипероксия, развитие перевиваемой опухоли)
С помощью комплекса био- и хемилюминесцентных методов изучить проокси-дантные и антиоксидантные параметры окислительного стресса у людей с хроническими воспалительными заболеваниями разного этиопатогенеза
Научная новизна Разработаны теоретические модели активации кислорода в реакциях с металлопротеинами, а также монооксигеназных реакциях с цитохромами Р450
Впервые показано, что продукция гипогалогенитов не зависит от содержания кислорода в культуральной среде и сохраняется даже при концентрациях 02 меньше 5 мкМ Макрофаг-активирующий фактор, полученный из митоген-стимулированных лимфоцитов, снижал продукцию супероксидного радикала, и одновременно усиливал образование других форм АКМ, вызывающих ХЛ люминола. Трансформация макрофагов в "пенистые клетки" при культивировании с модифицированными ЛНП сопровождается снижением спонтанной ХЛ с люцигенином, отражающей внутриклеточную продукцию О J митохондриями, интенсивность зимозан-усиленной ХЛ не изменялась, что указывает на сохранение функциональной активности NADPH-оксидазы
Впервые установлено, что изменение ХЛ ответа гранулоцитов крови отражает развитие воспалительного процесса мононуклеарного типа (зимозан-индуцированное воспаление у экспериментальных животных), при экссудативном поражении легких в условиях гипероксии ХЛ ответ не изменялся Выявлено 2 альтернативных механизма изменения суммарной метаболической активности гранулоцитов периферической крови либо за счет изменения количества циркулирующих клеток, либо за счет их кондиционирования, показано, что процессы кондиционирования являются доминирующими и регулируются моно-нуклеарньши фагоцитами Исследование ферментативных механизмов продукции АКМ у преждевременно стареющих крыс с повышенным радикалообразованием (линия OXYS) выявило повышенный уровень продукции О 2 и Н2О2 гранулоцитами крови и сниженный уровень синтеза О, в митохондриях по сравнению с животными исходной линии Вистар Крысы линии OXYS обладали повышенной устойчивостью к высотной гипоксии, однако развитие локального воспаления у них было сходным с таковым у крыс линии Вистар
С помощью разработанного комплекса хемилюминесцентных методов проведен анализ радикальных окислительных процессов и ингибирующих их систем при хронических заболеваниях воспалительной этиологии (ХНЗЛ, ИБС, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки), показано, что степень тяжести патологического процесса сопряжена с выраженностью окислительного стресса У больных ХНЗЛ и язвенной болезнью преобладание прооксидантного компонента определяется главным образом за счет прими-рования гранулоцитов крови и снижения антиокислительной активности сыворотки, в то время как у больных ИБС - в большей степени за счет существенного повышения процессов "ПОЛ сыворотки Использование разнонаправленных тестовых нагрузок, антиокси-дантных (внутримышечные инъекции витамина Е) и прооксидантных (аутотрансфузия УФ-облученной крови), в целом приводила к сходному результату - снижению окислительного потенциала полиморфноядерных лейкоцитов крови
8 разных экспериментальных системах in vitro и m vivo впервые исследованы ан
тиоксидантные и противовоспалительные свойства новых водорастворимых фенольных
соединений комбинированного действия, синтезированных на основе бромзамещенных
алкилфенолов, показана высокая противовоспалительная активность и регуляторное дей
ствие частично экранированного фенола с тиосульфонатной группой в пара-положении, a
также возможность угнетения воспалительного процесса посредством воздействия на экс-
прессию генов, контролируемых антиоксидант-респонсивным элементом
Научно-практическая значимость. Разработан комплекс методов оценки параметров окислительного стресса, включающий в себя определение а) активности метаболического "взрыва" при стимуляции гранулоцитов в образцах цельной крови, б) опсониче-ской активности сыворотки крови по динамике ХЛ ответа гранулоцитов при стимуляции зимозаном, в) концентрации образующихся в сыворотке пероксильных радикалов по интенсивности спонтанной биохемилюминесценции, г) суммарной антиокислительной активности сыворотки как величины, обратной интенсивности ее НгОг-индуцированной ХЛ Показана возможность выполнения комплекса методов в микроварианте с использованием 0,1 мл крови человека или экспериментального животного
Для новых серосодержащих антиоксидантов, синтезированных на основе алкилфе-нолов, выявлена способность стимулировать экспрессию генов, кодирующих ферменты 2 фазы детокеикации ксенобиотиков, и ингибировать развитие острого воспаления, что открывает перспективы создания нового класса противовоспалительных препаратов
Показана принципиальная возможность регистрации спонтанной биохемилюминесценции с поверхности тела человека в целях клинической диагностики
Положения, выносимые на защиту:
Условия, in vitro моделирующие состояния фагоцитирующих клеток в организме (содержание кислорода, действие цитокинов, захват макрофагами модифицированных ли-попротеинов), в значительной степени определяют основные механизмы генерации АКМ и хемилюминесцентный ответ клеток в присутствии разных люминофоров и стимуляторов, исследование которых позволяет более адекватно экстраполировать и прогнозировать развитие окислительного стресса m vivo
У животных в условиях индукции типовых патологических процессов кондиционирование (примирование и деактивация) циркулирующих в крови гранулоцитов регулируются макрофагами, в результате чего воспаление мононуклеарного типа сопровождается изменением хемилюминесцентного ответа гранулоцитов, в то время как при воспалении деструктивно-экссудативного типа такие изменения не наблюдаются
С помощью комплекса био- хемилюминесцентных методов показано развитие окислительного стресса при хронических заболеваниях воспалительной этиологии (ХНЗЛ, ИБС, язвенная болезнь), что проявляется в усилении способности гранулоцитов крови к генерации АКМ, интенсификации процессов ПОЛ в сыворотке с одновременным снижением ее антиокислительной активности Степень тяжести патологического процесса сопряжена с выраженностью окислительного стресса.
Синтезированные на основе бромзамещенных алкилфенолов фенольные соединения, содержащие несколько функциональных групп, проявляют в разных экспериментальных системах m vitro и ні vivo уникальные антиоксидантные свойства, что делает их перспективными в плане разработки новых лекарственных препаратов
Синтезированные водорастворимые фенольные антиоксиданты обладают выраженным противовоспалительным действием и индуцируют экспрессию гена GSTP1, что указывает на их способность активировать антиоксидант-респонсивный элемент
Апробация работы. Результаты работы были представлены и обсуждены на Всесоюзной конференции "Био-хемилюминесценция" (Красноярск, 1983), школе-конференции молодых ученых "Актуальные вопросы патофизиологии" (Новосибирск, 1985), IV Всесоюзной конференции по патологии клетки (Москва, 1987), Всесоюзном семинаре "Гомеостатика живых и технических систем" (Иркутск, 1987), Всесоюзной конференции "Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока" (Томск, 1989), научной конференции "Проблемы донозологической гигиенической диагностики" (Ле-
нинград, 1989), Ш Всесоюзном совещании по хемилюминесценции (Рига, 1990), Всесоюзной школе-семинаре "Био-термо-хемилюминесценция" (Суздаль, 1990), Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы применения магнитных и электромагнитных полей в медицине" (Рига, 1991), Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Патогенез хронического воспаления" (Новосибирск, 1991), научно-практической конференции "Био-хемилюминесценция Практическое применение" (Москва, 1991), Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Магнитобиология и магнитотерапия в медицине (Сочи, 1991), Международном симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии (Алма-Ата, 1992), I съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992), конференции "Свободно-радикальные механизмы повреждения мозга при патологических состояниях и заболеваниях" (Москва, 1993), II съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1995), симпозиуме, посвященном 110-летию со дня рождения НН Аничкова (Санкт-Петербург, 1995), 6 Национальном1 Конгрессе по болезням органов дыхания (Новосибирск, 1996), научно-практической конференции "О создании единой региональной системы мониторинга окружающей природной среды и здоровья населения Сибири" (Новосибирск, 1996), Международной конференции "Свободнорадикальные процессы экологические, фармакологические и клинические аспекты" (Санкт-Петербург, 1999), Научной конференции "Актуальные проблемы кардиологии" (Томск, 2000), II Всероссийском симпозиуме "Хроническое воспаление" (Новосибирск, 2000), международной конференции "Митохондрии, клетки и активные формы кислорода" (Пущино, 2000), Международной конференции "Свободнорадикальные процессы и антиоксидант в развитии и функциях нервной системы от плода к старению" (Санкт-Петербург, 2001), Всероссийской конференции "Компенсаторно-приспособительные процессы фундаментальные и клинические аспекты", (Новосибирск, 2002), VI Международной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 2002), 3-й и 4-й научно-практических конференциях с международным участием "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданти и здоровье человека" (Смоленск, 2003, 2005), XV международной конференции "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" (Ялта-Гурзуф, 2007)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 130 научных работ, в том числе 29 статей в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертационных работ, 6 статей в зарубежных журналах, 5 монографий
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 10 глав, включающих обзор литературы, описание материала и методов исследования, изложение собственных результатов, обсуждение, выводов и списка цитируемой литературы 453 источника (109 отечественных и 344 зарубежных) Материалы диссертации изложены на 237 страницах машинописного текста Работа иллюстрирована 29 таблицами и 39 рисунками
